专利名称：一种可同时检测人线粒体细胞色素b基因12个位点多态性的方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测人线粒体cytb基因12个位点多态性的方法，属于基因 工程领域。
背景技术：
随着人类基因组测序计划的完成，人类已进入后基因组时代。该时代的研究重点 是个体间的遗传差异。这种差异最常见的是单核苷酸多态性(SNP)，即在基因组水平上由单 个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。这种多态性是决定人类疾病易感性的主要因素。细胞色素(Cytochrome，Cyt)是一类含有铁卟啉辅基的色蛋白，属于递电子体。 Cytb基因(Cytochrome b，Cytb)是线粒体上14747-15887的区域，是细胞色素的一种。Cytb 基因表达相应蛋白横贯膜两侧，是极端疏水性蛋白，和Cl是辅酶Q-细胞色素c还原体系中 的两个带氧化还原中心的组分(参见图1)。线粒体内膜中除Cytb外，还有cl、c、aa3，肝、肾等组织的微粒体中有细胞色素 P450 (P450也是一种b类细胞色素，辅基为原血红素IX)。细胞色素b、cl、c为红色细胞素， 细胞色素aa3为绿色细胞素。铁原子的第5、6个配位键被组氨酸咪唑基的氮原子和甲硫氨 酸的硫原子所占据，因而还原型的细胞色素c不能被氧直接氧化。在呼吸链中铁硫蛋白多 与黄素蛋白或cytb结合存在。铁硫蛋白中的铁可以呈两价(还原型)，也可呈三价(氧化 型)，由于铁的氧化、还原而达到传递电子作用。有研究(Blakely EL,Mitchell AL,Fisher N,et. al. A mitochondrial cytochrome b mutation causing severe respiratory chain enzymedeficiency in humans and yeast. FEBS J. 2005，272 (14) :3583_3592)发现Cytb 突 变会引起严重的氧化呼吸链酶缺乏，引起氧化呼吸链复合体功能不良。线粒体肌病常由基因突变直接影响线粒体电子传递链功能引起的，由于病理原因 诱导突变影响线粒体功能，其发病率约为1/8000，诊断方法常需要有乳酸盐和丙酮酸盐，尿 有机酸，磁共振，肌肉组织和亚结构，酶学，遗传学分析和运动训练测试等方法辅助。常见的 训练不耐受(Exercise intolerance)是线粒体肌病的前兆，肌肉组织电子传递链功能紊 乱常出现代偿性无氧代谢增加(乳酸生成，磷酸肌酸降解)，电子传递链自由基生成增加， ETC中电子传递和氧摄取减少，线粒体增殖减少。由于线粒体在体内广泛分布因此多器官 涉及此过程。训练不耐受是常见的但易被忽视线粒体肌病的发病指标(TarnopolskyMA， Raha S. Mitochondrial myopathies :diagnosis，exercise intolerance，andtreatment options. Med Sci Sports Exerc.2005，37(12) :2086_93)。许多研究 Cytb 突变与 运动训练不耐受(Exercise intolermce)有密切关联，并可能是肌病的发病的潜因 (Andreu AL et al. . Exercise intolerance due to mutatiohs in the cytochrome b geneof mitochondrial DNA. N Engl J Med. 1999 ；341 (14) 1037-1044 ；Andreu AL, et al. . Anonsense mutation(G15059A)in the cytochrome b gene in a patient with exerciseintolerance and myoglobinuria. Ann Neurol. 1999,45(1) 127-30 ；Andreu AL,
3et al. . Polymorphic variants in the human mitochondrial cytochrome b gene. Mol Genet Metab. 1999,67(1) =49-52.)；但直到目前，对cytb在电子传递链中的复杂功能至今 还不清楚，但是在Cybt的SNP研究中，据对www, mitomap. org注册位点信息的查询中发现， cytb基因上SNP位点的突变与许多肌病和运动不耐受相关，因此我们推测，由于Cytb与肌 肉能量代谢有重要关系，因此在运动过程中，可能因人而异，与运动能力与效果有关。聚合酶链反应(PCR)技术自建立二十余年来，得到了广泛的应用，并在此基础上 衍生了许多新的方法，如原位PCR、标记PCR、彩色PCR、反向PCR、不对称PCR、重组PCR、多重 PCR等新技术。