不依赖vegf的肿瘤的诊断和治疗的制作方法

专利名称：不依赖vegf的肿瘤的诊断和治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤生长和肿瘤类型的领域。本发明涉及肿瘤的抑制剂和诊断标志， 并且涉及其用于诊断和治疗癌症和肿瘤生长的应用。
背景技术：
恶性肿瘤(癌症)是美国仅次于心脏病的主要死亡原因(见，例如Boring等，CA Cancel J. Clin.(加拿大癌症临床杂志)43 :7 (1993))。癌症的特征在于来自正常组织的 异常、或赘生性细胞的数量增加(所述细胞增殖形成肿瘤块)，这些赘生性肿瘤细胞对邻近 组织的侵入，和产生最终通过血液或淋巴系统扩散到局部淋巴结和通过被称为转移的过程 扩散到远端位点的恶性细胞。在癌性状态中，细胞在其中正常细胞不会生长的条件下增殖。 癌症的表现形式多种多样，特征在于不同程度的侵袭力和侵占性。根据癌症类型，患者一般可获得一些治疗选择，包括化学疗法、辐射和基于抗体的 药物。用于预测不同治疗方案的临床效果的诊断方法将极大地有利于这些患者的临床管 理。一些研究已经研究了基因表达与特定癌症类型的鉴定之间的关联，例如通过突变-特 异性测定法，微阵列分析，qPCR等。这些方法可以用于对患者表现的癌症进行鉴定和分类。目前充分了解的是，血管发生涉及多种疾病的发病机理。这些包括实体瘤和转移
(atherosclerosis)(retrolental fibroplasias) >
血管瘤(hemangiomas)、慢性炎症、眼内新血管疾病如增殖性视网膜病(pro 1 iferative retinopathies)，例如糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)，年龄相关的黄斑 ^ (age-related macular (1686116:1^^11::1011,^10)),1^^1,1^,^011 (neovascular glaucoma)，移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis)。Folkman 等，生物化学杂志(J.Biol. Chem.), 267 10931-10934(1992) ；Klagsbrun 等，生理学年评(Annu. Rev. Physiol). 53 :217-239 (1991)； 和 Garner Α.，“血管疾病(Vascular diseases)“，在眼病的病理生物学(Pathobiology of Ocular Disease)中.A Dynamic Approach, Garner A. , Klintworth GK,编辑，第 2 版 (Marcel Dekker, NY, 1994)，第 1625-1710 页。在肿瘤生长的情形中，血管发生看来对于由过度增生向瘤形成的转变和给肿瘤 的生长和转移提供营养是关键的。Folkman等，自然(Nature) 339 :58 (1989)。与正常细 胞相比，新血管形成使肿瘤细胞获得生长益处和增殖自主性。肿瘤开始时通常是单一的 异常细胞，其可以由于与可及的毛细血管床的距离而仅增殖为几个立方毫米的大小，并 且其可以“以静止状态”存在，而在较长的时间内不进一步生长和扩散。一些肿瘤细胞接 着转化为生血管表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并且成熟为新的毛细血管。这 些新形成的血管不仅允许原发性肿瘤的持续生长，还允许转移性肿瘤细胞的扩散和再建群(recolonization)。因此，已经观察到在肿瘤切片的微血管密度和乳腺癌以及数种 其它肿瘤患者的存活之间的关联。Weidner等，新英格兰医学杂志(N. Engl. J. Med) 324 1-6(1991) ；Horak 等柳叶刀(Lancet) 340 :1120-1124(1992) ；Macchiarini 等，柳叶刀 (Lancet) 340 :145-146 (199 。控制血管生成开关的精确机制尚未被充分了解，但是认为 肿瘤块的新血管形成由多种血管发生刺激剂和抑制剂之间的净平衡导致(Folkman，1995， (自然医学)Nat Med 1(1) :27_31)。识别在病理条件下作为血管发生的主要调节剂的血管内皮细胞生长因子(VEGF) 促进了阻断VEGF活性的许多尝试。VEGF是一种血管发生的最佳表征和最有效的正向调 节剂。见，例如Ferrara，N. & Kerbel, R. S.血管发牛作为治疗剂靶标(Angiogenesis as a therapeutic target).自然(Nature)438 :967-74Q005)。除了在血管发生和血管生 成中作为生血管因子之外，VEGF还作为多效生长因子在其它生理过程中显示了多种生物 学效应，如内皮细胞存活，血管渗透性和血管舒张，单核细胞趋化作用和钙流入。i^errara 和Davis-Smyth (1997)内分泌学综述(Endocrine Rev). 18 :4_25。而且，研究已经报道了 VEGF对于数种非内皮细胞类型，如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和许旺细胞的促有丝分 裂作用。见，例如，Guerrin 等.细胞生理学杂志(J. Cell Physiol.) 164 :385-394(1995)； Oberg-Welsh 等.分子细胞内分泌学(Mol. Cell. Endocrinol). 126 125-132 (1997)；和， Sondell 等·神经科学杂志(J. Neurosci.) 19 :5731-5740(1999)。存在许多试图阻断VEGF活性的尝试。还提议将抑制性抗-VEGF受体抗体、 可溶性受体构建体、反义策略、针对VEGF的RNA适配体和低分子量的VEGF受体酪氨 酸激酶(RTK)抑制剂用于干扰VEGF信号传导。见，例如，Siemeister等.癌症转移综 述(Cancer Metastasis Rev). 17 :241-248 (1998)。已经在裸鼠中证明抗-VEGF 中和抗 体抑制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等.自然(Nature) 362 :841-844(1993) ；Warren 等· J. Clin. Invest. 95 :1789-1797(1995) ；BorgStr5m等.癌症研究(Cancer Res). 56 4032-4039(1996)；和 Melnyk 等·癌症研究(Cancer Res). 56 :921-924(1996))并且 还在缺血性视网膜疾病模型中抑制眼内血管发生(Adami s等.Arch. Ophthalmo 1. 114 66-71(1996))。事实上，一种人源化的抗-VEGF抗体，贝伐珠单抗(AVASTIN ，Genentech, South San Francisco, CA)是首个被设计用于抑制血管发生的U. S. FDA-批准的治疗方 法。见，例如，Ferrara等·，天然药物开发综述(Nature Reviews Drug Discovery), 3 391-400(2004)。其适应于与静脉内基于5-氟尿嘧啶-的化学疗法组合用于患有转移结肠 直肠癌的患者的一线或二线治疗；与卡钼和紫杉醇化学疗法组合用于患有不能切除的、局 部晚期、复发或转移性非鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗；和与紫杉醇化学 疗法组合，用于治疗对于其转移性HER2-阴性乳腺癌没有接受化学疗法的患者的应用。然而，治疗化合物干扰肿瘤生长的长期能力有时受到药物抗性发展的限制。对于 各种细胞毒性化合物的一些抗性机制主要在单细胞肿瘤模型中得到鉴定和功能性表征。 见，例如，Longley，D. B. & Johnston, P. G.药物抗性的分子机制(Molecular mechanisms of druR resistance).病理学杂志(JPathol) 205 :275-92 (2005)。此外，宿主基质-肿瘤 细胞相互作用可能涉及药物抗性表型。基质细胞分泌多种促-生血管因子并且不倾向于相 同的遗传不稳定性，增加突变率，与肿瘤细胞一样(Kerbel，R. S.抑制肿瘤血管发生作为阻 止获得对抗癌治疗剂的抗性的策略inhibition of tumor angiogenesis as a strategyto circumvent acquired resistance to anti-cancer therapeutic agents).生物测 定法(Bioessays)13 :31-6 (1991). Ferrara&Kerbel 禾口 Hazlehurst 等，在 Ferrara, N. & Kerbel, R. S.血管发牛.作为治疗革F1 标(Angiogenesis as a therapeutic target).自然 (Nature) 438 :967-74(2005)；和，Hazlehurst，L. Α. , Landowski, Τ. H. &Dalton,ff. S.肿瘤微 环境在调节对药物和细胞死亡的牛理调节剂的重新的抗件中的作用(Role of the tumor microenvironment in mediatinR de novo resistance to druRs and physioloRical mediators of cell death).致癌基因(Oncogene) 22 :7396-402(2003)进行综述。在临床前 模型中，用人源化的单克隆抗体贝伐珠单抗(AVASTIN ，Genentech，South San Francisco, CA)或贝伐珠单抗的鼠前体(A4. 6. 1(在3Λ9/91保藏的产生A4. 6. 1的杂交瘤细胞系，ATCC HB-10709))阻断VEGF信号传导在测试的大多数异种移植模型中显著抑制肿瘤生长并且减 少肿瘤血管发生(Gerber&Ferrara在Gerber，H. P. & Ferrara，N.贝伐珠单抗在临床前樽 型中作为单一疗法或与细胞,毒t牛疗法_合的药理学和药物代i射动力学(Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies).癌症研究(Cancer Res)65 :671-80(2005)中综述)。 当治疗在肿瘤生长的早期阶段开始时，单一药剂抗-VEGF治疗的药理学效应是最显著的。 如果治疗延迟到肿瘤已经充分建立才开始，抑制效应典型地是暂时的，并且肿瘤最终会发 展抗性。见，例如，Klement，G.等.组合节律(metronomic)化学疗法和抗-VEGFR-2抗 体在多药物杭件人I腺癌异种移棺中治疗指数的差异(Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidruR-resistant human breast cancer xenoRrafts.) 1^ - 石开胃(Clin Cancer Res) 8 :221-32(2002)。关于抗-VEGF治疗的所述抗性潜在的细胞和分子事件是复杂的。见， 例如，Casanovas, 0.，Hicklin, D. J.，Bergers, G. & Hanahan，D.在晚期郎格罕氏岛肿瘤中 通过逃避VEGF信号传导的抗牛血管靶向发展的药物抗件(Drug resistance by evasion of antianRioRenic tarRetinR of VEGF siRnalinR in late-staRe pancreatic islet tumors).癌症细胞(Cancer Cell) 8 :299-309(2005)；和，Kerbel，R. S.等.获得对抗-牛 血管药物的抗件的可能机制渉及使用组合疗法涂径(Possible mechanisms of acquired resistance to anti-anRioRenic druRs -implications for the use of combination therapy approaches)。