由粗制核酸样品直接扩增的方法

专利名称：由粗制核酸样品直接扩增的方法
技术领域：
本发明一般地涉及从粗制样品中直接扩增核酸的方法。引言DNA谱型(profiles)的快速并准确的检测是法医工作样品分析的一个关键方面。 粗制样品，例如血液和口腔拭子，含有能够抑制在基于PCR的短串联重复(STR)分型中使用的聚合酶活性的物质。历史上，在进行下游酶操作例如PCR扩增之前，已需要去除抑制剂并纯化DNA。很多种DNA分离和纯化方法以及试剂盒是可以购得的。但是，它们的使用增加了制备后续分析样品的时间和花费。概述该发明提供了进行聚合酶链反应(PCR)的方法，包括提供包含脱氧核糖核酸的粗制样品；任选地将该粗制样品与5mM至25mM的NaOH孵育；将该粗制样品与直接缓冲液混合以形成含有核酸的溶液；以及对该脱氧核糖核酸进行PCR，其中所述的直接缓冲液包含至少3% -8%的甘油，0. 2% -0. 9%的非离子表面活性剂和1000-3000 μ g/ml的BSA。合适的非离子表面活性剂包括，但不限于，聚山梨醇酯(Tween)、Tween20、Triton-XlOO等等。本发明提供了进行聚合酶链反应(PCR)的方法，包括提供包含脱氧核糖核酸的粗制样品；任选地将该粗制样品与5mM到25mM的NaOH孵育；将该粗制样品与直接缓冲液混合以形成含有核酸的溶液；以及在该溶液中进行PCR，其中所述的直接缓冲液包含至少 5 个 PCR 引物对，10-50mM 的 Tris-HCl (PH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、 0. 01%-ο. 04% 的叠氮化钠、3%-8% 的甘油、100-350 μ M 的每一种 dNTP、0. 2%-0. 9% 的聚山梨醇酯、1000-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。在一些实施方式中，本发明提供了确定人的身份的方法，包括提供包含来自该人的脱氧核糖核酸的粗制样品；任选地将该粗制样品与5mM到25mM的NaOH孵育；将该粗制样品与直接缓冲液混合以形成含有核酸的溶液；其中所述直接缓冲液包含多个引物对， 其中每个引物对位于包含短串联重复(STR)的基因座的侧翼；在溶液中进行PCR以形成多个PCR扩增子；其中每个PCR扩增子具有可确定的大小；以及通过参考PCR扩增子的大小来鉴定该人；其中所述的直接缓冲液还包含10-50mM的Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -004% 的叠氮化钠、3% -8% 的甘油、100-350 μ M 的每一种 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯、1000-3000 μ g/ml 的 BSAjP 0. 101-0. 35U/μ 1 的 DNA 聚合酶。在一些实施方式中，包括制备核酸用于下游酶操作的方法，所述方法包括提供包含脱氧核糖核酸的粗制样品；任选地将该粗制样品与5mM到25mM的NaOH孵育；将该粗制样品与直接缓冲液混合以形成含有核酸的溶液；以及在该溶液中进行下游酶操作，其中所述的直接缓冲液包含 10-50mM 的 Tris-HCl (PH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、 0. 01% -ο. 04% 的叠氮化钠、3% -8% 的甘油、100-350μΜ 的每一种 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯、1000-3000 μ g/ml的BSA和0· 10-0. 35U/μ 1的DNA聚合酶。在一些实施方式中，所述下游酶操作是PCR。本发明还提供了用于基因分析的试剂盒，所述试剂盒包含多个引物对，其中每个引物对位于包含短串联重复(STR)的基因座的侧翼；和直接缓冲液，其中所述直接缓冲液包含 10-50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的叠氮化钠、3% -8%的甘油、100-350 μ M的每一种dNTP，0. 2 % -0. 9 %的聚山梨醇酯、 1000-3000 μ g/ml的BSA和0. 