专利名称：借助将喷射方法和降压相结合使植物或动物起始材料细胞分解从而选择性提取和分离细 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过与细胞降压相结合的喷射方法使植物或动物起始材料细胞分解 从而随后选择性提取和分离所包含的内含物的方法。
背景技术：
在本文中，已知的机械细胞分解方法为通常在高压下进行的用旋转刀刃均质化的 方法，在搅拌球磨机中分解的方法，在高压下通过窄孔压碎样品或借助超声波均质器的方 法。所述机械方法的缺点为由于摩擦而作用于细胞的剪切力，在高速下为了克服所述 剪切力而产生热量并导致形成高温。这对产生的细胞提取物的组分产生有害影响。较温和的方法为细胞的物理降压。在此根据亨利定律，细胞内的悬浮气体在较高 的气压下变得丰富，并使得细胞膜通过突然的压力损失而破裂。其原因在于，溶解的气体不 能足够快速释放并在细胞内部以逐渐变大的气泡的形式涌出。因此，作用于细胞的机械负 荷增加，直至细胞破裂并释放出细胞内含物。降压方法的缺点主要在于，仅相对容易破裂的细胞可被有效分解，这就需要额外 使用非机械的分解方法，例如使用酶。这也使得分解方法在大规模应用下无利可图。根据现有技术，借助超临界流体进行提取。其中涉及超过其临界温度及其临界压 力(在纯物质的相关相图中定义)的气体或液体。其优点在于难溶物质在超临界范围内升 高的溶解度。此外，也可通过改变压力或温度控制溶解度。如WO 2008/05537A1中所述，一 个实例是借助超临界( 脱除茶叶中的咖啡因。同时，化学工业和食品工业中也建立了另 一应用，例如借助超临界(X)2或超临界丙烷提取油、姜、黑胡椒或辣椒粉。公开WO 2008/061716A1还描述了所述提取方法的进一步改进，其中不使用夹带 剂，所述夹带剂通常用于保证溶解度的进一步升高而不会进一步升高压力。EP 0941140B1中描述了借助超临界状态或接近超临界状态的二氧化碳从发酵培 养基中提取不同的产物。该专利中描述的提取基于水基悬浮液。其中并未指明同时细胞分 解和提取物质。由于超临界状态或接近超临界状态的溶剂为具有相对较好水溶性的二氧化 碳，预期获得具有高水含量的提取物。此外，选择的提取温度相对较高，因此提取的物质可 与水进行不同的水解反应。US 5，306，637描述了细胞分解的方法，其中酶解与随后的突然减压联合，由此使 得细胞破裂并有效释放出其中包含的有价值的物质。然而，使用的压力低，使得应考虑长的 饱和时间。该发明使用超临界状态或接近超临界状态的二氧化碳，其中任选添加夹带剂，例 如氧化硫、一氧化氮、过氧化氢、乙醇或其混合物，从而分解微生物细胞以及提取细胞内组 分，例如蛋白质或核酸。蛋白质或核酸的分离不基于所述物质在使用的气体中的溶解度，而 是基于所述物质从悬浮液中沉淀。在此，气体混合物的回收非常困难，因此其中描述的工艺 不能用于工业规模。
W091/01367中首先选择气体形式且具有0至100°C的临界温度的溶剂。使所述溶 剂达到接近或超过各溶剂的临界压力的压力和接近各溶剂的临界温度的温度。随后使溶剂 与细胞材料的悬浮液混合以在所列举的条件下用溶剂使细胞饱和。在下一步骤中降低压 力，导致细胞膜部分破裂并释放出细胞组分。然后将分解的细胞材料引入第二锅炉。然而， 正如根据现有技术已知，能够预料到应以这种方式使之形成溶液的释放的蛋白质和核酸 在超临界状态或接近超临界状态的溶剂中具有极低的溶解度。因此，尽管被不断改良，现有技术中存在的细胞分解方法仍然在细胞提取物中保 留了待分离物质的大量残余物。
发明内容
因此，仍然需要通过改良现有工艺从而在超临界溶剂或接近临界状态的溶剂中的 细胞提取物达到希望的难溶的细胞内有价值的物质的尽可能大的产量以及纯度，这也正是 本文即将描述的发明的任务。借助根据本发明的方法解决所述任务，其中借助将加压、喷射和降压与随后的选 择性提取和分离细胞的有价值的物质相结合从而使生物源悬浮起始材料的细胞分解，其中 使用至少一个储存容器以在其中提供生物源起始材料的悬浮液，使用至少一个另外的储存 容器以在其中提供溶剂，在细胞分解单元中制备细胞提取物，然后在提取阶段中使气体流 过细胞提取物，并在分离阶段中通过降压将负载细胞的有价值的物质的气体与细胞的有价 值的物质分离。在此，借助加压装置使生物源起始材料的悬浮液达到100至2500巴的压力， 同样借助加压装置使溶剂达到100至2500巴的压力，然后在100至2500巴的压力下在管 线中使溶剂和悬浮液汇合并混合为溶液混合物，然后在100至2500巴的压力和10至90°C 的温度下，经由至少一个喷嘴将溶液混合物喷射入具有较低压力的容器中。借助这种方法 能够实现生物源悬浮起始材料的细胞分解和细胞的有价值的物质的溶解的同时进行。通常适用的是，生物悬浮细胞材料与溶剂的溶液混合物所选择的压力越高，细胞 分解效果越好。考虑到设备成本和由于工艺技术的原因，1300至1600巴的压力范围是最有 利的。在所述方法的一个实施方案中，与生物源起始材料的悬浮液混合的溶剂选自乙 烷、乙烯、丙烷、丙烯、丁烷、丁烯、其他饱和或不饱和烃、二氧化碳、一氧化二氮、二甲基醚、 六氟化硫、R13^、R125、R32、R141b、氟利昂及其混合物。任选地，与生物源起始材料的悬浮 液混合的溶剂为非烃的超临界流体。