癌症转移综述(Cancer Metastasis Rev) 20 :79-86 (2001)。因此，开发可以用于鉴定和治疗对抗VEGF治疗具有抗性的受试者的基于分子的 诊断方法是高度有利的。本发明解决了这些和其它需要，在回顾了下面的公开内容后这是 显而易见的。发明概述本发明的方法可以用于多种设定，包括，例如鉴定、诊断和治疗不依赖VEGF的肿 瘤。在某些实施方案中，本发明提供用于鉴定不依赖VEGF的肿瘤的标志组(marker sets)。本文提供在受试者中检测不依赖VEGF的肿瘤的方法。例如，方法包括确定一种或 多种基因在获自受试者的测试样品中的表达水平，其中与参照样品比较在测试样品中的一 种或多种基因的表达水平的变化指示在受试者中存在不依赖VEGF的肿瘤，其中至少一种 基因选自由 S100A8, S100A9, Tie-I，Tie-2, PDGFC，禾口 HGF 组成的组。在某些实施方案中，表达水平是mRNA表达水平。在某些实施方案中，mRNA表达水平使用微阵列或qRT-PCR进行测量。在某些实施方案中，mRNA表达水平的变化是增加。在 一个实施方案中，具有增加的mRNA表达水平的一个基因是S100A8或S100A9。在某些实施 方案中，mRNA表达水平的改变是减少。在一个实施方案中，具有减少的mRNA表达水平的一 个基因是PDGFC、Tie-l或Tie-2。在某些实施方案中，具有减少的mRNA表达水平的一个基 因是Tie-I或Tie-2，并且所述方法还包括确定第二基因在测试样品中的mRNA表达水平，其 中所述第二基因是CD31，CD;34，VEGFRl，或VEGFR2。在某些实施方案中，CD31，CDiM，VEGFRl 或VEGFR2在测试样品中的mRNA表达水平与参照样品比较被减少。在某些实施方案中，表达水平是蛋白表达水平。在某些实施方案中。蛋白表达水 平使用免疫测定法进行测量。在某些实施方案中，所述免疫测定法是ELISA。在某些实施方 案中，蛋白表达水平的变化是增加。在一个实施方案中，具有增加的蛋白表达水平的一个基 因是HGF。在某些实施方案中，检测不依赖VEGF的肿瘤的方法包括确定获自受试者的测试 样品中的两种以上基因的表达水平，其中与参照样品比较测试样品中两种以上基因的表 达水平的变化指示在受试者中存在不依赖VEGF的肿瘤，其中所述至少两种基因选自由 S100A8，S100A9，CD31，Tie-I，Tie-2，IL-I β，P1GF，PDGFC，和 HGF 组成的组中。在某些实施 方案中，检测不依赖VEGF的肿瘤的方法包括确定在获自受试者的测试样品中的五种以上 基因的表达水平，其中与参照样品比较在测试样品中5种以上基因的表达水平变化指示在 受试者中存在不依赖VEGF的肿瘤，其中至少5种基因选自由S100A8，S100A9, Tie-1, Tie-2, CD31, CD34, VEGFRl, VEGFR2, IL-I β，PlGF, PDGFC，和 HGF 组成的组中。在某些实施方案中，表达水平是mRNA表达水平。在某些实施方案中，mRNA表达 水平的变化是增加。在一个实施方案中，具有增加的mRNA表达水平的一个基因是S100A8， S100A9, PlGF或IL-I β。在某些实施方案中，mRNA表达水平的变化是减少。在一个实施 方案中，具有减少的mRNA表达水平的基因中的一个、二个、三个、四个、五个、六个或七个是 PDGFC, Tie-1, Tie-2, CD31, CD34, VEGFRl 和 / 或 VEGFR2。在某些实施方案中，所述表达水平是蛋白表达水平。在某些实施方案中，蛋白表达 水平的变化是增加。在一个实施方案中，具有增加的蛋白表达水平的一个基因是IL-I β， PlGF或HGF。在另一个实施方案中，具有增加的蛋白表达水平的两个基因是IL-I β和P1GF。在某些实施方案中，上述方法还包括治疗具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者，所述 方法包括向所述受试者施用有效量的下列中的任一种IL_li3拮抗剂、IL-6拮抗剂、LIF拮 抗剂、PlGF拮抗剂、S100A8拮抗剂、S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。在一个实 施方案中，将有效量的c-Met拮抗剂施用于具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在一个实施 方案中，将有效量的HGF拮抗剂施用于具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在某些实施方 案中，上述方法还包括治疗具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者，所述方法包括向受试者施用 组合第二药剂的有效量的VEGF拮抗剂，其中所述第二药剂是下列中的任一种IL-li3拮抗 剂，IL-6拮抗剂，LIF拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂，S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂或 c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，所述第二药剂是c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，所 述第二药剂是HGF拮抗剂。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。在某些 实施方案中，所述抗-VEGF抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝 伐珠单抗。在某些实施方案中，c-Met拮抗剂是抗-c-Met抗体。在某些实施方案中，HGF拮抗剂是抗-HGF抗体。在某些实施方案中，方法还包括向受试者施用有效量的化疗剂。本文还提供治疗受试者中不依赖VEGF的肿瘤的方法。在某些实施方案中，方法 包括治疗受试者中不依赖VEGF的肿瘤，所述方法包括向受试者施用有效量的下列中的任 一种=IL-I β拮抗剂，IL-6拮抗剂，LIF拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂，S100A9拮抗 剂，HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，将有效量的c_Met拮抗剂施用于具有 不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在一个实施方案中，将有效量的HGF拮抗剂施用于具有不依 赖VEGF的肿瘤的受试者。在另一个实施方案中，将有效量的IL-I β拮抗剂施用于具有不 依赖VEGF的肿瘤的受试者。在某些实施方案中，方法包括治疗受试者中不依赖VEGF的肿 瘤，所述方法包括向受试者施用组合第二药剂的有效量的VEGF拮抗剂，其中所述第二药剂 是下列中的任一种IL-1 β拮抗剂，IL-6拮抗剂，LIF拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂， S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，所述第二药剂是c_Met拮 抗剂。在某些实施方案中，所述第二药剂是HGF拮抗剂。在某些实施方案中，所述第二药剂 是IL-I β拮抗剂。在一个实施方案中，IL-I β拮抗剂是抗-IL-I β抗体。在另一个实施 方案中，c-Met拮抗剂是抗-c-Met抗体。在另一个实施方案中，HGF拮抗剂是抗-HGF抗体。 在某些实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，方法还包括向具 有不依赖VEGF的肿瘤的受试者施用有效量的化疗剂。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者被诊断患有癌症。在 某些实施方案中，受试者被诊断具有不依赖VEGF的肿瘤。在一个实施方案中，癌症选自由 下列各项组成的组中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、乳腺癌(breast cancer)和结肠直肠癌 (colorectal cancer)。在某些实施方案中，本发明提供预测受试者中的肿瘤是否将对不同于或除了 抗-生血管疗法之外的抗-癌疗法有效反应的方法，所述方法包括确定来自受试者的测试 样品是否包括这样的细胞，所述细胞在测试样品中表达的一种或多种基因的表达水平比其 在参照样品中表达所述基因的水平更高，其中至少一种基因选自由下列各项组成的组中 S100A8, S100A9, IL-I β，PlGF和HGF。在某些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用 有效量的IL-I β拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂，S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂，c-Met 拮抗剂，LIF拮抗剂或其任何组合。在某些实施方案中，本发明提供预测受试者中的肿瘤是 否将对不同于或除了抗-生血管疗法之外的抗-癌疗法有效反应的方法，所述方法包括确 定来自受试者的测试样品中是否包括这样的细胞，所述细胞在测试样品中表达的一种或多 种基因的水平比其在参照样品中的表达水平低，其中至少一种基因选自由下列各项组成的 组中Tie-l，Tie-2，CD31，CD;34，PDGFC，VEGFRl和VEGFR2。在某些实施方案中，表达水平是 mRNA表达水平。在某些实施方案中，所述表达水平是蛋白表达水平。在某些实施方案中， 抗-生血管疗法包括VEGF拮抗剂。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。在 某些实施方案中，抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，本发明提供预测癌症患者对于抗-VEGF疗法的反应性的方 法，所述方法包括在获自癌症患者的测试样品中确定上述一种或多种基因的表达水平，其 中与参照样品比较，所述一种或多种基因在测试样品中的表达水平的显著变化指示癌症患 者对抗-VEGF疗法减少的反应性或完全缺乏反应性。
在某些实施方案中，本发明提供用于监测癌症患者中抗-VEGF疗法的功效的方 法，所述方法包括在抗-VEGF疗法的进程中确定上述一种或多种基因在获自癌症患者的测 试样品中的表达水平，其中与参照样品比较，在测试样品中一种或多种基因的表达水平的 显著变化指示抗-VEGF疗法的减少的功效或完全缺乏功效。在某些实施方案中，本发明提供鉴定对抗-VEGF疗法具有抗性的癌症患者亚群体 (subpopulation)的方法，所述方法包括在获自每个癌症患者的测试样品中确定如上所述 的一种或多种基因的表达水平，其中与参照样品比较，一种或多种基因在测试样品中的表 达水平的显著变化指示癌症患者属于对抗-VEGF疗法具有抗性的亚群体。本文所述的任何实施方案或其任何组合应用于本文所述的本发明的任一种和所 有的方法。附图简述