10-0. 35U/ μ 1的DNA聚合酶。在一些实施方式中，上述试剂盒任选地包括NaOH或其它强碱化合物，或其它的细胞裂解剂。其它的实施方式是反应混合物，其包含直接缓冲液和多个引物对；其中每个引物对位于包含短串联重复(STR)的基因座的侧翼；以及其中所述直接缓冲液包含10-50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % _0· 04 % 的叠氮化钠、 3% -8% 的甘油、100-350 μ M 的每一种 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯，1200-3000 μ g/ml 的BSA和0. 10-0. 35U/ μ 1的DNA聚合酶。在一些实施方式中，上述试剂盒可任选地包括 NaOH或其它强碱化合物，或其它的细胞裂解剂。


本领域技术人员将理解下面描述的附图只用于说明目的。附图并不意图以任何方式来限制本发明的范围。图1是来自血液样本的基因组DNA的STR谱的电泳图谱。图2A-2D是点样到FTA纸上的四份血液样本的不合格的(failed) STR谱的电泳图谱。图3A至12B是来自10个其血液被点样到FTA纸上的个体的STR谱的比较电泳图谱，所述FTA纸的穿孔被置于本文中的本发明的直接缓冲液中并标记为“A”。而标记为“B” 的电泳图谱代表使用!Iomega出售的PowerPlex 16 HS纯化系统制备的相同10个个体的血液STR谱。示例性实施方式描述在本申请中，除非特别地另外说明，单数的使用包括复数。在本申请中，除非特别地另外说明，词语“一”(“a”或“an”)的意思是“至少一”。在本申请中，除非另外说明，使用 “或”意味着“和/或”。另外，术语“包括”(“including”)以及其它形式(例如“ includes” 和“included”)的使用不是限制性的。本文中使用的节标题仅用于组织结构目的，并且不能理解为限制所描述的主题。 出于任何目的，本申请引用的全部文献、或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文在此通过引用全部明确地并入。如果一篇或多篇并入的文献定义了与本申请的术语定义相矛盾的术语，以本申请为准。定义本文中使用的术语“粗制样品”指的是怀疑含有核酸的生物来源标本，其没有经过分离或纯化所述核酸的步骤。例如，血液样品是粗制样品。任选地，粗制样品中的细胞被裂解。此外，点样在包含裂解试剂的纸上，例如FTA纸(从Whatman商业获得)上的血液样品是粗制样品。颊上皮细胞(cheek cells)的口腔试子是粗制样品的另一个实例。粗制样品包括，但不限于，血液、稀释血液、纸上的血液、口腔试子以及样品储存基质(例如FTA纸) 上的口腔试子。本领域技术人员将认识到大量的可以用该发明帮助分析的其它粗制样品。本文中使用的术语“直接缓冲液”指的是粗制样品可以放至其中的缓冲液。直接缓冲液包含进行下游酶操作例如聚合酶链反应(PCR)的引物和酶。直接缓冲液允许核酸释放并在直接缓冲液中直接扩增，不需要任何核酸分离或纯化。说明性的PCR循环次数和温度可以从Sambrook等的分子克隆，1993年第三版中获得。虽然本发明关注PCR直接缓冲液的使用，但应当理解，本领域技术人员可以容易采用本发明的直接缓冲液作为前端步骤进行其它类型的下游酶操作，例如，使用逆转录酶的逆转录，或使用连接酶的寡核苷酸连接测定。本文中使用的“下游”，当用于涉及在靶核酸上实施的方法和操作时，指的是在从生物样品中释放核酸的方法(包括但不限于裂解细胞以将核酸从细胞中释放)之后，在靶核酸样品上实施的方法和操作。本文中使用的“下游酶操作”指的是在核酸样品上实施的方法，包括但不限于使用聚合酶的PCR、使用逆转录酶的逆转录、或使用连接酶的寡核苷酸连接测定。本文中使用的术语“强碱化合物”包括但不限于NaOH。强碱化合物可在加入直接缓冲液的某些实施方式之前用于裂解细胞。本文中使用的“基因组DNA”指的是基因或基因片段的染色体DNA序列，包括非编码区和编码区的DNA序列。基因组DNA还指从细胞或染色体直接分离的DNA或这种DNA全部或部分的克隆拷贝。本文中使用的术语“等位基因”指的是与基因或DNA片段相关联的遗传变异，即， 占据同一基因座的DNA序列两个或更多替代形式中的一个。