专利名称：一种产氧化型pva水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产PVA 水解酶(oxidized polyvinyl alcohol hydrolase, EC 3. 7. 1. 7，简称ΟΡΗ)的基因工程菌及其构建方法与应用，特别是一种高产氧化型PVA水解酶 的基因工程菌及构建方法与应用，属于纺织生物技术领域。
背景技术：
PVA (全称polyvinyl alcohol)，即聚乙烯醇，是一种人工合成的水溶性的高分子 化合物，具有如下优良理化特性溶解性好PVA溶于水，水温越高则溶解度越大，但几乎不 溶于有机溶剂；成膜性强PVA易成膜，其膜的机械性能优良，膜的拉伸强度随聚合度、醇解 度升高而增强；粘接性好PVA与亲水性的纤维素有很好的粘接力，一般情况，聚合度、醇解 度越高，粘接强度越强；热稳定性好PVA粉末加热到100°C左右时，外观逐渐发生变化。由 于其特殊的理化性能，目前主要用于纺织行业浆料、织物整理剂、维尼纶纤维原料；建筑装 潢行业的107胶、内外墙涂料、粘合剂；化工行业用作聚合乳化剂、分散剂及聚乙烯醇缩甲 醛、缩乙醛、缩丁醛树脂；造纸行业用作纸品粘合剂；农业方面用于土壤改良剂、农药粘附 增效剂和聚乙烯醇薄膜；还可用于日用化妆品及高频皿逝等方面。纺织工业中的浆料，以PVA为主要成分，纺织品经过上浆处理，其理化性能更好、 手感更佳。但是，上浆工艺也带来了污染的问题，纺织品经过上浆后，还需要进行退浆处理， 去除纺织品上未结合的PVA，传统的退浆过程是用高温加酸/碱或是用氧化剂来破坏PVA的 长链结构使其降解，但是化学方法会对织物纤维结构造成了较大的损伤，同时退浆废水的 排放会对环境造成极大的污染，如果对污水进行处理，后续处理的费用高昂，又会增加企业 的负担。近年来人们寻求通过生物法降解PVA，提高了纺织品的质量，避免了化学法降解 PVA对植物纤维造成的损伤。目前，国内外尝试通过PVA降解酶降解PVA。PVA降解酶是一 个酶系，它们作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式报道的PVA降解酶主要包含三个种 类PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1. 1. 3. 30)、PVA脱氢酶(EC1. 1. 99. 23)和氧化型PVA水解 酶(β -双酮水解酶)(EC3. 7. 1. 7)。目前对于PVA降解的研究主要集中在三个方面1.筛 选能够降解PVA的微生物；2.纯化PVA降解酶；3.克隆与PVA降解相关的基因。氧化型PVA水解酶(β-双酮水解酶)(EC3. 7. 1.7)通过将β-二酮键切开形 成一分子的羧酸结构和一分子甲基酮结构从而降解PVA。目前，关于氧化型PVA水解酶 (β-双酮水解酶)的报道不多，2005年Wilailak Klomklang等人报道了 Sphingopyxis sp. 113P3 中 oxidized polyvinylalcohol hydrolase 的基因序列，该序列含有 1095bp，编 码364个氨基酸残基，其中包括一个信号肽和一个成熟蛋白质。(Wilailak Klomklang et al, Biochemical and molecularcharacterization of a periplasmic hydrolase for oxidized polyvinyl alcohol from Sphingomonassp. strain 113P3)。在进一步白勺石if究发 现，氧化型PVA水解酶为胞外酶，分布在周质空间内，呈组成型表达，底物特异性比较高，仅对氧化型PVA和对硝基苯酚乙酸酯(PNPA，氧化型PVA的替代物)有催化效果。氧化型PVA 水解酶的氨基酸序列中有脂肪酶共识序列，而且可以被丝氨酸蛋白特异性抑制剂(PMSF) 完全抑制，据此推断氧化型PVA水解酶为丝氨酸型水解酶。 目前，国外对氧化型PVA水解酶的研究主要侧重于其基因报道和降解机理上，关 于氧化型PVA水解酶基因工程菌的研究报道很少，关于高产氧化型PVA水解酶基因工程菌 的报道则更少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产氧化型PVA水解酶(oxidized polyvinylalcohol hydrolase, EC 3. 7. 1. 7，简称ΟΡΗ)的基因工程菌，其特征在于染色体上 携带有改造后的氧化型PVA水解酶的基因(oph基因)。所述氧化型PVA水解酶(oph)的基因序列为SEQ ID NO=I CCATGGATGTTCAAACCAGTTGTCAAGTCCCGTTCCTCTCGTTCTTTTTGTTACCTGGCAGGTTGTCTGGCTATGGTCGCTGCTACTCTGTCCTCTACTGCACAGGCTAAAT