图1组A-B举例说明乳腺发育。㈧来自8周龄未交配动物(virgin) VEGF+/+和 (B)印iVEGF-/-乳腺的代表性乳腺完整载片。棒代表1000 μ m。图2组A-D举例说明肿瘤发展和进展。(A)在PyMT. VEGF+/+(n = 24)和PyMT. epiVEGF-/"(n = 20)小鼠中，第一个可触知的肿瘤的时间。(B)累积肿瘤计数/来自8_16 周龄的 PyMT. VEGF+/+ (n = 20)和 PyMT.印iVEGF-/-(η = 15)小鼠的小鼠。(C)在 PyMT. VEGF+/+(n = 20)和PyMT.印iVEGF-/-(η = 15)小鼠中的平均累积肿瘤体积。(D)在16周 龄的小鼠的平均肿瘤重量。*指示组之间的统计学显著(P < 0. 05)差异。图3组A-F举例说明肿瘤血管密度。(A)来自PyMT. VEGF+/+小鼠和(B) PyMT. epiVEGF-/"小鼠，(C)用对照 IgG (GP120)处理的 PyMT. VEGF+/+ 小鼠或(D)用 抗-VEGF(G6. 3ImAb)处理的PyMT. VEGF+/+小鼠的肿瘤血管网络的代表性最大强度投影图 象(E)在PyMT. VEGF+/+肿瘤和PyMT. epiVEGF-/-肿瘤中血管体积相对于血管直径。(F) PyMT. VEGF+/+肿瘤中对比在PyMT. epiVEGF-/-肿瘤中的相对于血管直径的％血管体积(该 半径的血管体积/总的血管体积)。图4组A-C举例说明肿瘤微血管血流。(A)相对微血管血液流速。将数据表示为 平均值士SEM。*表示在组之间的显著(P <0.05)差异。对比增强的超声灌注分析的代表 性图象，描述了在大小-匹配的(B)PyMT. VEGF+/+肿瘤和(C)PyMT.印iVEGF-/-肿瘤中的微 血管血流。图5组A-H举例说明VEGFRl和VEGFR2mRNA在肿瘤中的定位。(A)原位杂交 显示VEGFRlmRNA在PyMT. VEGF+/+肿瘤中与血管内皮强相关。(B) VEGFRlmRNA在PyMT. epiVEGF-/-肿瘤中还与血管内皮相关(箭头)，尽管信号通常比在PyMT. VEGF+/+肿瘤 中更弱。用苏木精和曙红对来自(C)PyMT. VEGF+/+肿瘤和(D)PyMT.印iVEGF-/-肿瘤的 平行图象的载玻片进行染色。(E)原位杂交显示VEGFR2mRNA与分离的细胞簇相关，所述 分离的细胞簇与PyMT. VEGF+/+肿瘤中的血管内皮细胞一致。(F) VEGFR2 mRNA与PyMT. 印iVEGF-/-肿瘤中沿血管内皮的点簇(punctate clusters)相关(箭头)，尽管信号通常 比其在PyMT. VEGF+/+肿瘤中更弱。用苏木精和曙红对来自(G)PyMT. VEGF+/+肿瘤和(H) PyMT. epiVEGF-/-肿瘤的平行图象的载玻片进行染色。取具有苏木精和曙红染色的载玻片 的暗视野(A，B, E，F)或亮视野(C，D，G，H)强度的平行图象。比例尺是100 μ m。有意义
9的对照载玻片缺乏显著的信号(数据未显示)。图6组A-B举例说明通过Taqman分析的VEGFRl和VEGFR2 mRNA在肿瘤中的相对 水平。在 PyMT. VEGF+/+ 和 PyMT.印iVEGF-/-肿瘤中相对(A) VEGFRl 和(B) VEGFR2 转录体 水平。将数据表示为相对于PyMT. VEGF+/+的倍数变化(n = 9个肿瘤/组，在组之间具有 绝对水平的显著差异(P < 0. 05))。图7组A-E举例说明在PyMT. epiVEGF-/"肿瘤裂解物中减少的VEGF水平。(A)在 来自PyMT. VEGF+/+或PyMT. ep iVEGF-/"肿瘤的裂解物中的VEGF蛋白水平。(B-E)在下列 各项中进行的关于VEGF的原位杂交(使用关于外显子3的核糖核酸探针检测缺失)⑶ PyMT. VEGF+/+肿瘤，其中在紧邻坏死区域的有生存力，但是可能是低氧的肿瘤组织中存在 过度表达(箭头)或(C)PyMT.印iVEGF-/-肿瘤，其中表达主要在坏死肿瘤周围的低氧区域 中缺乏。取具有苏木精和曙红染色的载玻片的暗视野(B，C)或亮视野(D，E)亮度的平行图 象。比例尺是100 μ m。有义对照载玻片缺乏显著的信号(数据未显示)。图8组A-B举例说明抗-VEGF治疗对携带PyMT. VEGF+/+肿瘤或PyMT. 印iVEGF-/-肿瘤的小鼠的作用。每周用5mg/kg抗-VEGF(B204. 1)或同种型对照抗体(IgG) 处理小鼠2次并且(A)确定每只小鼠的肿瘤的平均累积数量或(B)平均累积肿瘤负担。将 数据表示为平均值士SEM(n = 10-15只动物/组)。*表示在用Β20或对照抗体处理的 PyMT. VEGF+/+小鼠之间的显著差异(P < 0. 05)。图9组A-E举例说明在肿瘤中生血管和炎性相对mRNA水平。在PyMT. VEGF+/+对 比 PyMT.印iVEGF-/-肿瘤中的鼠(A)PlGF, (B) IL-1 β，(C)S100A8, (D)S100A9 禾口 (E)PDGFC mRNA表达水平的定量RT-PCR分析。将数据表示为相对于PyMT. VEGF+/+的倍数变化(n = 5-9肿瘤/组)，在组之间的绝对水平中具有显著差异(P < 0. 05)。图10组A-C举例说明在肿瘤中生血管和炎性因子的蛋白水平。在PyMT. VEGF+/+ 肿瘤中对比在PyMT. ep iVEGF-/"肿瘤中(A) PlGF (B) IL-I β (C) HGF蛋白水平的ELISA或 Luminex分析。将数据表示为平均值士SEM.。*表示组之间的显著差异(P < 0. 05)。图11组A-D举例说明在肿瘤中⑶31，⑶34，Tie-I和Tie_2的相对mRNA表达水 平。在 PyMT. VEGF+/+和 PyMT.印iVEGF-/-肿瘤中(A)CD31, (B)CD34, (C)Tie-I 禾口 (D)Tie_2 转录体水平。将数据表示为相对于PyMT. VEGF+/+的倍数变化(n = 5-7只肿瘤/组)，在组 之间的绝对水平上具有显著差异(P < 0. 05)。图12 来自PyMT. ep iVEGF-/"肿瘤的原代上皮细胞与来自PyMT. ep iVEGF+/+肿瘤 的原代上皮细胞比较，具有增加的体外对HGF的迁移反应。误差条表示SEM。发明详述本文所述或参考的技术和方法通常是充分了解的，并且由本领域技术人员使用 常规方法一般应用，如例如，在下述参考文献中所述广泛使用的方法=Sambrook等.，分 子克隆实验室手册(Molecular Cloning =ALaboratory Manual)，第 3 版 Q001)冷泉 港实验室出版社，冷泉港，N. Y.在分子生物学中目前使用的方法(⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY) (F. Μ. Ausubel,等.编辑，(2003))；酶学方法(Methods IN ENZYM0L0GY)系列(学术出版社公司)=PCR 2 实用方法(PCR 2 :A PRACTICAL APPROACH) (Μ. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 编辑(1995))，Harlow 和 Lane,编辑(1988)抗体，实验室手册，和动物细胞培养(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE) (R. I. Freshney，编辑(1987))；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) (Μ. J. Gait，编辑，1984)；分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，Humana 出 版社；细胞生物学实验室笔记(Cell Biology =A Laboratory Notebook) (J. Ε. Cellis, 编辑，1998)学术出版社；动物细胞培养(Animal Cell Culture) (R. I. Freshney)，编辑， 1987)；细胞和组织培养介绍 Gntroduction to Cell and Tissue Culture) (J. P. Mather 和P. E.Roberts，1998) Plenum出版社；细胞和组织培养实验室方法(Cell and Tissue Culture :Laboratory Procedures) (A. Doyle, J. B. Griffiths,禾口 D. G. Newell,编辑， 1993-8) J. Wiley 和 Sons ；实验室免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology) (D. M. Weir和C. C. Blackwel 1，编辑)；哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells) (J. Μ· Miller 和 Μ· P. Calos，编辑，1987) ；PCR :聚合酶链 式反应(PCR :The Polymerase Chain Reaction), (Mullis 等·，编辑，1994)；免疫学目前 使用的方法(Current Protocols in Immunology) (J. Ε· Coligan 等·，编辑，1991)；分子 生物学中的简便方法(Short Protocols in Molecular Biology) (Wiley 和 Sons，1999)； 免疫生物学(Immunobiology) (C. A. Janeway 禾口 P. Travers, 1997)；抗体(Antibodies) (P. Finch, 1997) -MW(Antibodies :A Practical Approach) (D. Catty. ,'ΦΜ,
IRL 出版社，1988-1989)；单克隆抗体实用方法(Monoclonal Antibodies :A Practical Approach (P. Si印herd和C. Dean，编辑，牛津大学出版社，2000)；使用抗体实验室手册 (Using Antibodies :A Laboratory Manual) (Ε. Harlow 和 D. Lane ( 7令泉港实验室出版 社，1999)；抗体(The Antibodies) (Μ. Zanetti 和 J. D. Capra，编辑，Harwood 学术出版社， 1995)；和癌症肿瘤学的原理和实践(Cancer principles and Practice of Oncology) (V. T. DeVita 等.，编辑，J. B. Lippincott 公司，1993)。除非另有说明，本文所用的技术和科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常 所知相同的含义。Singleton等.，微生物和分子生物学字典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第 2 版，J. ffiley&Sons (纽约，N. Y. 1994)，和 March，高级有 机化学反应、机制禾口结构(Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Mructure)，第 4 版，John ffiley&Sons (New York, N. Y. 1992)，向技术人员提供了本申请所 用的许多术语的一般指导。在本文提及的所有参考文献，包括专利申请和出版物，完整结合 在本文作为参考。定义出于解释本说明书的目的，应用下面的定义，并且只要适合，以单数使用的术语也 包括复数形式，并且反之亦然。要理解的是，本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的 目的，并不意欲有任何限制。当在下面提出的任何定义与作为参考结合在本文中的任何文 献冲突时，以下面的定义为准。“测试样品”或“样品”在本文指从目标受试者获得或得到的组合物，其包含意欲例 如基于物理、生化、化学和/或生理特征表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。在一 个实施方案中，该定义包括血液和生物起源的其它液体样品，和组织样品如活组织检查样 本或组织培养物或来自其中的细胞。组织样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的 器官或组织样品的实体组织或活组织检查样品或抽吸物；血液或任何血液成分；体液；和来自受试者妊娠或发育的任何时候的细胞，或血浆。在另一个实施方案中，该定义包括在获得它们后已经以任何方式进行处理的生物 学样品，所述方式如通过用试剂处理，溶解，或富集某些成分，如蛋白或多核苷酸，或包埋在 半固体或固体基质中用于切片目的。在本文中目的，组织样品的“切片”意为组织样品的单 一部分或块，例如自组织样品切下的组织或细胞的薄切片。