本文中使用的术语“基因座”指的是染色体或核酸分子上的具体位置。基因座的等位基因位于同源染色体的相同位点。本文中使用的术语“短串联重复(STR)基因座”指的是含有长度3至7个碱基对的短的、重复序列元件的人类基因组的任何区域。本文中使用的术语“包含短串联重复(STR)的基因座”指的是STR基因座，其中在基因组DNA的特定区域中，重复序列元件的数量(和序列的净长度)在等位基因之间和个体之间是不同的。本文中使用的术语“扩增引物”和“引物”指的是寡核苷酸，其能够与邻近靶序列的RNA或DNA区位点特异性地退火，并作为合适条件下DNA合成的起始引物，在所述条件下引物延伸产物的合成被诱导，例如，在存在核苷酸和如DNA-依赖性DNA聚合酶的聚合诱导剂，以及合适的温度、PH、金属浓度和盐浓度的情况下。通常，PCR反应使用一对扩增引物， 也称为“引物对”，包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物，其限定了待扩增的 RNA或DNA的区域。本文中使用的术语“扩增”指的是应用例如各种引物延伸反应中的任何一种，复制核酸的一部分的方法。示例性的引物延伸反应包括但不限于PCR。除非明确说明，“扩增” 指的是单个复制，或算术、对数或指数扩增。
本文中使用的术语“扩增子”或“PCR扩增子”指的是线性地或者指数地增加多核苷酸序列的各种技术，并可以是扩增反应的产物。扩增子可以是双链或单链的，并可以包括通过变性双链扩增产物而获得的分离成分链。在某些实施方式中，一个扩增循环的扩增子可以用作后续扩增循环的模板。示例性的扩增技术包括但不限于PCR或任何其它利用引物延伸步骤的方法。扩增的其它非限制性实例包括，但不限于，连接酶检测反应(LDR)和连接酶链式反应(LCR)。扩增方法可以包括热循环或可以等温进行。在各实施方式中，术语“扩增产物”包括来自扩增反应任何数目循环的产物。本文中使用的术语“核酸序列”可以指核酸材料本身，并且不限制于生化定义具体核酸，例如DNA或RNA分子的序列信息(即，选自五个碱基字母A、C、G、T或U的字母连续)。本文中使用的术语“多核苷酸”，“核酸”或“寡核苷酸”指的是天然或修饰的单体或键的线形聚合物，包括脱氧核糖核酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷、肽核酸等等，其通过核苷间的键连接并具有通过单体-单体相互作用的规律形式，例如Watson-Crick类型的碱基配对，特异结合靶多核苷酸的能力，并能够在模板-驱动反应中连接于另一寡核苷酸。通常单体是通过磷酸二酯键或其类似键连接以形成大小为几个单体(例如，3-4)到几百个单体范围的寡核苷酸。每当如寡核苷酸的多核苷酸由一系列字母来表示时，例如“ATGCCTG”，应当理解，除非另外指出，核苷酸从左到右是以5’ 一3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷。按照本领域的标准，字母A、C、G和T 可以用于指代碱基本身、包含所述碱基的核苷或核苷酸。在天然存在的多核苷酸中，核苷间的键通常是磷酸二酯键，并且亚单位可被称作“核苷酸”。本文中使用的“序列测定”、“测定核苷酸碱基序列”、“测序”、鉴定和类似术语包括测定部分或全长序列信息。即，该术语包括序列比较、指纹分析(fingerprinting)和靶多核苷酸类似水平的信息，以及表达鉴定和目标区域内的靶多核苷酸每个核苷的排序。在某些实施方式中，“序列测定”包括鉴定单个核苷酸，而在其它的实施方式中，多于一个核苷酸被鉴定。核苷、核苷酸和/或碱基的鉴定在本文中被认为是等价的。注意的是，在多核苷酸上进行序列测定通常产生关于完全互补的多核苷酸序列的等价信息，因此与在完全互补的多核苷酸上直接进行序列测定是等价的。本文中使用的关于寡核苷酸探针的“多个”包括成套的两个或多个寡核苷酸探针， 其中可以有单个“通用”寡核苷酸探针，其通常针对靶多核苷酸的非变异区具有特异性，和一个或多个“野生型”和/或“突变”寡核苷酸探针，其通常针对在序列中包含等位基因或突变变体的靶多核苷酸区具有特异性。本文中使用的“核酸聚合酶”或“聚合酶”指的是使用存在的多核苷酸作为模板催化多核苷酸合成的任何多肽。本文中使用的“DNA聚合酶”指的是使用存在的多核苷酸作为模板催化DNA合成的核酸聚合酶。