CCGAGTGGGCATGTCCTGAAGGTTTCACTCCAAAGGCTGGCCTGAACACTGACTTTCCATCCGACGGCAAGAAACGTGCCTTTGTTGTTGTGCCTCCAAAAGATTCTGCAGGTGGTGCACCTGTATGGGTCCCTATGGTTGGTACCGTTGAGGCTACTAATTGGAACCTGAATGTGCCTCGTTCTGGTAACAATGCTAAACTGGCCGAGCACGGTTATATGGTTATCTCCCCAGTTCGTCAATGCGCTGAACAGGATCCAAACCTGGGTGCTGGCGCATGTAACGGCGTGGGTAAAGACGGTTGGACTTGGAACCCTTGGAATGACGGTCGTGCTCCAGATGCTTCTGGCGACAAATACAAAACTGATGCCGGTGACGATGTTCGTTTTCTGGAGGCTATGGTCCGTTGTGTAGGTACGAAGTGGAAGCTGGACCGTAAACGTCTGTTCCTGGGCGGTATCTCCGCTGGCGGTACTATGACTAATCGTGCCCTGCTGTTTGATTCTGAATTTTGGGCCGGCGGCATGCCAATTTCTGGTGAATGGTATTCTACCAAGGATGACGGTTCTACGGTACCTTTTCAAGAAACCCGTAAGATGGTAGCAGCTGCACCAGCAAAGATTTGGCAGGGTCGTGTTGGTCCTTATCCACTGCCATCCAAGCTGGATCCAATGGTTGTCATTACGGTGTGGGGCGGTGAAAAAGATCTGTGGGATTGTGGTCCACCTCTGGGTCTGTGCTCTGATTACCGTCCAACCACCCAAGCCTCTTCTAATTACTTTTCCTCCATTTCTAACGTGGTTCATGTCGCCTGCTCCGCTACTCATGGTCATATGTGGCCTCAAGTTAACACCGATGCTTTCAATCTGTGGGCCCTGAATACGATGGCTTCTCACCCAAAGGGTTCTTCCCCTAAAGACTTCAAGCTGACTGCCCCACCAGAGGGTTACTCTTGTAAGATTGGTCGTTTTACTGATCACTATAAGTAAGAATTC本发明要解决的另一个技术问题是提供一种氧化型PVA水解酶基因工程菌的构
建方法。为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图1 第一步氧化型PVA水解酶基因(oph)的合成方法毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达系统有着特殊的密码子偏好性，如果不对 oph基因要表达的密码子的进行一定的改造，毕赤酵母(Pichia pastoris)可能无法正确 翻译oph基因，在改造后的oph基因中加入EcoRI限制性内切酶位点和Not I限制性内切酶位点，新设计的oph基因其核苷酸序列为SEQ ID NO 1 ；本发明设计的oph基因合成工 作委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。第二步氧化型PVA水解酶(oph)重组质粒的构建为了使oph基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有乙醇氧化酶基因(AOX)的 启动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国hvitrogen公司)，利用合成的oph 基因序列5'端的EcoRI限制性内切酶位点与3'端的NotI限制性内切酶位点，将合成的 oph基因克隆入载体pPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列，这也 为氧化型PVA水解酶基因在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于pPIC9K载体中 含有卡那霉素、氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。将含有oph基因的载体与要连接的表达载体pPIC9K进行EcoRI和Not I酶切，连 接得到含有Oph基因的重组质粒pPIC9K-oph。第三步氧化型PVA水解酶基因工程菌的构建将重组质粒pPIC9K_oph电击转化宿主毕赤酵母GSl 15，构建高效表达氧化型PVA 水解酶的组成型毕赤酵母重组菌株。本步骤采用的含氧化型PVA水解酶合成基因的重组表达质粒pPIC9K_oph可转化 毕赤酵母(Pichia pastoris)，成为能分泌表达外源氧化型PVA水解酶的功能酵母菌由于 含合成基因的重组表达质粒pPIC9K-oph上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组表达质 粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPIC9K-oph可以定向整合到毕赤酵母染色体DNA 上。在外源诱导物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源oph基因，信号肽指导表达产 物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物 分泌至胞外。毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法首先接种活化后的毕赤酵母GSl 15 一环于25mL YPD液体培养基中-30°C振荡培养过夜，然后将上述培养液转入IOOmL YPD(500mL三角瓶)液体培养基中，28°C _30°C振荡培养，每隔Ih测定，培养直至菌体浓度 OD600为1. 