样品包括，但不限于，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清液，细胞裂解物，血小 板，血清，血浆，玻璃体液(vitreous fluid)，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊膜液，乳，全血， 尿液，脑脊液，口水(saliva)，痰(sputum)，泪液，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养基， 以及组织提取物如勻化的组织，肿瘤组织，和细胞提取物。在一个实施方案中，所述测试样品是临床样品。在另一个实施方案中，所述测试样 品用在诊断测定中。在一些实施方案中，所述测试样品获自原代或转移肿瘤。组织活组织 检查通常用于获得肿瘤组织的代表块。备选地，肿瘤细胞可以以已知或被认为包含目的肿 瘤细胞的组织或流体形式间接获得。例如，肺癌病灶的生物学样品可以通过切除术、支气管 镜检、细针抽吸活检(fine needle aspiration)、支气管刷检(bronchial brushings)获 得，或来自痰、胸膜液或血液。在一个实施方案中，测试样品获自抗生血管疗法之前的受试者或患者。在另一个 实施方案中，测试样品获自在VEGF拮抗剂疗法之前的受试者或患者。在另一个实施方案 中，测试样品获自抗-VEGF抗体疗法之前的受试者或患者。在某个实施方案中，测试样品在 抗生血管、VEGF拮抗剂或抗-VEGF抗体疗法过程中或之后获得。在某些实施方案中，测试 样品在癌症已经转移后获得。“参照样品”用于本文时，指用于比较目的的参照的任何样品、标准或水平。在一个 实施方案中，参照样品获自相同受试者或患者的身体的健康和/或非患病部分。在另一个 实施方案中，参照样品获自相同受试者或患者的身体的未处理的组织和/或细胞。在某些实施方案中，参照样品包含对VEGF拮抗剂疗法有反应的肿瘤。在某些实施 方案中，VEGF疗法包含抗-VEGF抗体。在某些实施方案中，抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在 某些实施方案中，参照样品包含肿瘤，其是不依赖VEGF的肿瘤。在某些实施方案中，参照样品是在与获得测试样品的时间不同的一个或多个时间 点获得的来自相同受试者或患者的单一样品或组合的多个样品。例如，参照样品在比获得 测试样品时更早的时间点从相同的受试者或患者获得。如果参照样品在开始诊断癌症时获 得，并且测试样品随后在癌症已经转移时获得，所述参照样品可以是有用的。在一个实施方案中，参照样品获自非-受试者或患者的个体的身体的健康和/或 非患病部分。在另一个实施方案中，参照样品获自非-受试者或患者的个体的身体未处理 的组织和/或细胞部分。在某些实施方案中，参照样品包括获自非-受试者或患者的一个或多个个体， 在上述术语“样品”下定义的所有类型的生物学样品。在某些实施方案中，参照样品获自 非-受试者或患者的患有癌症的一个或多个个体。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个健康个体的 合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个患 有癌症的个体的合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个个体的正常组织的合并的RNA样品。在某些实施方案中，参照样品是来自 非-受试者或患者的一个或多个患有癌症的个体肿瘤组织的合并的RNA样品。“不依赖VEGF的肿瘤”，用于本文时，指在包括至少一种VEGF拮抗剂的癌症治疗过 程中完全不反应，或失去反应或显示减少的反应的癌症、癌性细胞或肿瘤。在某些实施方 案中，不依赖VEGF的肿瘤是对抗-VEGF抗体疗法有抗性的肿瘤。在一个实施方案中，所述 抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，不依赖VEGF的肿瘤是不可能对包含至少 一种VEGF拮抗剂的癌症疗法有反应的肿瘤。在某些实施方案中，对癌症疗法的反应性是患 者对如本文定义的癌症疗法的反应性。基因或生物标志的表达水平/量可以基于本领域已知的任何适合的标准定性和/ 或定量地确定，包括但不限于mRNA，cDNA，蛋白，蛋白质片段和/或基因拷贝数。在某些实 施方案中，与在第二样品中的表达/量比较，在第一样品中的基因或生物标志的表达/量增 加。在某些实施方案中，与在第二样品中的表达/量比较，在第一样品中的基因或生物标志 的表达/量减少。在某些实施方案中，所述第二样品是参照样品。在某些实施方案中，术语“增加”指与参照样品比较，通过标准本领域已知方法 如本文提及的那些检测的在蛋白水平或核酸水平上的5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %， 40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99% 以上的总的增加。在 某些实施方案中，术语增加指基因或生物标志的表达水平/量在样品中的增加，其中增加 是参照样品中各个基因或生物标志的表达水平/量的至少约1. 25X，1. 5X，1. 75X，2X，3X， 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X,或 IOOX0在某些实施方案中，术语“减少”在本文指与参照样品比较，通过标准的本领域 已知方法如本文所述的那些检测的，在蛋白或核酸水平上的5 %，10 %，15 %，20 %，25 %， 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97^,98^,99%以上的总的减少。在某些实施方案中，术语减少指样品中基因或生物标志 的表达水平/量的减少，其中减少是参照样品中各个基因或生物标志的表达水平/量的至 少约 0. 9X, 0. 8X, 0. 7X, 0. 6X, 0. 5X, 0. 4X, 0. 3X, 0. 2X, 0. IX，0. 05X,或 0. 01X。用于确定基因的表达水平/量的另外的公开内容在本文中本发明的方法下描述。“检测”包括任何检测方式，包括直接或间接检测。术语“标记”当用于本文时，指直接或间接与试剂如核酸探针或抗体缀合或融合并 且有利于检测与其缀合或融合的试剂的化合物或组合物。所述标记本身可以是可检测的 (例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记的情形中，可以催化可检测的底物化 合物或组合物的化学变化。在某些实施方案中，所谓“相关(correlate) ”或“相关(correlating) ”意味着以 任何方式比较第一分析或流程的性能和/或结果与第二分析或流程的性能和/或结果。例 如，可以使用第一分析或流程的结果进行第二流程和/或可以使用第一分析或流程的结果 来确定是否应该进行第二分析或流程。关于基因表达分析或流程的实施方案，可以使用基 因表达分析或流程的结果来确定是否应该进行具体的治疗方案。术语“生物标志”用于本文时一般指，这样的分子，其包括，基因、蛋白、碳水化合物 结构或糖脂，所述分子在哺乳动物组织或细胞中或在其上的表达可以通过标准方法(或本 文公开的方法)检测，并且是对哺乳动物细胞或组织对基于抑制血管发生的治疗方案的敏感性的预测、诊断和/或预后，所述基于抑制血管发生的治疗方案，例如抗-血管发生药剂 如VEGF-特异性抑制剂。“小分子”在本文被定义为具有低于约500道尔顿的分子量。“多核苷酸”或“核酸”可以在本文互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合物，并包 括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/ 或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应结合到聚合物中的任何底 物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。“寡核苷酸，”用于本文时，一般指短的、一般为单链的，一般为合成的多核苷酸，其 一般，但不是必需地少于约200个核苷酸的长度。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不相互 排斥。上面关于多核苷酸的描述等同地并且充分地可应用于寡核苷酸。“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，其从至少一种污染核酸分子中鉴定和分 离，核酸分子与所述污染核酸分子一般在多肽核酸的天然来源中缔合。分离的核酸分子不 同于其中其以天然发现的形式或设置。因此，分离的核酸分子与存在于天然细胞中的核酸 分子区分开来。然而，分离的核酸分子包括包含在正常表达多肽的细胞中的核酸分子，其中 例如，核酸分子以不同于天然细胞的染色体定位定位在染色体上。“引物”通常为短的单链多核苷酸，一般具有游离的3' -OH基团，其通过与靶序列 杂交结合于可能存在于目的样品中的靶标，并且随后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。术语“持家基因”指编码其活性对于维持细胞功能是必要的蛋白的一组基因。这 些基因典型地在所有的细胞类型中类似地表达。术语“阵列”或“微阵列”，用于本文时，指可杂交的阵列元件，优选地多核苷酸探针 (例如，寡核苷酸)在基底上的有序排列。基底可以是固体基底，如玻璃载玻片，或半固体基 底，如硝化纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何变换。“天然序列”多肽包含与来自自然的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。因此，天 然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多 肽可以从自然分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列”多肽具体地包括多 肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，细胞外结构域序列)，天然存在的变体形式(例如， 可变剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其 回收的多肽或抗体。多肽的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质， 可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将多肽纯 化至(1)根据Lowry法的测定，多肽重量超过95%或重量超过99%，(2)足以通过使用转 杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或C3)根据使用考马 斯蓝或银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的 至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通 常通过至少一个纯化步骤来制备。“多肽链”指其中其每个结构域通过肽键(不同于非共价相互作用或二硫键)与其 它结构域相连的多肽。多肽“变体”指与相应的天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物 学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N末端和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)残基的多肽。通常，变体将会与天 然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性，或至少约90%氨基酸序列同一性，或至少 约95%或更多氨基酸序列同一性。