尽管目前多重PCR技术在临床还未得到广泛的应用，但是，采用多重PCR的 方法可以在同一反应体系下同时检测多种基因，如果体系条件稳定，可应用于临床，节约人 力物力，为临床提供更多更准确的诊断信息。尽管对线粒体SNP多态性的研究众多，但作为能量代谢的重要场所，在运动能力 方面，针对线粒体SNP与运动能力的关系国内外尚没有系统的研究，可能由于缺乏敏感评 价指标或检测技术。随着基因检测技术的不断发展，mtDNA功能的研究的不断展开，将为 运动训练效果评个和损伤保护提供有效地监测手段和理论基础。线粒体SNP多态性在不 同种群中存在差异，其表现的显型也不相同。有研究发现Cytb的15497突变可引起日 本人的严重肥胖，而在意大利的高加索人种中却没有这种现象(Liguori R，et al. . The mtDNA 15497G/A polymorphism in cytochrome b in severe obese subjects from S ou thernltaly. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2006 Oct ； 16 (7) :466_70)，提示了线粒体的显 型具有人种差异，因此单纯依据国外文献报道的线粒体SNP差异是不够的，需要寻找中国 人群特异的SNP位点。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种同时对cytb基因12个多态性位点进行检测分型的方法。。(二)技术原理本发明采用的对外周血细胞线粒体SNP和mRNA检测的技术都是建立在多重聚合 酶链反应(PCR)技术上的，对SNP检测的原理如下SNP检测是多重聚合酶链反应(PCR)与 SNP-IT0荧光标记单碱基延伸分型技术相结合，通过多重聚合酶链反应(PCR)技术对特异
片段进行扩增，然后采用标签微阵列(Tag Array)方法，通过延伸引物在DNA聚合酶催化下 使所测的SNP位点标记荧光和特异标签(Tag)，多重反应通过SNPware标签微阵列板进行 空间上的区分。384孔板上每个微孔的孔底部都排列有16或52种序列已知的寡核苷酸链 或标签。板上的每个标签的序列分别与12个或48个延伸引物中一个的标签互补，另设有 4个对照用以确保结果的准确性。经过单碱基延伸反应的引物延伸产物在转移到标签微阵 列板上以后，根据液相芯片杂交技术，将和与之互补配对的标签杂交，然后依据在微孔中的 位置鉴别各SNP位点，得到的荧光产物与384孔板内标记有标签互补序列的寡核苷酸微阵 列相结合，最终的结果可由成像仪上的双色荧光读出。该技术使包含上千种SNP样品的大 项目同仅有几百种SNP样品的小项目一样取得良好效果。该系统可成功地在对大于一百万 个SNP基因型进行检测，超过96%样品的基因型精度大于99%。
(三)发明的详细描述本发明所述方法主要为通过聚合酶链反应(PCR)技术对基因特异片段进行扩 增，然后采用标签微阵列方法，通过延伸引物在DNA聚合酶催化下使所测的SNP位点标记荧 光和特异标签(Tag)，采用贝克曼公司GenomeLab SNPstream 基因分型系统进行检测，多 重反应通过SNPware标签微阵列板进行空间上的区分。贝克曼公司SNPstream 基因分型 系统384孔板上每个微孔的孔底部都排列有16或52种序列已知的寡核苷酸链或标签。板 上的每个标签的序列分别与12个或48个延伸引物中一个的标签互补，另设有4个对照用 以确保结果的准确性。经过单碱基延伸反应的引物延伸产物在转移到标签微阵列板上以 后，根据液相芯片杂交技术，将和与之互补配对的标签杂交，然后依据在微孔中的位置鉴别 各SNP位点，得到的荧光产物与384孔板内标记有标签互补序列的寡核苷酸微阵列相结合， 最终的结果可由成像仪上的双色荧光读出。从而建立同时对12个多态性位点进行检测分 型的方法。本发明所述的方法，所用到的引物和延伸引物是根据人线粒体基因库中修正后的 剑桥参考序列(Revised Cambridge Reference Sequence, rCRS)进行设计(GenBank 中识 别码为 AC_000021. 2 或 J01415. 2)。本发明所述的方法，它包括下述步骤(1)设计用于扩增含cytb基因全长的DNA片段的引物正向引物5，-CCATCGCTAACCCCACTAAA-3，；反向引物5，-TGGTACCCAAATCTGCTTCC-3，；(2)设计分别用于检测cytb基因12个位点的延伸引物(序列3 14)(按核酸序 列方向5’ -3，)。表1检测cytb基因12个位点的延伸引物_单核苷酸多检测cytb基因12个位点的延伸引物态性位点 (按核酸序列方向5’ -3’ )_15301A/CGACTGTAGGTGCGTAACTCGATTCTTTACCYTTCACTTCATCTT
15223T/AGAGCGAGTGACGCATACTAASCCYYYTCAGAYYCATTGAAYYAG
