专利名称：一种同时检测人血液中的11个运动相关基因和4个内参基因的基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及同时检测人血液中的11个运动相关基因和4个内参基因表达情况的 方法，属于医学分子生物学领域。
背景技术：
基因在不同个体不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多 样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较个体间基因表达的差 异能为我们揭示生命个体间某种能力的差异提供依据。我们研究运动员的运动相关基因表 达情况，与非运动员对比分析，就能在一定程度上从分子水平揭示运动员之所以运动成绩 优秀的原因。人的睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF, NM_000614) 有良好的促运动神经元生长作用，对外伤后运动神经元胞体的变性、死亡显示出明显的预 防作用，并可调节血糖和血脂代谢，改善胰岛素水平(Sendtner M, Schmalbruch H,St6ckli KA, et al. Ciliary neurotrophic factor prevents degeneration of motor neurons inmouse mutant progressive motor neuronopathy. Nature. 1992,358(6386) :502_504)。 肾上腺素能 0 2 受体(adrenergic，beta-2-rec印tor，ADRB2, NM_000024)基因通过调控 ADRB2与儿茶酚胺的结合位点而发挥调节脂肪水解供能作用，而脂肪水解供能又是耐力运 动的重要能量代谢途径。(Wolarth B, Rivera MA, Oppert JM, et al. A polymorphismin the alpha2a-adrenoceptor gene and endurance ethlete atatus. Med Sci Sports Exerc. 2000，32 (10) : 1709-1712.)。瘦素受体(1 印tin receptor, LEPR, NM_002303)通过与 瘦素结合影响一系列机体代谢过程，如胰岛素的释放，葡萄糖的产生、转运、代谢及脂肪的 分角军合成等(Cohen SL, Halaas JL, Friedman JM, et al. Human leptincharacterization. Nature. 1996,382(6592) 589.)。转化生长因子 (transforminggrowth factor, beta 1，TGFB1, NM_000660)生物学功能异常复杂，在多种组织细胞的增殖分化、间质形 成、组织损伤修复、骨质再生、胚胎发生中起着关键性作用(李翠玲，崔正言.转化生长 因子0分子生物学研究进展.国外医学，免疫学分册.1995，(3) :124-127.)。线粒体 解偶联蛋白2(uncoupl ing protein 2, UCP2, NM_003355)的主要功能是参与线粒体 ATP 生成和活性氧的调控(Boss 0，Hagen T, Lowell BB. Uncouplingproteins 2 and 3 potential regulators of mitochondrial energymetabolism. Diabetes. 2000,49(2) 143-156)。磷酸脂酶 C-y l(phospholipase C, gamma 1, PLCG1, NM_002660)是磷脂酰肌 醇信号通路的关键酶，在机体内分布极为广泛，在各种细胞中广泛存在，许多细胞外因子， 如细胞表面抗原、免疫球蛋白、细胞因子、生长因子等都可以借助该酶的生化途径作用于 MMAM^MMiXM (Rebecchi MJ, PentyalaSN. Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipaseC. Physiol. 2000,80 (4) : 1291-1335)。肿瘤 if^Eia^1 (tumor necrosis factor, TNFsuperfamily, member 2, NM_000594) ^WrSW 生物学功能，运动可以改变机体和细胞内的能量代谢状态，TNF-a可能做为一种重要的调
3节因子参与机体的能量代谢的调节过程(焦广发，何玉秀.运动对肿瘤坏死因子_a的 影响研究进展.中国运动医学杂志.2007，26(1) :116-119)。结合珠蛋白(haptoglobin NM_005143, HP)是一种重要的血管生成因子，它促进新生血管的内皮细胞生长和分化， Hp对侧枝血管的发育和组织修复也具有重要意义，Hp还具有调节机体免疫功能和抗菌作 用等生物学功能(De Kleijn DP, SmeetsMB, Kemmeren PP, et al. Acute-phase protein haptoglobin is a cell migration factorinvolved in arterial restructuring.FASEB J. 2002，16(9) : 1123-1125)。RAD1同源物(RAD1,NM_002853)在保持基因组稳定性方面发挥 重要监视作用，它既可以监视损伤激活细胞周期的调控，又在单碱基切除修复中发挥作用 (Guan X,Bai H,Shi G,et al,Thehuman checkpoint sensor Rad9-Radl_Husl interacts with and stimulates NEILlglycosylase. Nucleic Acids Res. 2007，35(8) :2463_2472)。 