发明详述通过改变预期的直接缓冲液各个组分各自的浓度，包括Tris-HCl、KCl、dNTPs、 BSA, AmpliTaq Gold DNA聚合酶、MgCl2、以及单链结合蛋白(SSB)、甘油和非离子表面活性剂，进行了大量的实验。这些实验使用例如腐殖酸作为通常存在于难以分析的生物材料样品中的抑制剂的代表，并且因此作为容易产生粗制样品的检测指标(proxy)。这些实验的结果表明当分析样品以鉴定STR等位基因时，下述制剂在产生高质量结果方面尤为有效。本发明包括包含3% -8%的甘油、0.2% -0.9 %的非离子表面活性剂和 1200-3000 μ g/ml BSA的直接缓冲液。本发明包括包含10_50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的叠氮化钠、3 % -8 % 的甘油、100-350 μ M 的每一种 dNTP、 0. 2% -0. 9% 的非离子表面活性剂、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0· 101-0. 35U/μ 1 的 DNA 聚
合酶的直接缓冲液。在一些实施方式中，非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯(Tween，Tween20), Triton-XlOO 等等。直接缓冲液中使用的试剂可以从供货商容易地获得。例如，DNA聚合酶可以从 Applied Biosystems 商业获得。合适的 DNA 聚合酶包括 PolA、PolB, PolC, PolD, PolX 和 PolY DNA聚合酶和I型、II型以及III型DNA聚合酶。通常，PCR中使用热稳定的DNA聚合酶，例如Taq、Pfu、Vent DeepVentT\92North 0 DNA聚合酶可以被修饰，从而在随后例如加热的处理之前没有活性；例如，参见美国专利5，773，258 (化学修饰的DNA聚合酶)，美国专利5，338，671抗体结合的DNA聚合酶。DNA聚合酶是本领域技术人员已知的。DNA聚合酶包括DNA-依赖的聚合酶，其使用DNA作为模板，或RNA-依赖的聚合酶，例如逆转录酶，其使用RNA作为模板。基于序列同源性，细菌DNA聚合酶可以细分为七个不同的家族A、B、C、D、X、Y和 RT。DNA依赖的DNA聚合酶落入六个家族(A、B、C、D、X和Y)之一，大多数落入三个家族(A、 B 禾口 C)之一。参见，例如，Ito 等(1991)Nucleic Acids Res. 19 :4045-4057 ；Braithwaite 等(199 Nucleic Acids Res. 21 :787-802 ;Filee 等(2002) J. Mol. Evol. 54 :763-773 ；和 Alba(2001)Genome Biol 2 :3002. 1-3002.4。某些DNA聚合酶可以是单链多肽(例如，某些 A家族和B家族的聚合酶)或亚基之一具有聚合酶活性的多亚基酶(例如，某些C家族聚合酶)。Id. A融合蛋白可以包含选自A、B、C、D、X或Y聚合酶家族的DNA聚合酶。A家族聚合酶(“Pol Α”)包括复制和修复聚合酶。该家族的复制成员包括T7DNA 聚合酶和真核线粒体DNA聚合酶Y。修复聚合酶中有大肠杆菌(E.coli)DNA Pol I，水生栖热菌(Thermus aquaticus)Pol I (Taq DNA聚合酶)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)Pol I。切除修复和后随链合成过程中产生的R崎片段的加工是由修复聚合酶执行的。由于大多数热稳定的Pol A酶不具有3’到5’核酸外切酶活性，所以它们不能校对新合成的核酸链，从而具有高错配率。B家族聚合酶(“Pol B”)基本上是复制聚合酶，包括主要的真核DNA聚合酶α、 δ、ε，也包括DNA聚合酶ζ。Pol B聚合酶也包括由一些细菌和噬菌体编码的DNA聚合酶， 其中最具特点的来自iTLPhi^和1 69噬菌体。Pol B酶参与前导链和后随链两者的合成， 并由于其在复制过程中的卓越的准确性而引人关注，因为除了缺乏校对活性的DNA聚合酶 α和ζ，许多Pol B酶具有强3’ -5’核酸外切酶活性。BSA可以从各种来源商业获得，例如，来自Roche，货号107114Μ001。FTA纸从 Whatman商业获得。在一些实施方式中，使用带有血斑的FTA纸。例如，来自Whatman的血斑卡(货号WB 100014)。在一些实施方式中，包含血液或口腔细胞的FTA纸被裁剪去除含有生物材料的小区，例如，直径0. 5mm至1. 2mm，或直径1. 0-1. 5mm，或直径1. 5-2. Omm的圆孔。 在一些实施方式中，纸被直接放入含有直接缓冲液的PCR混合液中进行PCR反应。