15508T/AGATAGAGTCGATGCCAGCTTTARKGGGTTGKCTRGGGTRTARTT
14783T/GCGGTAGGTTCCCGACATATAGGTCGATGARTGAGYGGYTAATTA
15535T/AGGGTCTCTACGCTGACGATATTCGGGCTTGATGTGGGGAGGGGT
14978A/GACCTGGGTGTCGATACCTACACYCGAGACGTAAAYTATGGCTGA
15662A/AGCGATCTGCGAGACCGTATCATCCTCATYCTAGYAATARTCCCY
15402T/CGTGCCGCTCGTGATAGAATTTTGAYTGTGTAGTAAGGGTGGAAG
15043A/GTGATTCTGTACGTGTCGCCTTATCTGCCTYTTCCTACACATYGG
15930A/GGATGGCGTTCCGTCCTATTTARTACACYMRTCTTGTARRCCRRA
14766T/ACGCACGTCCACGGTGATTTGTTAATTARTTTTATYAGGGGRBTA
15851A/GGCTATGATTCGCAATGCTTMACAATCYTAATCCTAATACCRAYB
(3) PCR扩增cytb全基因，PCR反应体系(总体系5 ii L)为缓冲液II 0. 5u L, 25mmol/L 氯化镁 0. 5 u L, dNTP 混合物 0. 8 u L, 5U/ u L TaKaRa 公司 Taq 酶 0. 05u L,20umol/L 正向引物 0. 05 0. 2 ii L，20 ii mol/L 反向引物 0. 05 0. 2uL,模板DNA 1 5ng，加水补足到5uL0PCR循环条件为PCR反应的主要循环条件为94 98°C变性30s ；56 65°C退火 60s，72°C延伸30 180s，共30 40个循环。最佳循环反应条件为96°C 30s ；64°C 60s, 72°C 120s，共40个循环。(4)进行单碱基延伸反应，进行荧光标记。单碱基荧光标记反应条件为DNA预变性和酶激活温度96°C 3min,然后进行DNA 变性96°C 20s，单碱基延伸40°C 11s，共46个循环。运用贝克曼公司GenomeLab SNPstream 基因分型系统对荧光强度、类型(蓝、绿 荧光)进行检测，当反应为蓝色或绿色荧光时判断为不同基因型纯合子，两种荧光同时存 在时判断为杂合子。(5)杂交，在延伸产物中加入8 ii L杂交液(50 u L杂交试剂加到850 u L杂交缓冲 液中)，混勻后取15 y L加入杂交板反应孔中，42°C杂交2h (士 15min)，扫描后判断待测样品 的基因型；本步骤(5)中待测样品的基因型判断是根据步骤(4)得到单碱基延伸产物荧光强 度和类型，每一种特征性的荧光强度和类型对应一种基因型，对照测序结果可知每一待检 样品的基因型。本发明对796个样本检测中发现，在对样本DNA扩增cytb全基因扩增、单 碱基延伸后，可在同一反应体系内同时将12个SNP位点很好的进行分型。(6)对所述的待测样品的基因型进行测序验证。测序验证过程为根据获得位点结果在对应的样本中任选一个样本，进行cytb全基因的扩增，进行 DNA测序验证。具体过程为先用普通PCR在基因扩增杂交仪上扩增目的DNA片段，总反应 体系50 ii L (去离子蒸馏水27 u L，缓冲液II 5uL,氯化镁5 y L，dNTP混合物8 y L，Taq酶 (5U/ii L)0. 5ii L，正向引物(20iiM)liiL，反向引物(20 y M) 1 y L，模板 DNA 2. 5ng)。PCR循环条件为95°C预变性120s 1个循环，96°C变性30s ；64°C退火60s，72°C延 伸120s，共40个循环。PCR结束后，以DL2000(TakaRa)DNA标准分子量为分子量标尺，取目标DNA扩增液 9 i! L和1 i! L上样缓冲液混勻，点入1 %琼脂糖(每100ml琼脂糖凝胶加5 u L北京赛百盛 基因技术有限公司的GoldView)凝胶加样孔内，以100V电压泳动15min，取下凝胶，在紫外 灯下检测扩增产物并照相。将电泳阳性条带对应的聚合酶链反应(PCR)产物45 PL送检测序，根据测序结果 可获得不同熔点曲线所对应cytb基因型。由不同核苷酸标记的荧光的类型和强度不同就 可以直接判断对应样本的基因突变类型，不再需要对以后的PCR产物进行测序。测序结 果发现，中国人群线粒体cytb基因的12个SNP位点分布为15508[T/C]C型突变分布为 44. 7%,T 型分布为 54. 2% ； 14783 [T/C] C 型突变分布为 96.8%,T 型为 3. 2% ；15535 [T/C] C型突变分布为96. 7%，T型为3.3% ；14978[A/G]A型突变分布为96. 