缺氧诱导因子 la (hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit ；HIF1A, NM_001530)是 在哺乳动物组织中广泛存在的转录因子，组织处于缺氧状态时它发挥重要的转录和基因调 控作用，在运动员耐力训练中，骨骼肌中最先对缺氧状态发生反应的是HIF1A，它可以在分 子水平上调糖酵解，促进组织适应缺氧环境(Mason S, Johnson RS. The role of HIF-1 in hypoxicresponse in the skeletal muscle. Adv Exp Med Biol. 2007,618 :229_244)。姨 岛素样生长因子 1 (insulin-like growth factor 1，IGF1，NM_000618)作用于关节软骨， 可刺激软骨细胞分裂增殖，作用于肌肉，可以刺激肌肉蛋白合成，促进细胞分化，促进成肌 细胞和肌管生长，加速创伤肌肉的愈合(陈世益，李云霞，马昕，等.外源性胰岛素样生长因 子-2促进骨骼肌损伤修复的实验研究.中国运动医学杂志.2002，21 (4) :340-345)。这些 基因在血液中都有表达。内参基因是在所有细胞中均表达的一类基因，在PCR反应中它的产量和模板量成 正比。一般选择管家基因作为内参基因。因为管家基因表达水平受环境因素影响较小，在 个体各个生长阶段和几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启 动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。在我们的体系中选择的四个 管家基因为组蛋白脱乙酰化酶(Histone deacetylase HD1U50079)、3_磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDHNM 002046)、18s-rRNA(M10098)禾P 3 -肌动蛋白(beta-actin，NM_001101)。基因表达检测的传统技术是实时荧光定量PCR技术，但这种方法只适合做单重的 反应，如果做多个基因的表达，就需要逐个检测，非常繁琐，且检测过程中的误差很难控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时检测11个运动相关基因和4个内参基因的基因 (见表1)表达的方法。它必须使体系中15个基因的表达情况能同时检测到，而且通过精细 调整每条引物浓度，使体系各个基因的表达峰高适当，易于检测。表1本发明所涉及的11个运动相关基因和4个内参基因的基因 本发明所述方法的基本原理为此方法建立在Beckman的GenomeLab GeXP基因 表达系统之上，它将多重PCR技术和毛细管电泳技术结合起来，能够对多至25重的RT-PCR 反应产物进行定量分析比较。采用通用引物与特异引物相结合的方法，来保持反应体系中 各模板DNA的比例在扩增过程中不变，从而实现多重PCR产物定量检测的目的。在RT反应 时，每个RNA通过含有基因特异序列的杂合反向引物进行反转录为第一链cDNA ；在PCR反 应的前几个循环，含有基因特异序列的杂合引物起作用；在随后的PCR反应中，高浓度的通 用引物起作用，统一扩增所有目的片段；通用引物5’末端标记有荧光，从而可以进行定量 检测。此方法可以同时处理数千个样本，其起始RNA用量可以低至20ng，是一种敏感的、灵 活的和可重复的基因定量表达分析技术。本发明的详细描述本发明所述的方法，它包括下述步骤(1)提取基因组RNA用传统的Trizol方法，具体步骤为1)取新鲜抗凝血1ml，与Hank’ s液1 1混勻后，小心加于2ml的粒细胞分离液 的液面上，以1500r/min离心(半径15cm水平转子)15min，2)收集界面上的细胞，放入含Hank’ s液4_5毫升的试管中，充分混勻后，以 1500-2000r/min离心lOmin。收集细胞，沉淀用生理盐水反复洗2次即得所需细胞。
5
3)在细胞沉淀中加lmlTrizol，混勻后放入_80°C冰箱，于实验前拿出来进行下面 的步骤。4)加入0.2ml氯仿，小心盖盖，用手使劲振荡管子15s，室温放置2到3min， 4°C 12000g离心15min。离心后，混合物分散成暗红色苯酚氯仿相，界面上面是无色的水相， RNA在水相中。水相量大约有所用Trizol量的60%。5) RNA纯化转移上清到一个新管子，用异丙醇沉淀RNA，加0. 5ml异丙醇，室温孵 育10min，4°C 12000g离心8min。离心前RNA沉淀经常看不到，离心后形成胶状小球。6)RNA洗涤弃上清，加75%乙醇1毫升，涡旋后4°C 7500g离心5min。弃上清后 室温干燥5-lOmin。不要让其完全干燥，否则会降低其可溶性。7)复溶RNA 加无RNA酶的水或0. 5% SDS溶液，吹吸几次，55_60°C孵育lOmin。 也可复溶于100%甲酰胺，-70°C冻存。8)去DNA 加DNA酶处理，37 °C 30min，然后加反应终止液。9)最后用DU800检测RNA纯度及浓度，-80 V冰箱保存。