超临界状态或接近临界状态的溶剂的特征在于水几乎 不溶于其中。任选地，喷射之前用溶剂使生物源起始材料的悬浮液饱和或过饱和。在所述方法的另一优选的实施方案中，形成悬浮液之前通过洗涤、过滤、粉碎、研 磨或筛分预处理生物源起始材料。在根据本发明的方法的另一可能的实施方案中，所述借助加压、喷射和降压的结 合使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法与另外的分解方法联合。在此，所述分解方法选 自借助高压均质器、球磨机、超声波均质器、弗氏压碎器和冲击射流装置进行细胞分解的机 械方法。或者，所述分解方法选自借助抗生素、螯合剂、离液剂、清洁剂和碱处理进行细胞分 解的化学方法。在此，细胞壁被渗透或皂化。还存在如下可能性根据本发明的方法与分解方法联合，所述分解方法选自借助酶、噬菌体或自溶进行细胞分解的生物方法。任选地，所 述方法也可选自借助冻结和解冻、热解或降压进行细胞分解的物理方法。任选地，使用的生物源悬浮起始材料由藻类组成。所述方法的另一可能的实施方案涉及待提取的细胞的有价值的物质。所述物质一 方面为类胡萝卜素类的细胞的有价值的物质，例如胡萝卜素或叶黄素。或者为应提取的细 胞的有价值的物质虾青素。此外，考虑提取包含在生物源悬浮起始材料中的脂肪类和油类 的细胞的有价值的物质。
本发明的一个实施例示于图1中并在下文详细描述。其中图1 根据本发明借助将加压、喷射和降压与随后的选择性提取和分离细胞的有 价值的物质相结合从而使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法的方法简图。
具体实施例方式图1显示了用于容纳生物源悬浮起始材料的储存容器1，以及用于容纳溶剂的另 一储存容器4。经由泵3使生物源悬浮起始材料2达到100至2500巴的压力。同样地，经 由泵6使溶剂5达到100至2500巴的压力。在此，可使生物源悬浮起始材料2和溶剂5达 到相同的压力或者压力可以不同。然后，在管线中使加压的生物源起始材料7与加压的溶 剂8汇合成溶液混合物9，所述溶液混合物同样处于100至2500巴的压力。经由压力测量 仪10控制管线压力。然后将溶液混合物9引入具有比溶液混合物低的压力的容器12，其中 经由喷嘴11引入溶液混合物，所述喷嘴将溶液混合物9喷射入容器12中。因此，溶液混合 物9的降压和喷射过程同时进行。将用于提取16的与溶液混合物9逆流流动的溶剂导入 容器12。在此，用于提取16的溶剂来自储存容器4并对应于借助使喷射方法和降压相结合 也用于细胞分解的溶剂。根据现有技术的标准条件进行提取本身。包含溶剂的提取的物质 以料流13输送至用作分离器的容器14，其中降压之后，提取的物质与溶剂分离。在此，经由 回流管15使回收的溶剂再次转移到用于容纳溶剂的储存容器4中，并从容器14中以料流 18取出提取的物质。或者，将用于提取的溶剂17导入在本情况下用作提取容器的容器14中，其中溶剂 与料流13 (在本情况下为来自容器12的细胞分解材料)逆流流动。在此，根据现有技术的 标准条件进行提取。提取时的压力与容器12中充斥的压力保持相同。在该方法变型中，需 要额外的用作分离器的容器(图1中未示出)。当在300至2500巴的压力范围、10°C至90°C的温度范围和5至90kg/kg的溶剂5 与生物源悬浮起始材料2的比例下使用(X)2作为溶剂5时，在此观察到的工艺参数是最佳 的。当在C2-C4-烃的使用下进行所述方法时，可将压力范围设置为100至2500巴的值，其 中将溶剂5与生物源悬浮起始材料2的比例限定为1至60kg/kg。既可以间歇方式也可以 连续方法进行所述方法。通过由此限定的工艺条件(其特征在于非常高的压力、低温和可能连续的工艺操 作模式)能以高浓度和以高纯度获得所希望的细胞的有价值的物质。下文通过两个实施例来区分根据本发明的方法和现有技术如W091/01367A1中描述的方法。实施例1 A.根据本发明的方法借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约13. 7重量％的油含量(以干重计)的 Ikg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的水悬浮液达到1500巴的压力，然后在压力 下与溶剂CO2混合。通过喷嘴将由此产生的溶液混合物喷射入具有300巴的较低压力的压 力容器中。通过将降压与喷射过程相结合使溶液混合物中的藻类分解并将溶液混合物微细 地(fein)喷射入压力容器中。随后在压力容器中在300巴的压力(无压力变化)下用溶 剂(X)2逆流提取包含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。提取的物质与溶剂(X)2输送至分 离器，其中在降压之后，提取的物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂CO2与生物源悬浮起 始材料的比例为90kg/kg。在这种情况下获得的产物为约0. 27kg且由油和水的乳液组成， 其中通过沉积分离含油相。由此得到所获得的油的总量为20. lg/kg藻类悬浮液。B.现有技术的方法借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约13. 