变体还包括天然序列的多肽片段(例如亚序列、截短物 等)，典型地是有生物学活性的。术语“蛋白质变体”在用于本文时指上文所述变体和/或在天然蛋白质序列中包 含一个或多个氨基酸突变的蛋白质。任选的是，所述一个或多个氨基酸突变包括氨基酸置 换。用于本发明的蛋白质及其变体可通过本领域众所周知的多种方法来制备。蛋白质的氨 基酸序列变体可通过蛋白质DNA中的突变来制备。此类变体包括例如，蛋白质氨基酸序列 内的残基缺失、插入或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合以获得具有期望活性的 最终构建体。在编码变体的DNA中进行的突变绝不能将序列置于读码框之外，而且优选不 会产生能产生二级mRNA结构的互补区。EP 75，444A。术语“抗体”以最广义使用，具体地涵盖单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆 抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性 抗体)、及抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。除非另有说明，表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位 点的抗体。多价抗体典型地被改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序 列IgM或IgA抗体。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，并因 此保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的实例包括(i)Fab片段，其具有 VL、CL、VH和CHl结构域；(ii)Fab'片段，其是在CHl结构域的C-末端具有一个或多个半 胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CHl结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH 和CHl结构域及CHl结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体 单臂的 VL 和 VH 结构域；(vi) dAb 片段(Ward 等，自然(Nature) 341 :544-546 (1989))，其 由VH结构域组成；(vii)分离的⑶R区；(viii)F(ab' )2片段，即包含通过铰链区的二硫 桥键(disulphide bridge)相连的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如 单链 Fv;scFv) (Bird 等，科学(Science) 242 :423-似6 (1988)和 Huston 等，PNAS (USA) 85 5879-5883(1988)) ； (χ) “双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连 的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)(参见例如ΕΡ404，097 ；WO 93/11161 ；和 Hollinger 等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci.USA)90 :6444-6448(1993))； (xi) “线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一 起形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)和美国专利 5，641，870)。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)外。因 此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。单克隆抗体是针对单一抗原高 度特异性的。在某些实施方案中，单克隆抗体典型地包括包含结合靶标的多肽序列的抗体， 其中靶标结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶标结合多肽序列在内的 过程得到的。例如，选择方法可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA 克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶标结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶标的亲和性、将靶标结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体 内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶标结合序列的抗体也是本发明 的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不 同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的 优点在于它们典型地未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求 通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来 生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein，自然(Nature) 256 :495-97 (1975)； Hongo 等，杂交瘤(Hybridoma)，14 (3) =253-260 (1995) ； Har low 等，抗体实验室手册 (Antibodies :A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，第 2 版.1988 ；Hammer ling 等，于单克隆抗体和 T-细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas), 563-681，Elsevier, N. Y.，1981)、重组 DNA 法(参见例如美国专利 No. 4，816，567)、 噬菌体展示技术(参见例如Clackson等，自然(Nature) 352 :624-628 (1991) ；Marks 等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 222 :581-597 (1991) ；Sidhu等，分子生物学杂志 (J. Mol. Biol. )338(2) :299-310(2004) ；Lee 等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 340 (5) 1073-1093(2004) ；Fellouse，美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 101 (34) 12467-12472(2004)；及 Lee 等，免疫学方法杂志(J. Immunol. Methods) 284 (1-2) 119-132 Q004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序 列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ； WO 1996/33735 ；W01991/10741 Jakobovits 等，美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 90 :2551(1993) Jakobovits 等，自然(Nature) 362 :255-258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 :33(1993)；美国专利 No. 5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ； 5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016 ;Marks 等，生物 / 技术(Bio/technology) 10 779-783(1992) ;Lonberg 等，自然(Nature) 368 :856-859(1994) ;Morrison，自然 (Nature) 368 :812-813(1994) ；Fishwild 等，自然生物技术(Nature Biotechnol.) 14 845-851(1996) ；Neuberger,自然生物技术(Nature Biotechnol.) 14 :826(1996)；及 Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93(1995))。单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍 生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部 分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此 类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4，816，567和Morrison 等，美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) USA 81 :6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受 体的高变区残基用具有期望特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大 鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区 (FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中 没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将 包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗 体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多 细节参见 Jones 等，自然(Nature) 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，自然(Nature) 332 323-329(1988)；及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。还可参见例 如 Vaswani 禾口 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115(1998) ；Harris, Biochem.Soc.Transactions 23 1035-1038(1995) ；Hurle 禾口 Gross, Curr. Op. Biotech. 5 428-433(1994)；及美国专利号 6，982，321 和 7，087，409。还可参见 van Dijk 和 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. , 5 :368-74 (2001)。