7%，G型为3.3% ； 15662[A/G]A型突变分布分布为3. 3%，G型为96. 7%； 15043[A/G]A型突变分布为51. 5%,G型为48.6% ； 15930 [A/G]A型突变分布为44. 4%，G型为55.6% ； 14662 [A/G]A型突变分 布为 96. 7%, G 型为 3. 3% ； 15924[A/G]A 型突变分布为 0. 6%, G 型为 99. 4% ； 15851[A/G] A型突变分布为93. 7 %，G型为6.3%; 14766 [T/C] C型突变分布为85. 8 %，T型为14. 2 % ； 14668[T/C]C型突变分布为97. 3%, T型为2.7%。本发明所述的方法可用于评价人线粒体cytb基因在研究人群分布方面、以及线 粒体突变的应用。本发明有益效果本发明所述方法运用提供了一种可在同一体系中同时检测线粒体细胞色素b 基因(Cytochrome b，Cytb) 12个位点多态性的方法，位点分别为15301A/G，15223T/ C,15508T/C,14783T/C,15535T/C,14978A/G,15662A/G,15402T/C,15043A/G,15930A/G, 14766T/C，15851A/G。它运用PCR技术结合单碱基延伸和荧光微阵列杂交技术在同一反应 体系中实现同时对线粒体cytb基因上述12个位点多态性的检测。单碱基延伸产生的荧光 强度和类型只对应一种基因型，一个多态性位点最多只会有3中特征性荧光，因此只需DNA 测序验证一次即可得出以后所有相同峰型对应样本的基因型。该方法与直接测序的检测法 相比，时间快，实验在一天内完成，通量高，在同一反应中直接测出12个多态性位点，而成 本低廉，结果判断直观。
图1细胞色素b (Cytb)在氧化呼吸链中的位置；图2本发明所述的延伸引物的设计原理图；图3用SNPstream系统检测24例中国人cytb基因12个位点分析图。本发明实验所用脱氧核苷酸、反应缓冲液、氯化镁、扩增酶(Taq酶)购自日本 TaKaRa公司，核酸外切酶I (exo I)购自新英格兰BioLabs公司，虾硷性磷酸酶(SAP)及其 缓冲液、无DNA酶和RNA酶的灭菌水购自美国Promega公司，其余试剂、溶剂及杂交板等除 已标明来源外均购自美国Beckman公司。
实施例以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1用本发明所 述的方法同时检测24例中国人cytb基因12个位点多态性。(1)设计用于扩增含细胞色素b基因全长的DNA片段的引物正向引物5，-CCATCGCTAACCCCACTAAA-3，；反向引物5，-TGGTACCCAAATCTGCTTCC-3，。(2)设计分别用于检测细胞色素b基因12个位点的延伸引物，并用不同的特异序 列标签分别标记所述的12个延伸引物(见表1和序列3 14)。(3) PCR扩增细胞色素b全基因。(4)进行单碱基延伸反应，进行荧光标记。(5)杂交，在延伸产物中加入8 ii L杂交液(50 u L杂交试剂加到850 u L杂交缓冲 液中)，混勻后取15 u L加入杂交板反应孔中，42°C杂交2h。扫描后判断待测样品的基因型。(6)对所述的待测样品的基因型进行测序验证。
本发明所述的方法，其中，步骤(3)中的PCR反应体系为表2PCR扩增cytb全基因的反应体系 PCR循环条件为PCR反应的主要循环条件为94-98°C变性30秒；56_65°C退火60 秒，72°C延伸30-180秒，共30-40个循环。最佳循环反应条件为96°C 30秒；64°C 60秒， 72°C 120秒，共40个循环。单碱基荧光标记反应条件为DNA预变性和酶激活温度96°C 3分钟，然后进行DNA 变性96°C 20秒，单碱基延伸40°C 11秒，共46个循环。运用SNPstream系统对荧光强度、类型(蓝、绿荧光)进行检测，当反应为蓝色或 绿色荧光时判断为不同基因型纯合子，两种荧光同时存在时判断为杂合子。本发明所述的方法，其中，所述的步骤(5)中待测样品的基因型判断是根据步骤 (4)得到单碱基延伸产物荧光强度和类型，每一种特征性的荧光强度和类型对应一种基因 型，对照测序结果可知每一待检样品的基因型。本研究对796个样本检测中发现，在对样本 DNA扩增cytb全基因扩增、单碱基延伸后，可在同一反应体系内同时将12个SNP位点很好 的进行分型。本发明所述的方法，其中，所述的步骤(6)中测序验证过程为根据获得位点结果在对应的样本中任选一个样本，进行cytb全基因的扩增，进行 DNA测序验证。具体过程为先用普通PCR在基因扩增杂交仪上扩增目的DNA片段，反应体 系 50ii L。表3DNA测序验证所使用的反应体系
去离子蒸馏水27缓冲液II5氯化镁5脱氧核苷酸混合物8Taq 酶(TaKaRa 公司)(5U/ u 1) 0. 5正向引物(20iiM)1反向引物(20iiM)1模板 DNA2. 5ng