7重量％的油含量(以干重计)的 Ikg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的藻类水悬浮液达到1500巴的压力，然后在 压力下与溶剂(X)2混合。通过喷嘴使由此产生的溶液混合物在容器中卸压至大气压力，但 是不进行微细地(fein)喷射。通过降压使溶液混合物中的藻类分解。然后将经分解的藻 类悬浮液输入具有300巴压力的压力容器中并在其中进行喷射。与溶液混合物逆流地提取 包含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。在该方法中，在两个先后的工艺步骤中(并非同 时)进行降压和喷射。随后，提取的物质与溶剂被输送至分离器，其中在降压之后，提取的 物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂CO2与生物源悬浮起始材料的比例为110kg/kg。在这种情况下获得的产物为约0. 20kg且由油和水的乳液组成，其中通过沉积分 离含油相。由此得到所获得的油的总量为15.8g/kg藻类悬浮液。根据实施例1获得的结果可说明通过根据本发明的方法可达到21. 4%的产物产
量升高。实施例2 A.根据本发明的方法借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约13. 7重量％的油含量(以干重计)的 Ikg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的水悬浮液达到1000巴的压力，然后在压力下 与溶剂丙烷混合。通过喷嘴将由此产生的溶液混合物喷射入具有50巴的较低压力的压力 容器中。通过将降压与喷射过程相结合使溶液混合物中的藻类分解并将溶液混合物微细地 (fein)喷射入压力容器中。随后在压力容器中在50巴的压力(无压力变化)下用溶剂丙 烷逆流提取包含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。提取的物质与溶剂输送至分离器，其 中在降压之后，提取的物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂丙烷与生物源悬浮起始材料的 比例为mcg/kg。在这种情况下获得的产物几乎由纯油组成。所获得的油的总量为22. Ig/ kg藻类悬浮液。A.现有技术的方法借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约13. 7重量％的油含量(以干重计)的 Ikg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的藻类水悬浮液达到1000巴的压力，然后在压力下与溶剂丙烷混合。通过喷嘴使由此产生的溶液混合物在容器中卸压至大气压力，但是 不进行微细地(fein)喷射。通过降压使溶液混合物中的藻类分解。然后将经分解的藻类 悬浮液输入具有50巴压力的压力容器中并在其中进行喷射。与溶液混合物逆流地提取包 含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。在该方法中，也在两个先后的工艺步骤中(并非同 时)进行降压和喷射。随后，提取的物质与溶剂被输送至分离器，其中在降压之后，提取的 物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂丙烷与生物源悬浮起始材料的比例为llkg/kg。在这种情况下获得的产物几乎由纯油组成。所获得的油的总量为18. 8g/kg藻类 悬浮液。根据实施例2获得的结果可说明通过根据本发明的方法可达到15%的产物产量升高。实施例3A.根据本发明的方法借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约3. 0重量％的虾青素含量(以干重计) 的0.9kg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的水悬浮液达到MOO巴的压力，然后在 压力下与溶剂CO2混合。通过喷嘴将由此产生的溶液混合物喷射入具有500巴的较低压力 的压力容器中。通过将降压与喷射过程相结合使溶液混合物中的藻类分解并将溶液混合物 微细地(fein)喷射入压力容器中。随后在压力容器中在500巴的压力(无压力变化)下 用溶剂(X)2逆流提取包含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。提取的物质与溶剂(X)2输送 至分离器，其中在降压之后，提取的物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂CO2与生物源悬 浮起始材料的比例为88kg/kg。在这种情况下获得的产物为约0. 29kg且由油、虾青素和水的乳液组成，其中通过 沉积分离含油相。从而，可从含油相以88. 1 %的产量，基于使用的藻类材料的总虾青素含量 计，分离虾青素。B.现有技术的方法借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约3. 