3-1. 5，在冰水中冷却IOmin以上，然后在4°C环境下，8000r/min离心收集菌体， 用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置lOmin，如此重复步骤4三次，即无菌水洗涤 3次，用300 μ L预冷lmol/L山梨醇悬浮细胞，从而获得受体菌。然后取50 80 μ L受体菌 和5 90 μ g线性化重组表达质粒DNA混勻，电激(电压1500V 电容25yF ；电阻200 Ω ) 处理，然后涂布于卡那霉素(10ug/ml)抗性平板筛选重组子。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种氧化型PVA水解酶基因工程菌的应 用方法。为解决上述技术问题，提供如下技术方案第一步重组菌株的筛选所述重组表达质粒pPIC9K_oph上含有卡那霉素抗性基因，如果重组质粒已经整 合到染色体上，重组菌株具有卡那霉素抗性，可在含有卡那霉素的平板上生长；涂布含卡那 霉素G418抗性平板，挑取阳性转化子，对转化子进行PCR验证，阳性即为产氧化型PVA水解 酶基因工程菌。第二步菌株经培养分泌氧化型PVA水解酶培养基组成(g/L)
种子培养基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10_20，氯化钠5_15 ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12-15，生物素0. 0002-0. 0005，甲醇10-50 ；微 量元素溶液，MnSO4 · 4H20 100，ZnCl2 70，Na2MoO4 · 2H20 35，H3BO3 60，CoCl2 · 6H20 200， CuSO4 · 5H20 29，NiCl2 · 6H20 25，37% 盐酸 0. 9mL。优选培养基组成(g/L)种子培养基蛋白胨15g/L，酵母提取物8g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠10g/L ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12-15g/L，生物素0. 0002-0. 0005g/L,甲醇 10-50g/L ；微量元素溶液，MnSO4 · 4H20 100g/L, ZnCl2 70g/L, Na2MoO4 · 2H20 35g/L, H3BO3 60g/L, CoCl2 · 6H20 200g/L, CuSO4 · 5H20 29g/L, NiCl2 · 6H20 25g/L，37%盐酸 0. 9mL。培养方法种子培养接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度28 V -30 摇床转速200r/min，培养Mh ；发酵培养离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液 量为50mL的三角瓶(500mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200r/min，发酵时间3_4天。氧化型PVA水解酶酶活测定方法在30°C条件下，反应液体系中有100μ 1 50mM磷酸钾缓冲液(KPB) (ρΗ7. 5)， 800 μ 1氧化型PVA的溶液和100 μ 1酶液。分别在反应开始与反应30min中后，取100 μ 1 反应液，加入100 μ 1 lmol/L碳酸钠缓冲溶液(pHIO)和800 μ 1水，混合均勻后在300nm处 测吸光值。酶活定义在ImL反应体系里，A300每分钟降低1个单位所需要的酶量。有益效果本发明的优点在于构建了一株高效分泌表达氧化型PVA水解酶的毕赤酵母基因 工程菌，解决了氧化型PVA水解酶产量低的问题；应用该菌种生产氧化型PVA水解酶，产量 高、工艺简单、便于工业化应用，该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，提取过程简单，产 品纯度高。本发明为生物法降解PVA的研究、开发、生产工作奠定了基础，有利于早日实现 纺织品退浆工艺的清洁生产。
图1产氧化型PVA水解酶的基因工程菌的构建
具体实施例方式实施例1 氧化型PVA水解酶基因的合成氧化型PVA水解酶(oph)的基因来源于Sphingopyxis. sp. 113P中含氧化型PVA水 解酶(Opt1)基因的操纵子(GenBank No. AB190288)，其中第2053位到第3147位是编码oph 的基因。在对基因进行密码子偏好性等改造后，在其5'端及3'端分别加上EcoR I和Not I酶切位点，新设计的oph基因其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1，其合成由上海生工生物工程 有限公司来完成。SEQ ID NO. 1 CCATGGATGTTCAAACCAGTTGTCAAGTCCCGTTCCTCTCGTTCTTTTTGTTACCTGGCAGGTTGTCTGGCTATGGTCGCTGCTACTCTGTCCTCTACTGCACAGGCTAAAT