总体系50_PCR循环条件为95°C预变性120秒1个循环，96°C变性30秒；64°C退火60秒， 72°C延伸120秒，共40个循环。PCR结束后，以DL2000(TakaRa)为分子量标尺，取目标DNA扩增液9 ii L和1 ii L上 样缓冲液混勻，点入1 %琼脂糖(每100m琼脂糖凝胶加5 u L北京赛百盛基因技术有限公 司的GoldView)凝胶加样孔内，以100V电压泳动5分钟，再以50V电压泳动1小时，取下凝 胶，在紫外灯下检测扩增产物并照相。将电泳阳性条带对应的PCR产物45 PL送北京诺赛基因生物公司测序，根据测序 结果可获得不同熔点曲线所对应cytb基因型。由荧光的类型和强度就可以直接判断对应 样本的基因突变类型，不再需要对以后的PCR产物进行测序。测序结果发现，中国人群线粒 体cytb基因的12个SNP位点分布为15508T/C :CC型为44. 7%，TT型为54. 2% ； 14783T/ C :CC 型为 96. 8%，TT 型为 3.2% ；15535T/C :CC 型为 96. 7%，TT 型为 3.3%; 14978A/G :AA 型为 96. 7%，GG 型为 3. 3% ； 15662A/G :AA 型为 3. 3 %，GG 型为 96. 7 % ； 15043A/G :AA 型 为 51. 5 %，GG 型为 48. 6 % ； 15930A/G :AA 型为 44. 4%，GG 型为 55.6%; 14662A/G :AA 型为 96. 7%，GG型为 3. 3%;15924A/G :AA型为 0. 6%，GG型为 99. 4%;15851A/G :AA型为 93. 7%, GG 型为 6. 3% ； 14766T/C :CC 型为 85. 8%，TT 型为 14.2% ； 14668T/C :CC 型为 97. 3%，TT 型为2.7%。如附图1，2所示，单碱基延伸产生的荧光强度和类型只对应一种基因型，一个 多态性位点最多只会有3中特征性荧光，因此只需DNA测序验证一次即可得出以后所有相 同峰型对应样本的基因型。该方法与直接测序的检测法相比，时间快，实验在一天内完成， 通量高，在同一反应中直接测出12个多态性位点，而成本低廉，结果判断直观。本发明所述 的方法可用于评价人线粒体cytb基因在研究人群分布方面、以及线粒体突变的应用。序列表<110>中国人民解放军总医院<120> 一种可同时检测人线粒体细胞色素b基因12个位点多态性的方法<160>14<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增含cytb基因全长的DNA片段的正向引 物<400>1CCATCGCTAA CCCCACTAAA 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述设计用于扩增含cytb基因全长的DNA片段的反向引
9物<400>2TGGTACCCAA ATCTGCTTCC 20<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15301A/G位点的延伸引物<400>3CGACTGTAGG TGCGTAACTC GATTCTTTAC CYTTCACTTC ATCTT 45<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15223T/C位点的延伸引物<400>4AGAGCGAGTG ACGCATACTA ASCCYYYTCA GAYYCATTGA AYYAG 45<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15508T/C位点的延伸引物<400>5AGATAGAGTC GATGCCAGCT TTARKGGGTT GKCTRGGGTR TARTT 45<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因14783T/C位点的延伸引物<400>6GCGGTAGGTT CCCGACATAT AGGTCGATGA RTGAGYGGYT AATTA 45<210>7<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15535T/C位点的延伸引物<400>7AGGGTCTCTA CGCTGACGAT ATTCGGGCTT GATGTGGGGA GGGGT 45<210>8
10