人抗体可以如下制备，即将抗原施用于 转基因动物，其经修饰而应答抗原激发生成此类抗体，但是其内源基因座已经失去能力，例 如经免疫的异种移植小鼠0 31101^(^)(参见例如美国专利号6，075，181和6，150，584，关 于XEN0M0USE 技术)。还可参见例如Li等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，103 :3557-3562 (2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸 序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确 排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生 成。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan 等，自然生物技术(Nature Biotechnology) 14 :309-314(1996) ；Sheets 等，PNAS(USA)95 6157-6162(1998) ；Hoogenboom和 Winter，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 227 :381 (1991)； Marks等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol. )222 :581 (1991))。人抗体还可通过将人免疫 球蛋白基因座引入转基因动物来产生，所述转基因动物例如是其中内源免疫球蛋白基因 已经部分或完全灭活的小鼠。在受到激发时，观察到人抗体产生，它在所有方面与在人中 看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。这种方法记载于例如美国专 利号 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016，及以下科学 出版物中:Marks 等，生物 / 技术(Bio/Technology) 10 :779-783 (1992) ；Lonberg 等，自 然(Nature)368 :856-859(1994) ；Morrison,自然(Nature)368 :812-13(1994) ；Fishwild 等，自然生物技术(Nature Biotechnology) 14 :845-51 (1996) ；Neuberger,自然生物技术 (Nature Biotechnology)14 826(1996) ；Lonberg 禾口 Huszar, Intern.Rev. Immunol. 13 65-93(1995)。或者，人抗体可通过产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制 备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole等，单克隆抗体 禾口癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, p. 77(1985)； Boerner 等，免疫学杂志(J. Immunol.) 147 (1) :86-95(1991)；及美国专利号 5，750，373。术语“可变的”指可变结构域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特 定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可 变结构域。它集中于轻链和重链可变结构域中称作高变区的三个区段。可变结构域中更加 高度保守的部分被称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们 大多采取折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成折叠结构一部分的三 个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区 一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，免疫目的蛋白序列Gequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，Public Health Service,国家健康石if究所(National Institute of Health), Bethesda, MD. (1991))。恒定结构域不直接参与抗 体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。术语“高变区”、“ HVR”或“HV”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。 例如，术语高变区指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区 域。通常，抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗 体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精细特异性 中发挥独特作用。参见例如Xu等免疫性(Immunity) 13 =37-45(2000) Johnson和Wu于 分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology) 248 1-25 (Lo，编辑，Human 出版社， "TotowhNJdOO； )。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼科动物抗体(camelid antibody) 在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等自然(Nature) 363 446-448(1993) ；Sheriff 等自然结构生物学(Nature Struct. Biol.) 3 :733-736 (1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补性决定区(OTR)是以序列变异 性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，免疫目的蛋白序列Gequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版· Public Health Service,国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD. (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia 和 Lesk 分子生物学杂志(J. Mol. Biol. ) 196 :901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 与Chothia结构环之间的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接 触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个 的残基。
Loop KabatAbMChothiaContactLlL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36L2L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96
HlH31-H35BH26-H35BH26-H32H30-H35B (Kabat 编号)HlH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35 (Chothia 编号)H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101
HVR可包括如下“延伸的HVR”:VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50—56 (L2)
和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基是依照Kabat等，见上文编号的。“构架区”或“FR”残基指除本文中所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。术语“依照Kabat的可变结构域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，见上文中的用于抗体重链可变结构域或轻链可变结构 域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸， 对应于可变结构域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包含H2残基52后 的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照 Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与 “标准” Kabat编号序列对比同源区来确定。贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变结构域中的残 基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat等，免疫目的序列 (Sequences of Immunological Interest).第 5版·公众健康月艮务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, Md. (1991))。 "EU编号系统”或“EU索引” 一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如 Kabat 等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)中报道的EU索引，明确收入本文作为参考)。除非本文中另 有说明，提及抗体可变结构域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非 本文中另有说明，提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式 (例如参见美国临时申请号60/640, 323，EU编号方式的图)。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免 疫球蛋白有五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例 如IgG1 (包括非A和A同种异型)、Ig(i2、IgG3、IgG4, IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋 白对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、Y和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构 和三维构型是众所周知的，一般性记载于例如Abbas等，细胞和分子免疫学(Cellular and Mol. Immunology)，第4版.(W. B. Saunders, Co. ,2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其 它蛋白质或肽共价或非共价结合而形成的更大融合分子的一部分。