在一些实施方式中，在FTA纸放入直接缓冲液之前不要求清洗FTA纸。在一些实施方式中，当最初细胞未被裂解时，例如，当使用非FTA纸时，在与直接缓冲液混合并进行PCR反应之前，将5-25mM的NaOH溶液与非FTA纸孵育。在其它的实施方式中，细胞可以通过暴露于非NaOH的试剂而被裂解。在一些实施方式中，直接缓冲液还包含多对PCR引物对。例如，在一些实施方式中，直接缓冲液包括5对引物对。在一些实施方式中，直接缓冲液包括10对引物对。在一些实施方式中，直接缓冲液包括多于10对引物对。在一些实施方式中，直接缓冲液不包含 PCR引物对，而是在分开的时间加入PCR引物对。本方法的一些实施方式消除了进行PCR之前对样品纯化步骤的需要。同样的方法可以应用于FTA卡上的血液和口腔细胞样品。另外，显著地减少了生理样品的处理，因此这可以防止样品间可能的交叉污染以及消除人为错误的可能性。在一些实施方式中，从FTA 卡到STR谱所需要的时间可以减少至少11/2小时。该方法与目前法医市场上能够获得的自动化仪器是兼容的。从FTA纯化DNA的相关花费可以消除。相对于传统标准样品制备方法，得到完整STR谱的成功率是相当的。如图1所示，用Applied Biosystems Identifiler HID v. 1试剂盒直接使用的基因组DNA样品提供了完整的STR谱。然而，当从点样在FTA圆孔(1.2mm孔)上的血液提取血液基因组DNA，而不清洗圆孔去除干扰后续样品检测的物质，例如，通过直接PCR的STR图谱分析时，STR谱是部分的或者无法检测的，参见图2A-2D。所要求保护的发明和另一商业获得的产品之间的进一步比较数据表明，在任何情况下，所要求保护的发明的直接缓冲液通过使用1.2mm大小的打孔器在点样在FTA纸上的 10份血源样本中进行直接PCR，为10份均提供了完整的STR谱(具体地，图3-12，标记“A” 的电泳图谱)。使用另一个STR试剂盒，完整的STR谱只见于10份检测样本中的4份(图 3B、4B、7B和8B)，部分STR谱见于10份检测样本中的5份(图5B-7B和9B-10B)，并且有一个样本未见STR谱(图6B)。
实施例在第一个实施例中，将血液施用于FTA纸(Whatman)并且空气干燥。制备FTA 纸的0. 5mm圆孔并放入含有PCR引物的直接缓冲液，所述PCR引物来自商业获得的 Identifiler <g) Human Identity 试剂盒(Applied Biosystems)。接着进行 PCR0在第二个实施例中，使用TE缓冲液(IOmM Tris-Cl和0. ImM EDTA, pH 8. 0)制备 100倍血液稀释液。1 μ 1稀释血液用于在直接缓冲液中启动PCR。在第三个实施例中，收集口腔拭子样品并置于500 μ 1 TE缓冲液中。产生的悬浮液在97°C加热5分钟。10 μ 1产生的悬浮液用于在直接缓冲液中启动PCR。依据本发明的一些实施方式的示例性试剂盒本发明也提供了设计为加速实施某些方法的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒通过装配实施所述方法中使用的两种或更多种组分而用于加速目标方法的实施。在一些实施方式中，试剂盒可以包括预先测量的单位量的组分，以最小化终端用户测量的需要。在一些实施方式中，试剂盒可以包括进行该发明的一种或多种方法的说明书。在某些实施方式中，试剂盒的组分被优化，以与另一试剂盒组合操作。尽管本发明已依据这些示例性实施方式和实验数据进行描述，但是本领域技术人员应容易理解，在不进行过多的实验的情况下，这些实施方式的多种变化和修改是可能的。 所有这些变化和修改都在本发明的范围内。