0重量％的虾青素含量(以干重计) 的0. 9kg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的藻类水悬浮液达到MOO巴的压力，然 后在压力下与溶剂CO2混合。通过喷嘴使由此产生的溶液混合物在容器中卸压至大气压力， 但是不进行微细地(fein)喷射。通过降压使溶液混合物中的藻类分解。然后将经分解的 藻类悬浮液输入具有500巴压力的压力容器中并在其中进行喷射。与溶液混合物逆流地提 取包含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。在该方法中，在两个先后的工艺步骤中(并非 同时)进行降压和喷射。随后，提取的物质与溶剂被输送至分离器，其中在降压之后，提取 的物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂CO2与生物源悬浮起始材料的比例为115kg/kg。在这种情况下获得的产物为约0. 22kg且由油、虾青素和水的乳液组成，其中通过 沉积分离含油相。从而，可从含油相以72. 3%的产量，基于使用的藻类材料的总虾青素含量 计，分离虾青素。根据实施例3获得的结果可说明通过根据本发明的方法可达到21. 8%的产物产
量升高。实施例4 A.根据本发明的方法
借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约3. 0重量％的虾青素含量(以干重计) 的0.9kg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的水悬浮液达到1600巴的压力，然后在 压力下与溶剂丁烷混合。通过喷嘴将由此产生的溶液混合物喷射入具有150巴的较低压力 的压力容器中。通过将降压与喷射过程相结合使溶液混合物中的藻类分解并将溶液混合物 微细地(fein)喷射入压力容器中。随后在压力容器中在150巴的压力(无压力变化)下 用溶剂丁烷逆流提取包含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。提取的物质与溶剂丁烷输送 至分离器，其中在降压之后，提取的物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂丁烷与生物源悬 浮起始材料的比例为^g/kg。在这种情况下获得的产物为约26. Ig且由油和虾青素组成。从而，可从含油相以 92. 6%的产量，基于使用的藻类材料的总虾青素含量计，分离虾青素。B.现有技术的方法借助泵使具有181. lg/kg的固体浓度和约3. 0重量％的虾青素含量(以干重计) 的0. 9kg雨生红球藻(Hematococcus pluvialis)的藻类水悬浮液达到1600巴的压力，然后 在压力下与溶剂丁烷混合。通过喷嘴使由此产生的溶液混合物在容器中卸压至大气压力， 但是不进行微细地(fein)喷射。通过降压使溶液混合物中的藻类分解。然后将经分解的 藻类悬浮液输入具有150巴压力的压力容器中并在其中进行喷射。与溶液混合物逆流地提 取包含经分解的藻类的喷射的溶液混合物。在该方法中，也在两个先后的工艺步骤中(并 非同时)进行降压和喷射。随后，提取的物质与溶剂被输送至分离器，其中在降压之后，提 取的物质与溶剂分离。在该实施例中，溶剂丁烷与生物源悬浮起始材料的比例为llkg/kg。在这种情况下获得的产物为约22. Og且由油和虾青素组成。从而，可从含油相以 78. 4%的产量，基于使用的藻类材料的总虾青素含量计，分离虾青素。根据实施例4获得的结果可说明通过根据本发明的方法可达到18. 的产物产 量升高。由本发明产生的优点 由于作用于细胞内组分的化学和物理负荷仅很小，因此其为温和的细胞分解方法。 样品分解程度升高，直到分解难以接近的亚细胞细胞器，例如细胞核或线粒体。 细胞分解后均勻的均化程度简化了随后的提取。 无需起始材料的耗费干燥。 所希望的细胞的有价值的物质的高浓度和高纯度。附图标记列表1用于容纳生物源悬浮起始材料的储存容器2生物源悬浮起始材料3 泵4储存容器5 溶剂6 泵7加压的生物源悬浮起始材料8加压的溶剂
9溶液混合物10压力测量仪11喷射喷嘴12 容器13 料流14 容器15回流管16用于提取的溶剂17 溶剂18 料流19提取的物质
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权利要求
1.借助将加压、喷射和降压与随后的选择性提取和分离细胞的有价值的物质相结合从 而使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法，其中 使用至少一个储存容器以在其中提供生物源起始材料的悬浮液，和 使用至少一个另外的储存容器以在其中提供溶剂， 在细胞分解单元中制备细胞提取物，然后 在提取阶段中使气体流过细胞提取物，和眷在分离阶段中通过降压将负载细胞的有价值的物质的气体与细胞的有价值的物质 分离， 借助加压装置使生物源起始材料的悬浮液达到100至2500巴的压力， 借助加压装置使溶剂达到100至2500巴的压力， 在100至2500巴的压力下在管线中使溶剂和悬浮液汇合并混合为溶液混合物，其特征在于， 在100至2500巴的压力和10至90°C的温度下，经由至少一个喷嘴将溶液混合物喷 射入具有较低压力的容器中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，与生物源起始材料的悬浮液混合的溶剂 选自乙烷、丙烷、丁烷、二氧化碳、一氧化二氮、乙烯、丙烯、丁烯、其他饱和或不饱和烃、二甲 基醚、六氟化硫、R134a, R125、R32、R141b、氟利昂及其混合物。