(2)设计引物睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF, NM_000614)、肾上腺素能 32 受体(adrenergic, beta-2-, receptor, surface, ADRB2, NM_000024)、瘦素受体(1印tin receptor, LEPR, NM_002303)、转化生长因 子-0 1 (transforming growth factor, beta 1，TGFB1，NM_000660)、线粒体解偶联蛋 0 2 (uncoupling protein 2， UCP2， NM_003355)、憐酸月旨醇 C-gammal (phospholipase C, gamma 1, PLCG1, NM_002660)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF superfamily, member2，NM_000594)、结合珠蛋白(haptoglobin NM_005143，HP)、RAD1 homolog(RADl, NM_002853)、缺氧诱导因子 1 a (hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit ；HIF1A, NM_001530)、胰岛素样生长因子 1 (insulin-like growth factor 1，IGF1，NM_000618)等基 因的表达可能和人的运动能力紧密相关。设计RT引物和PCR引物，设计完后序列交由北京 赛百盛生物有限公司合成，HPLC纯化，-80°C储存备用。表2本发明所设计RT弓丨物和PCR弓丨物
注左为PCR引物，右为RT引物。(3)准备样品RNA 全血标本采自国家优秀运动员，RNA用传统的Trizol方法提 取。实验前加RNA到反应中，以保证反应体系中的RNA量达到20 200ng，通常我们检测所 需RNA浓度为80 lOOii g/iU，稀释后加到反应体系中。(4)进行RT-PCR，反应液配置如下反应混合液加入量
(7)本方法在建立过程中先用每对引物做针对单个基因的单重反应，以确定每
1. Ou L 0. 5u L
38. 5u L 40. 0 u L
GeXP基因表达检测系统(BECKMAN公对引物确实有效。确定每对引物均可以扩增出预期的片段后，就可以做多重反应的实 验。将所有的RT引物混合到一起，再将所有的PCR引物混合到一起，每条RT引物的使 用浓度为500nmol/L，PCR引物的使用浓度为200nmol/L。进行一次多重反应后，分析经 GenomeLab GeXP仪器电泳后每个基因的表达峰。峰太高超过检测限的，则降低此弓|物浓度； 反之，峰太低，不利于检测的，也可以增加引物的浓度。增加和降低只是针对RT引物说的， PCR引物不需要改变。具体方法是先将峰高合适的基因的引物混合到一起，然后将需要稀 释的引物混合到一起，倍比稀释后分别加到不需要稀释的引物的混合物中，而需要加倍的 引物也按照2倍、3倍、4倍加到引物混合物中，然后将这若干反应管同时进行多重的实验， 最后一起分析表达峰，看需要稀释和加倍的引物在哪个浓度为最适浓度。通常需要加倍的 引物不要超过5倍，而需要稀释的引物可以稀释到比较低的浓度。
图1-图5中，横坐标数字表示分子量标准即碱基数(Size)，纵坐标表示 检测到的荧光强度(Dye signal)，即表达产物的峰高。图1中后4个图分别是无模板的阴性对照和NM_000614，M10098, NM_000660单重 PCR反应后遗传分析系统检测结果。图 2 中的四个图分别是 NM_005143、NM_002853、NM_000618 和 NM_001530 单重 PCR
反应后遗传分析系统检测结果。图 3 中的四个图分别是 U50079、NM_002046、NM_000024 和 NM_002303 单重 PCR 反
应后遗传分析系统检测结果。图 4 中的四个图分别是 NM_000594、NM_002660、NM_003355 和 NM_001101 单重 PCR
反应后遗传分析系统检测结果。图5多重PCR反应后GenomeLab GeXP遗传分析系统检测结果。(三)有益效果本发明所述的方法把多重PCR技术和毛细管电泳技术结合起来，能够对多至25重 的RT-PCR反应产物进行定量分析比较。采用通用引物与特异引物相结合的方法，来保持反 应体系中各模板DNA的比例在扩增过程中不变，从而实现多重PCR产物定量检测的目的。多 重PCR反应广泛存在引物间、引物和产物间，及产物间的相互作用，经常严重影响体系中各 个产物的生成。本体系经过多次摸索可同时扩增15个基因，且效果非常理想。该方法与实时荧光定量PCR的检测方法相比，通量高，结果判断方便直观，反应快 速，因体系中有四个内参基因的参与，因而可有效控制体系的系统误差，使结果准确可靠。本发明实验所用引物由赛百胜公司合成，Trizol购自美国invitrogen，灭菌双蒸 水(无核酸水)购自美国Promega公司，分析纯的异丙醇、无水乙醇和氯仿为北京化工厂产 品，其余试剂、溶液除已标明来源外均购自美国Beckman Coulter公司。
实施例以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1用本发明所述的方法同时检测运动员共182名，男92名，女90名。非运 动员对照21名，男10名，女11名。发现运动员和非运动员对照之间基因表达存在差异，如 下表，TNF、CNTF、ILF1、TGFB、和HIF1A的表达有统计学差异。表3所有运动员和对照组相对基因表达量统计分析结果
9
序列表
<110>中国人民解放军总医院
<120>—种同时检测人血液中的11个运动相关基因和4个内参基因的基因表达的
<160>30
<210>1
<211>38
<212>DNA
〈213〉人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增TO0079基因的PCR引物 <400>1
AGGTGACACT ATAGAATAGG ATCGGTTAGG TTGCTTCA 38 <210>2 <211>39 <212>DNA