根据其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白) 的“轻链”可归入两种截然不同的型，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)中的一种。术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其可以是通过用木瓜蛋白酶消化 完整抗体生成的。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的 边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为Fc区自大约Cys2^位置或大约ftx)230 位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基 447)可以例如在生产或纯化抗体的过程中去除，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组 工程改造而去除。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被去除的抗体群、无一 K447残基被去除的抗体群、以及具有有和无K447残基的抗体混合物的抗体群。免疫球蛋白 的Fc区一般包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat等，见上文中的 EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGl EU抗体的残基编号方式。"Fe区链”在本文中指Fc区两条多肽链之一。人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2”结构域)通常自约第231位氨基酸残 基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域 之间。推测碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代物且有助于稳定CH2结构域。 Burton，分子免疫学(Molec. Immunol.) 22 :161-206 (1985)。CH2结构域在本文中可以是天 然序列CH2结构域或变异CH2结构域。"CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的一段残基(即自IgG的约第341位氨 基酸残基至约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异 CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的“突出”(protroberance)而在其另一条链中具 有相应引入的“空腔” (cavity)的CH3结构域；参见美国专利号5，821，333，明确收入本文 作为参考)。此类变异CH3结构域可用于生成本文所述多特异性(例如双特异性)抗体。“铰链区”通常定义为自人IgGl的约Glu216或约Cys2^至约ftx)230的区段 (Burton，分子免疫学(Molec. Immunol.) 22 161-206 (1985))。其它IgG同种型的铰链区可 以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgGl序 列对比。铰链区在本文中可以是天然序列铰链区或变异铰链区。变异铰链区的两条多肽链 通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之 间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgGl铰链区。“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种“效应子功能”。例示性的“效应子 功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应子功能 一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变结构域)结合，而且可使用本领域已知的用于评估 此类抗体效应子功能的多种测定法来评估。“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。 天然序列人Fc区包括天然序列人IgGl Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc 区、天然序列人IgG3 Fc区、及天然序列人IgG4 Fc区，及其天然存在变体。“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸 序列。在某些实施方案中，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与母体多肽的Fc区相比至少 一处氨基酸置换，例如在天然序列Fc区中或在母体多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨 基酸置换，优选约1处至约5处氨基酸置换，例如在天然序列Fc区中或在母体多肽的Fc区 中具有约1处至约10处氨基酸置换，优选约1处至约5处氨基酸替代。典型的是，变异Fc 区在本文中将与天然序列Fc区和/或母体多肽的Fc区例如具有至少约80%序列同一性， 或至少约90%序列同一性，或至少约95%或更多序列同一性。抗体“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体 Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括Clq结合和补 体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作 用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞 (例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型 Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶 细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达Fc y RIII，而单核细胞表 达 FcyRI、Fc y RII 禾口 FcyRIII。Ravetch 禾口 Kinet，免疫学年评(Annu. Rev. Immunol.) 9 457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC 活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利号5，500, 362或5，821，337中所记载的。可 用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选 地/另外地，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等， PNAS (USA) 95 :652-656(1998)中所披露的。“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在某些实施方 案中，该细胞至少表达Fc YRIII并行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包 括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细 胞，一般优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源(例如从血液或PBMC)分离，如 本文所述。“Fe受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然 人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR (γ受体)，包括Fc γ RI、Fc γ RII 和Fc γ RIII亚类的受体，包括那些受体的等位基因变体和可变剪接形式。Fc γ RII受体 包括FcyRIIA( “活化受体”)和Fc y RIIB ( “抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列， 区别主要在于其胞质结构域。活化受体Fc y RIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于 酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fc γ RIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪
氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如，DaSron ,免疫学年评(Armu. Rev. Immunol). 15
203-234(1997)) ο FcR 的综述参见例如 Ravetch 和 Kinet,免疫学年评(Annu. Rev. Immunol.) 9 :457-492(1991) ；Capel 等，免疫方法(Immunomethods) 4 :25-34 (1994)；及 de Haas等，实验室临床医学杂志(J. Lab. Clin. Med. 126) :330-41 (1995)。术语“FcR”在本文 中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。术语“Fe受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn,它负责将母体IgG转移 给胎儿(Guyer等，免疫学杂志(J. Immunol. ) 117 =587(1976)和Kim等，免疫学杂志 (J. Immunol.) 24 :249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对Fcfoi的结合的方法是 已知的(参见例如 Ghetie 和 Ward.，今日免疫学(Immunol. Today) 18(12) :592-598(1997)； Ghetie 等，自然生物技术(Nature Biotechnology), 15(7) :637-640(1997) ；Hinton 等，生 物化学杂志(J. Biol. Chem. )279(8) :6213-6216(2004) ；WO 2004/92219 (Hinton 等))。可测定人Fcfoi高亲和性结合多肽与人Fcfoi的体内结合和血清半衰期，例如在表 达人Fcfoi的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长 类动物中。W000/42072 (Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例 如 Shields 等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 9 (2) :6591-6604(2001) “补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径 的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其 关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如(iazzano-SantOTo等，免疫方法 杂志(J. Immunol. Methods) 202 163 (1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具 有变异Fc区的多肽)及提高或降低的Clq结合能力的多肽变体记载于例如美国专利号 6，194，551B1 和 W01999/51642。