因此，在一些实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包含多个引物对，其中每个引物对位于包含短串联重复(STR)的基因座的侧翼；和直接缓冲液，其中所述直接缓冲液包含 10-50mM 的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KCl、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01% -0. 04% 的叠氮化钠、3% -8%的甘油、100-350μΜ的每一种dNTP、0. 2% _0. 9 %的非离子表面活性剂、 1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 Ampli Taq Gold DNA 聚合酶。这样的试剂盒可以用于例如鉴定生物诸如人的身份，其是通过利用例如毛细管电泳分析的微卫星多态性的集合来实现的。进行这种人类身份鉴定的说明性步骤可见于例如从Applied Biosystems商业获得的Identifiler HID试剂盒中，以及美国专利 6，221，598,6, 479，235,5, 843，660和7，008，771。在一些实施方式中，本发明提供的试剂盒、方法和反应混合物可以采用方法用于降解样品的多重PCR，例如见于Dimsoski和Woo的 W0050M515。在一些实施方式中，试剂盒中的直接缓冲液包含0. 2-0. 9 %的聚山梨醇酯、 3% -8% 的甘油、1200-3000 μ g/ml 的 BSA。在一些实施方式中，试剂盒中的直接缓冲还包含10_50mM的Tris-HCl (pH8. 3)、 30-80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的叠氮化钠、3 % -8 % 的甘油、 100-350 μ M 的每一种 dNTP、0. 2 % -0. 9 % 的聚山梨醇酯、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶。在一些实施方式中，试剂盒中的直接缓冲液进一步包含5mM-25mM的NaOH。在一些实施方式中，NaOH在与直接缓冲液分开的小瓶中提供。本申请中引用的所有文献和类似资料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、 论文和因特网网页，无论这些文献和类似资料的形式如何，均通过引用以其整体明确纳入本文用于任何目的。2007年3月23日提交的美国申请号60/896，668，2007年5月17号提交的美国申请号11/750，316和2008年3月M日提交的美国申请号12/054，174通过引用以其整体所有内容纳入本文。尽管本发明是与各种实施方式组合进行描述的，但并不意味着本发明受限于这些实施方式。相反地，本发明包含了各种替代、修改和等同方式，如本领域技术人员应理解的。
权利要求
1.一种进行聚合酶链反应(PCR)的方法，其包括提供包含脱氧核糖核酸的粗制样品；任选地将所述粗制样品与NaOH孵育；将所述粗制样品与直接缓冲液混合以形成含有核酸的溶液；以及在所述含有核酸的溶液中进行PCR，其中所述直接缓冲液包含至少0. 2% -0. 9%的聚山梨醇酯、3% -8%的甘油和1000-3000 μ g/ml的BSA0
2.根据权利要求1的方法，其中所述直接缓冲液还包含10-50mM的Tris-HCl(pH8. 3)、 30-80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01%-0. 04% 的叠氮化钠、100-350 μ M 的每一种 dNTP 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
3.根据权利要求1的方法，其中聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
4.一种鉴定人的身份的方法，其包括提供包含来自所述人的脱氧核糖核酸的粗制样品；任选地将所述粗制样品与NaOH孵育；将所述粗制样品与直接缓冲液混合以形成含有核酸的溶液，其中所述直接缓冲液包含多个引物对，其中每个引物对位于包含短串联重复(STR)的基因座的侧翼；在所述含有核酸的溶液中进行PCR以形成多个PCR扩增子，其中每个PCR扩增子具有可确定的大小；以及通过参考所述PCR扩增子的大小来鉴定所述人，其中所述直接缓冲液还包含 0. 2% -0.9%的聚山梨醇酯、3% -8%的甘油和1000-3000 μ g/ml的BSA。