<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增TO0079基因的RT引物<400>2GTACGACTCA CTATAGGGAA GCATCAGCAT AGGCAGGTT 39<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增002046基因的PCR引物<400>3AGGTGACACT ATAGAATACC TCCAAGGAGT AAGACCCC 38<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_002046基因的RT引物<400>4GTACGACTCA CTATAGGGAA GGGGAGATTC AGTGTGGTG 39<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000614基因的PCR引物<400>5AGGTGACACT ATAGAATAAC CTTCCATGTT TTGTTGGC 38<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000614基因的RT引物<400>6GTACGACTCA CTATAGGGAA TCTGGTATGC AAAGGCAGC 39<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000024基因的PCR引物<400>7AGGTGACACT ATAGAATATG TCCTTCTACG TTCCCCTG 38
<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000024基因的RT引物<400>8GTACGACTCA CTATAGGGAT CCACCTGGCT AAGGTTCTG 39<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_002303基因的PCR引物<400>9AGGTGACACT ATAGAATAAA TTGGAGCAAT CCAGCCTA 38<210>10<211>39<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_002303基因的RT引物<400>10GTACGACTCA CTATAGGGAC ATCAGGGGCT TCCAAAGTA 39<210>11<211>38<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增M10098基因的PCR引物<400>11AGGTGACACT ATAGAATAAA ACGGCTACCA CATCCAAG 38<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增M10098基因的RT引物<400>12GTACGACTCA CTATAGGGAC CTCCAATGGA TCCTCGTTA 39<210>13<211>38<212>DNA<213>人工序列0172]<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000660基因的PCR引物
0173]<400>13
0174]AGGTGACACT ATAGAATAGT ACCTGAACCC GTGTTGCT 38
0175]<210>14
0176]<211>40
0177]<212>DNA
0178]<213>人工序列
0179]<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000660基因的RT引物
0180]<400>14
0181]GTACGACTCA CTATAGGGAA GATAACCACT CTGGCGAGTC 40
0182]<210>15
0183]<211>38
0184]<212>DNA
0185]<213>人工序列
0186]<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_001101基因的PCR引物
0187]<400>15
0188]AGGTGACACT ATAGAATAGT CCACCTTCCA GCAGATGT 38
0189]<210>16
0190]<211>39
0191]<212>DNA
0192]<213>人工序列
0193]<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_001101基因的RT引物
0194]<400>16
0195]GTACGACTCA CTATAGGGAA AAGCCATGCC AATCTCATC 39
0196]<210>17
0197]<211>38
0198]<212>DNA
0199]<213>人工序列
0200]<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_003355基因的PCR引物
0201]<400>17
0202]AGGTGACACT ATAGAATACT TTCCCCACCT CTTCCTTC 38
0203]<210>18
0204]<211>39
0205]<212>DNA
0206]<213>人工序列
0207]<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_003355基因的RT引物
0208]<400>18
0209]GTACGACTCA CTATAGGGAA GGACGAAGAT TCTGGCTGA 39
0210]<210>19<211>38 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_002660基因的PCR引物 <400>19