还可参见例如 Idusogie 等，免疫学杂志(J. Immunol.) 164 4178-4184(2000)。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和性与没有这些改变的母体抗体相比有所提高的抗体。在一个实施方 案中，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和性。亲和力成 熟的抗体可通过本领域已知方法来生成。Marks等，生物/技术(Bio/Technology) 10 779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和性成熟。以下文献记载了 CDR和/或构架残基的随机诱变=Barbas等，美国国家科学院学报(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 91 :3809-3813(1994) jchier 等，基因(Gene) 169 147-155 (1995) ；Yelton 等，免疫学 杂志(J. Immunol.) 155 :1994-2004(1995) Jackson 等，免疫学杂志(J. Immunol.) 154(7) 3310-9 (1995)；及 Hawkins 等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 226 :889-896 (1992)。抗体的“功能性抗原结合位点，，指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原 结合亲和性不必像衍生该抗原结合位点的母体抗体那样强，但是结合抗原的能力必须是使 用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外，本文中多价抗体的 每个抗原结合位点的抗原结合亲和性不必定量相同。对于本文中的多聚体抗体，功能性抗 原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估。依照这种分析方法，将靶抗原与多聚体 抗体以不同比例混合，并计算复合物的平均分子量，其中假设不同数目的功能性结合位点。 将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指具有该指定抗体区别于其它结合相同抗 原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。为了筛选这样的抗体，其结合由目的抗体结合的抗原的表位，可以实施常规交叉 阻断测定法，诸如抗体，实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港实验室， Ed Harlow 和 David Lane (1988)中所记载的。术语“拮抗剂”在用于本文时指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰本发明蛋 白质的活性(包括其与一种或多种受体的结合(在配体的情况中)或与一种或多种配体的 结合(在受体的情况中)的分子。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、 糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译 控制序列等。拮抗剂还包括本发明蛋白质的小分子抑制剂、和融合蛋白、特异性结合蛋白质 由此使其隔绝(sequester)与其靶标结合的受体分子及衍生物、蛋白质的拮抗性变体、针 对本发明蛋白质的反义分子、RNA适配体、和针对本发明蛋白质的核酶。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗 体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。术语“VEGF”和“VEGF-A”可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因 子及相关的121个、145个、183个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如 Leung 等科学(Science)，M6 :1306(1989) ；Houck 等分子内分泌学(Mol. Endocrin.)，5 1806(1991)；及 Robinson龁tringer，细胞科学杂志(Journal of Cell Science)，144 (5) 853-865(2001)所记载的，及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、 VEGF-C, VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲 和性受体酪氨酸激酶，即VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2 (Flk_l/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮 细胞有丝分裂信号的主要递质。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种(诸如小鼠、 大鼠或灵长类动物)的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用如下术语表示，诸如hVEGF表 示人VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。“截短的”天然VEGF 的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸 (甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF 相当的对KDR和Flt-I受体的结合亲和性。"VEGF拮抗齐『指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一 种或多种VEGF受体的结合)的分子(肽基或非肽基)。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其 抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生 物(例如可溶性VEGF受体蛋白质或其VEGF结合片段、或嵌合VEGF受体蛋白质)、抗VEGF 受体抗体和VEGF受体拮抗剂(诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂)、及融合蛋白(例 如 VEGF-Trap (Regeneron) ,VEGF121-多花白树毒蛋白(Peregine))。VEGF拮抗剂还包括VEGF 的拮抗性变体、针对VEGF的反义分子、RNA适配体、和针对VEGF或VEGF受体的核酶。可用 于本发明方法的VEGF拮抗剂进一步包括特异性结合VEGF的肽基或非肽基化合物，诸如抗 VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF的多肽或其片段；至少与编码VEGF多肽的 核酸分子的片段互补的反义核碱基(nucleobase)寡聚物；至少与编码VEGF多肽的核酸分 子的片段互补的小RNA ；靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体(ρ印tibody)；及VEGF适配体。 在一个实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在另一个实施方案中，受到VEGF拮 抗剂抑制的 VEGF 是 VEGF (8-109)、VEGF (1-109)或 VEGF165。术语“抗VEGF抗体”或“结合VEGF的抗体”指能够以足够亲和性和特异性结 合VEGF的抗体，该抗体在靶向VEGF中可用作诊断剂和/或治疗剂。例如，本发明的抗 VEGF抗体可在靶向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治疗剂。参见例如美 国专利 6，582，959，6，703，020 ；W098/45332 ；W096/30046 ；W094/10202 ；W02005/044853 ； EP0666868B1 ；美国专利申请 20030206899,20030190317,20030203409,20050112126, 20050186208 和 20050112126 ;Popkov 等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods) 288 :149-164(2004)；及W02005012359。所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够 强的结合亲和性，例如所述抗体可以以介于IOOnM-IpM之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲和 性可以通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开 号TO2005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来 测定。所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此 类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。实例包括HUVEC抑 制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如W089/06692所记载的)；抗体依赖性细胞的 细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5，500，36 ；及激动性 活性或造血测定法(参见W095/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸 如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不结合其它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。在 一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体 A4. 6. 1结合相同表位的单克隆抗体；重组人源化抗-VEGF单克隆抗体(见I^esta等(1997) 癌症研究(CancerRes.) 57 :4593-4599)，包括但不限于称为“贝伐珠单抗(BV) ”、也称为 "rhuMAb VEGF”或“AVASTIN ”的抗体。贝伐珠单抗包含突变的人IgGl构架区和来自鼠抗体 A. 4. 6.1(其阻断人VEGF结合其受体)的抗原结合互补性决定区。贝伐珠单抗大约93%的氨基酸序列(包括大部分构架区)衍生自人IgGl，而大约7 %的序列衍生自A4. 6. 1。贝伐珠 单抗具有约149，000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF 抗体进一步记载于2005年2月沈日授权的美国专利号6，884，879。其它抗-VEGF抗体包 括G6或B20系列抗体(例如G6-23、G6-31、B20-4. 1)，如PCT申请
发明者埃伦·菲尔瓦罗夫, 布朗东·威利斯, 纳波莱奥内·费瑞拉 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司