<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因14978A/G位点的延伸引物<400>8GACCTGGGTG TCGATACCTA CACYCGAGAC GTAAAYTATG GCTGA 45<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15662A/G位点的延伸引物<400>9AGCGATCTGC GAGACCGTAT CATCCTCATY CTAGYAATAR TCCCY 45<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15402T/C位点的延伸引物<400>10CGTGCCGCTC GTGATAGAAT TTTGAYTGTG TAGTAAGGGT GGAAG 45<210>11<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15043A/G位点的延伸引物<400>11GTGATTCTGT ACGTGTCGCC TTATCTGCCT YTTCCTACAC ATYGG 45<210>12<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15930A/G位点的延伸引物<400>12GGATGGCGTT CCGTCCTATT TARTACACYM RTCTTGTARR CCRRA 45<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因14766T/C位点的延伸引物
11
<400>13ACGCACGTCC ACGGTGATTT GTTAATTART TTTATYAGGG GRBTA 45<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述检测cytb基因15851A/G位点的延伸引物<400>14GGCTATGATT CGCAATGCTT MACAATCYTA ATCCTAATAC CRAYB 4权利要求
一种可同时检测人线粒体细胞色素b基因序列上位置为15301 A/G，15223 T/C，15508 T/C，14783 T/C，15535 T/C，14978 A/G，15662 A/G，15402 T/C，15043 A/G，15930 A/G，14766 T/C，15851 A/G 12个位点多态性的方法，它包括下述步骤(1)设计用于扩增含cytb基因全长的DNA片段的引物为为序列1～2所述核苷酸序列；(2)设计分别用于检测cytb基因12个位点的延伸引物，使用贝克曼公司的在线软件设计12个单碱基延伸引物，用于检测cytb基因12个位点的延伸引物为序列3～14所述核苷酸序列，特异序列标签为序列15～26所述核苷酸序列；(3)聚合酶链反应扩增cytb全基因；(4)进行单碱基延伸反应，进行荧光标记；(5)杂交，扫描后判断待测样品的基因型；(6)对所述的待测样品的基因型进行测序验证。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的聚合酶链反应反应体 系为
3.根据权利要求1，2所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的PCR循环条件为 PCR反应的主要循环条件为94 98°C变性30秒；56 65°C退火60秒，72°C延伸30 180秒，共30 40个循环。最佳循环反应条件为96°C 30秒；64°C 60秒，72°C 120秒，共 40个循环。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的单碱基荧光标记反应条件为DNA预 变性和酶激活温度96°C 3分钟，然后进行DNA变性96°C 20秒，单碱基延伸40°C 11秒，共 46个循环。
5.根据权利要求1 4之任一项权利要求所述的方法在评价线粒体cytb基因突变或 多态性中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可同时检测人线粒体细胞色素b基因12个位点多态性的方法。本发明所述方法运用提供了一种可在同一体系中同时检测线粒体细胞色素b基因(Cytochrome b，Cytb)12个位点多态性的方法。它运用聚合酶链反应(PCR)技术结合单碱基延伸和荧光微阵列杂交技术在同一反应体系中实现同时对线粒体cytb基因上述12个位点多态性的检测。单碱基延伸产生的荧光强度和类型只对应一种基因型，一个多态性位点最多只会有3中特征性荧光，因此只需DNA测序验证一次即可得出以后所有相同峰型对应样本的基因型。该方法与直接测序的检测法相比，时间快，实验在一天内完成，通量高，在同一反应中直接测出12个多态性位点，而成本低廉，结果判断直观。
文档编号C12Q1/68GK101851671SQ20101010071
公开日2010年10月6日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者田亚平, 董矜 申请人:中国人民解放军总医院