AGGTGACACT ATAGAATAGA AGCGGAATGA ACCCAACT 38 <210>20 <211>39 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_002660基因的RT引物 <400>20
GTACGACTCA CTATAGGGAG GATAGCGCAG CTTCATCTT 39 <210>21 <211>38 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000594基因的PCR引物 <400>21
AGGTGACACT ATAGAATAGG AGCCAGCTCC CTCTATTT 38 <210>22 <211>39 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000594基因的RT引物 <400>22
GTACGACTCA CTATAGGGAG GCTACATGGG AACAGCCTA 39
<210>23
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_005143基因的PCR引物 <400>23
AGGTGACACT ATAGAATAAG CTGTGCTGTG GCTGAGTA 38
<210>24
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_005143基因的RT引物<400>24
GTACGACTCA CTATAGGGAA CCCATCAGCT TCAAACCAC 39
<210>25
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_002853基因的PCR引物 <400>25
AGGTGACACT ATAGAATAGA AGTTCGAGAT CAGCCTGG 38 <210>26 <211>39 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_002853基因的RT引物 <400>26
GTACGACTCA CTATAGGGAG GAGTCTTGCT CTGTCACCC 39
<210>27
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_001530基因的PCR引物 <400>27
AGGTGACACT ATAGAATACC TTGGATGGTT TTGTTATGG 39 <210>28 <211>39 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_001530基因的RT引物 <400>28
GTACGACTCA CTATAGGGAA AGCTTCGCTG TGTGTTTTG 39
<210>29
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000618基因的PCR引物 <400>29
AGGTGACACT ATAGAATAAC CTCCTGGGTT TAAGCGAT 38
<210>30
<211>39
15
<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增NM_000618基因的RT引物<400>30GTACGACTCA CTATAGGGAT TAAGAGGGAA CACATGGGC 39
权利要求
一种同时检测人血液中的11个运动相关基因和4个内参基因的基因表达的方法，其特征在于这些基因是人的睫状神经营养因子基因、肾上腺素能β2受体基因、瘦素受体基因、转化生长因子-β1基因、线粒体解偶联蛋白2基因、磷酸脂酶C-γ1基因、肿瘤坏死因子基因、结合珠蛋白基因、RAD1同源物基因、缺氧诱导因子1α基因和胰岛素样生长因子1基因，四个内参基因为组蛋白脱乙酰化酶基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因、18s-rRNA基因和β-肌动蛋白基因，其表达的方法包括下述步骤(1)设计针对每个基因的RT引物和PCR引物如序列1～30所述序列；(2)委托生物公司合成引物，并用HPLC纯化；(3)收集优秀运动员全血标本并提取样品RNA，在PCR仪上进行RT和PCR反应；(4)将PCR反应产物上样到BECKMAN公司的GenomeLabTM GeXP多重基因表达遗传分析系统仪器上，通过毛细管电泳分离PCR产物；用多重基因表达遗传分析系统上配套软件eXpressMap分析结果，导出数据。
2.根据权利要求1所述一种同时检测人的11个运动相关基因和4个内参基因的基因 表达的方法，其特征在于所述的RT反应时引物的浓度如下
全文摘要
本发明提供了一种同时检测人血液中的11个运动相关基因和4个内参基因的基因表达的方法。本发明的方法是运用多重PCR、通用引物和核酸杂交的方法在同一反应体系中实现了同时对15个基因表达情况的检测。这些基因是人的睫状神经营养因子基因、肾上腺素能β2受体基因、瘦素受体基因、转化生长因子-β1基因、线粒体解偶联蛋白2基因、磷酸脂酶C-γ1基因、肿瘤坏死因子基因、结合珠蛋白基因、RAD1同源物基因、缺氧诱导因子1α基因和胰岛素样生长因子1基因；还有四个内参基因为组蛋白脱乙酰化酶基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因、18s-rRNA基因和β-肌动蛋白基因。本发明所述的方法与传统的实时荧光定量PCR等检测方法相比，具有高通量，快速，自动化程度高，成本适中，准确度和灵敏度高等优点。
文档编号C12Q1/68GK101851674SQ20101010075
公开日2010年10月6日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者李立青, 田亚平 申请人:中国人民解放军总医院