5.根据权利要求4的方法，其中所述直接缓冲液还包含10-50mMTris-HCl (pH8. 3)、 30-80mM KCl、1. 4-2. 4mM MgCl2、0. 01% -0. 04% 的叠氮化钠、100-350 μ M 的每一种 dNTP 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
6.根据权利要求3的方法，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
7.一种制备核酸的方法，其包括提供包含脱氧核糖核酸的粗制样品；任选地将所述粗制样品与NaOH孵育；将所述粗制样品与直接缓冲液混合以形成含有核酸的溶液；在所述溶液中进行下游酶操作，其中所述直接缓冲液包含0.2% -0.9%的聚山梨醇酯、3% -8% 的甘油和 1000-3000 μ g/ml 的 BSA。
8.根据权利要求7的方法，其中所述下游酶操作是PCR。
9.根据权利要求7的方法，其中所述直接缓冲液还包含10-50mM的Tris-HCl(pH8. 3)、 30-80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01%-0. 04% 的叠氮化钠、100-350 μ M 的每一种 dNTP 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
10.根据权利要求7的方法，其中所述直接缓冲液还包含10-50mM的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的叠氮化钠、 100-350 μ M 的每一种 dNTP、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
11.根据权利要求7的方法，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
12.—种试剂盒，其包含多个引物对，其中每个引物对位于包含短串联重复(STR)的基因座的侧翼；以及直接缓冲液，其中所述直接缓冲液包含0. 2% -0. 9%的聚山梨醇酯、3% -8%的甘油和 1000-3000 μ g/ml 的 BSA。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述直接缓冲液进一步包含10-50mM的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的叠氮化钠、 100-350 μ M 的每一种 dNTP、1200-3000 μ g/ml 的 BSA 和 0. 10-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。
15.一种反应混合物，其包含直接缓冲液和多个引物对，其中每个引物对位于包含短串联重复(STR)的基因座的侧翼；以及其中所述直接缓冲液包含10-50mM的 Tris-HCl (pH8. 3)、30_80mM 的 KC1、1. 4-2. 4mM 的 MgCl2、0. 01 % -0. 04 % 的叠氮化钠、 3%-8% 的甘油、100-350 μ M 的每一种 dNTP、0. 2% -0. 9% 的聚山梨醇酯 20、1200-3000 μ g/ ml 的 BSA 和 0. 101-0. 35U/ μ 1 的 DNA 聚合酶。
全文摘要
本发明涉及用于扩增核酸的改进的方法，试剂盒和反应混合物。在一些实施例中提供了允许从极低样品纯化的粗制样品中直接扩增核酸的新的直接缓冲液制剂。
文档编号C12Q1/68GK102177250SQ200980134038
公开日2011年9月7日 申请日期2009年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者C·张, D·Y·王, L·K·亨尼西 申请人:生命科技公司