CCGAGTGGGCATGTCCTGAAGGTTTCACTCCAAAGGCTGGCCTGAACACTGACTTTCCATCCGACGGCAAGAAACGTGCCTTTGTTGTTGTGCCTCCAAAAGATTCTGCAGGTGGTGCACCTGTATGGGTCCCTATGGTTGGTACCGTTGAGGCTACTAATTGGAACCTGAATGTGCCTCGTTCTGGTAACAATGCTAAACTGGCCGAGCACGGTTATATGGTTATCTCCCCAGTTCGTCAATGCGCTGAACAGGATCCAAACCTGGGTGCTGGCGCATGTAACGGCGTGGGTAAAGACGGTTGGACTTGGAACCCTTGGAATGACGGTCGTGCTCCAGATGCTTCTGGCGACAAATACAAAACTGATGCCGGTGACGATGTTCGTTTTCTGGAGGCTATGGTCCGTTGTGTAGGTACGAAGTGGAAGCTGGACCGTAAACGTCTGTTCCTGGGCGGTATCTCCGCTGGCGGTACTATGACTAATCGTGCCCTGCTGTTTGATTCTGAATTTTGGGCCGGCGGCATGCCAATTTCTGGTGAATGGTATTCTACCAAGGATGACGGTTCTACGGTACCTTTTCAAGAAACCCGTAAGATGGTAGCAGCTGCACCAGCAAAGATTTGGCAGGGTCGTGTTGGTCCTTATCCACTGCCATCCAAGCTGGATCCAATGGTTGTCATTACGGTGTGGGGCGGTGAAAAAGATCTGTGGGATTGTGGTCCACCTCTGGGTCTGTGCTCTGATTACCGTCCAACCACCCAAGCCTCTTCTAATTACTTTTCCTCCATTTCTAACGTGGTTCATGTCGCCTGCTCCGCTACTCATGGTCATATGTGGCCTCAAGTTAACACCGATGCTTTCAATCTGTGGGCCCTGAATACGATGGCTTCTCACCCAAAGGGTTCTTCCCCTAAAGACTTCAAGCTGACTGCCCCACCAGAGGGT
TACTCTTGTAAGATTGGTCGTTTTACTGATCACTATAAGTAAGAATTC实施例2 含氧化型PVA水解酶(oph)基因重组质粒pPIC9K_oph的构建带有oph 基因的载体和表达载体PPIC9K分别进行Not I和EcoR I双酶切，回收后用T4连接酶进行 连接。连接反应体系为(IOyL):目的基因片断2 μ L，载体DNA2 PLaox1M连接酶Buffer 1 μ L, T4DNA 连接酶 1 μ L, ddH20 4 μ L。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下(1)无菌状态下取感受态细胞200 μ L置于无菌的微量离心管中；(2)每管加入1-2 μ L重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min ；(3) 42°C热休克90s (准确)，不要摇动离心管；(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却Ι-aiiin ；(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800 μ L ；(6)用无菌铺菌器将200 μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37°C平放20min 直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。实施例3 氧化型PVA水解酶基因工程菌的构建将表达载体pPIC9K-oph用I酶切线形化。酶切体系(50 μ L体系)重组质 粒 10 μ L，Buffer 5 μ L, Sac I 3 μ L, ddH20 32 μ L0 37°C水浴 3h，用 PCR 产物纯化试剂盒对 线形化产物进行纯化回收，电击法转化毕赤酵母GS115，具体方法如下(1)接种活化后的毕赤酵母GS115 —环于25mLYPD液体培养基中，28°C _30°C振荡 培养过夜；(2)将上述培养液转入IOOmL YPD (500mL三角瓶)液体培养基中，28°C _30°C振荡 培养，每隔Ih测定，培养直至菌体浓度0D_为1. 3-1. 5 ；