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，与生物源起始材料的悬浮液混 合的溶剂为非烃的超临界流体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，喷射之前用溶剂使生物源起始 材料的悬浮液饱和。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，喷射之前用溶剂使生物源起始 材料的悬浮液过饱和。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，回收使用的溶剂并使其返回至 用于溶剂的储存容器中。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，形成悬浮液之前通过洗涤、过 滤、粉碎、研磨或筛分预处理生物源起始材料。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述借助加压、喷射和降压的 结合使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法与另外的分解方法联合，所述另外的分解方法 选自借助高压均质器、球磨机、超声波均质器、弗氏压碎器和冲击射流装置进行细胞分解的 机械方法。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述借助加压、喷射和降压的 结合使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法与另外的分解方法联合，所述另外的分解方法 选自借助抗生素、螯合剂、离液剂、清洁剂和碱处理进行细胞分解的化学方法。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，所述借助加压、喷射和降压的 结合使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法与另外的分解方法联合，所述另外的分解方法 选自借助酶、噬菌体或自溶进行细胞分解的生物方法。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于，所述借助加压、喷射和降压 的结合使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法与另外的分解方法联合，所述另外的分解方法选自借助冻结和解冻、热解或降压进行细胞分解的物理方法。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其特征在于，使用的生物源悬浮起始材料 为藻类。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其特征在于，提取包含在生物源悬浮起始 材料中的类胡萝卜素类的细胞的有价值的物质，例如胡萝卜素或叶黄素。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于，提取包含在生物源悬浮起始 材料中的细胞的有价值的物质虾青素。
15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其特征在于，提取包含在生物源悬浮起始 材料中的脂肪类和油类的物质类别的细胞的有价值的物质。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于，溶剂与生物源悬浮起始材料 的比例为1至90kg/kg。
全文摘要
本发明涉及借助将加压、喷射和降压与随后的选择性提取和分离细胞的有价值的物质相结合从而使生物源悬浮起始材料细胞分解的方法，其中使用至少一个储存容器以在其中提供生物源起始材料的悬浮液，使用至少一个另外的储存容器以在其中提供溶剂，在细胞分解单元中制备细胞提取物，然后在提取阶段中使气体流过细胞提取物，并在分离阶段中通过降压将负载细胞的有价值的物质的气体与细胞的有价值的物质分离，其中·借助加压装置使生物源起始材料的悬浮液达到100至2500巴的压力，·借助加压装置使溶剂达到100至2500巴的压力，·在100至2500巴的压力下在管线中使溶剂和悬浮液汇合并混合为溶液混合物，·在100至2500巴的压力和10至90℃的温度下，经由至少一个喷嘴将溶液混合物喷射入具有较低压力的容器中。
文档编号C12N1/06GK102144026SQ200980134311
公开日2011年8月3日 申请日期2009年8月6日 优先权日2008年8月7日
发明者C·鲁特格, H·迪尔克斯, M·伯克, V·斯特恩哈根, Z·尼兹 申请人:乌德高压技术有限公司