(3)在冰水中冷却IOmin以上；(4) 40C，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置 IOmin ；(5)重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次；(6)用300 μ L预冷lmol/L山梨醇悬浮细胞；(7)加入10 μ L线形化质粒，在冰水中混勻5min ；(8)放入冰预冷的无菌电转化杯(0. 2cm)中，在1500V，电击1_2次；(9)加入ImL预冷的lmol/L的山梨醇溶液；(10)取上述100-200 μ L涂布YNB平板(或离心涂布100 μ L)；(11)28°C _30°C倒置培养1-2天，挑选白色菌落。实施例4 重组菌株的筛选1、酵母重组子的G418筛选接种转化子于25mL YPD液体培养基中，28°C _30°C振荡培养过夜，离心收集菌体， 无菌水悬浮，取100 μ L分别涂布于含G418终浓度为0. 5、l、2mg/mL的YPD平板培养基上， 筛选转化子。2、双酶切验证提取转化子质粒，进行EcoR I和Nco I双酶切，对产物进行电泳验 证。3、氧化型PVA水解酶活性测定(1)重组子和空载体pPIC9K转化的毕赤酵母GSl 15分别接种于20mL YPD液体培 养基，30°C振荡培养过夜(稳定期)；(2)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入IOOmL MGY培养基(加入ImLlOOX生 物素)中；30°C，200r/min振荡培养48h ；(3)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入30mL MM液体培养基(加入300yL甲 醇，300 μ L100X生物素)中；30°C，200r/min振荡培养7天；定时进行酶活测定。氧化型PVA水解酶酶活测定方法在30°C条件下，反应液体系中有100μ 1 50mM磷酸钾缓冲液(KPB) (ρΗ7. 5)， 800 μ 1氧化型PVA的溶液和100 μ 1酶液。分别在反应开始与反应30min中后，取100 μ 1 反应液，加入100 μ 1 lmol/L碳酸钠缓冲溶液(pHIO)和800 μ 1水，混合均勻后在300nm处
测吸光值。酶活定义在ImL反应体系里，A300每分钟降低1个单位所需要的酶量。实施例5 重组菌株的培养种子培养基蛋白胨15g/L，酵母提取物8g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠10g/L ；发酵培养基酵母氮源基础培养基12_15g/L，生物素0. 0002-0. 0005g/L,甲醇 10-50g/L ；微量元素溶液，MnSO4 · 4H20 100g/L, ZnCl270g/L, Na2MoO4 · 2H20 35g/L, H3BO3 60g/L, CoCl2 · 6H20 200g/L, CuSO4 · 5H20 29g/L, NiCl2 · 6H20 25g/L，37%盐酸 0. 9mL。培养方法种子培养接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度-30 摇床转速200r/min，培养Mh ；发酵培养离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL的三角瓶(500mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200r/min，3_4天后，氧化型PVA 水解酶活力可达85U/mL。核苷酸序列表<110>江南大学<120> 一种产氧化型PVA水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1107<212>DNA<213>人工序列<400>1ccatggatgttcaaaccagttgtcaagtcccgttcctctcgttctttttgttacctggca60
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tttactgatc actataagta agaattc110权利要求
1.一种产氧化型PVA水解酶的基因工程菌，其特征在于染色体上携带有改造后的氧化 型PVA水解酶的基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述氧化型PVA水解酶的基因序列 根据毕赤酵母偏好密码子进行改造，改造后的核苷酸序列为SEQ ID NO :1。
3.一种产氧化型PVA水解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤 第一步化学合成改造后的氧化型PVA水解酶基因；第二步将含有改造后氧化型PVA水解酶基因的载体与毕赤酵母常用表达载体pPIC9K 双酶切、连接，得到含有氧化型PVA水解酶基因的重组质粒；第三步将重组质粒电击转化宿主毕赤酵母GSl 15，构建高效表达氧化型PVA水解酶的 组成型毕赤酵母重组菌株。
全文摘要
一种产氧化型PVA水解酶(oxidized polyvinyl alcohol hydrolase，EC 3.7.1.7，简称OPH)的基因工程菌及其构建方法与应用，本发明通过将合成的氧化型PVA水解酶基因连接到毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)染色体上，构建了一株高效分泌表达氧化型PVA水解酶的基因工程菌，发酵3-4天后，氧化型PVA水解酶活力可达85U/mL，解决了氧化型PVA水解酶产量低的问题。应用该菌种生产氧化型PVA水解酶，产量高、工艺简单、便于工业化应用。
文档编号C12N15/81GK102134557SQ20101010061
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者堵国成, 张东旭, 杨钰, 陈坚 申请人:江南大学