用于扩增鳞翅目昆虫线粒体coi基因的特异性引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于扩增鳞翅目昆虫线粒体细胞色素c氧化酶I(cytochrome?c?oxidase?I，COI)基因序列的引物对，其序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。采用本发明的扩增引物，可以有效地扩增出多种鳞翅目物种的COI基因，对鳞翅目中重大农林业害虫进行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为我国鳞翅目昆虫的种类鉴定、系统发育、种群遗传结构、群口演化历史和地理种群鉴别提供了重要工具。
【专利说明】用于扩增鳞翅目昆虫线粒体CO I基因的特异性引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一对用于扩增鳞翅目昆虫线粒体细胞色素C氧化酶I (cytochrome coxidase I ；C0I)基因的特异性引物。
【背景技术】
[0002]鳞翅目(L印idoptera)有40个以上的总科、约120个以上的科及18万种，是仅次于鞘翅目的第二大目，包括蝶类和蛾类。鳞翅目昆虫属于完全变态生物，发育过程分为卵、幼虫、蛹及成虫四个时期，是研究昆虫拟态、与寄主植物关系、翅膀模式发育生物学和昆虫生理等研究的重要模式生物。
[0003]鳞翅目昆虫绝大多数是农林业害虫，体型小者常卷叶、缀叶、吐丝结网或钻入植物组织取食危害，体型大者常食尽叶片、咬断根系或钻蛀枝干。另一方面，很多蝶类和蛾类成虫是传粉昆虫和资源昆虫，具有巨大的经济意义。不论是作为农林业主要害虫，抑或作为传粉媒介和经济昆虫，鳞翅目昆虫对人类社会都产生了深远影响。深入了解鳞翅目昆虫的起源、进化和系统发育关系，对鳞翅目虫害防治、经济昆虫种质资源的利用具有重要意义。这就需要借助快速而准确的分子手段对鳞翅目昆虫进行相关领域的研究。
[0004]近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种行之有效的方法，其中线粒体COI基因由于具有较高的进化速率已成为区分物种和研究物种进化关系的一种理想基因。因此，利用COI基因对鳞翅目昆虫进行物种鉴定和系统发育分析是一种较好的方法，目前，昆虫遗传研究过程中，扩增昆虫线粒体COI基因一般是采用已报道的通用引物，但由于其通用性较强，在实际研究过程中，扩增昆虫COI基因的同时，也往往能扩增出昆虫体表及体内杂菌的COI基因片段且扩增片段长度较短。这直接导致某些昆虫，如鳞翅目昆虫大螟的扩增效果和测序结果不理想，琼脂糖凝胶电泳检测的条带往往为双条带甚至多条带，测序峰图多为双峰。这给对鳞翅目昆虫进行大规模的遗传背景研究分析带来了阻碍。目前国际上没有专门针对扩增鳞翅目昆虫COI基因的特异性引物的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种鳞翅目昆虫线粒体COI基因扩增的特异性引物，它能满足现有技术的上述需求。
[0006]一对用于鳞翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增的引物，其序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 所示。
[0007]本发明还公开了一种鳞翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增方法，是采用上述的引物，用50μ I PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
[0008]所述的50 μ I PCR 体系是:5 μ I 10 Xbuffer (+Mg2+)，2.5 μ I dNTP (2.5mM), 3 μ I引物 LeC01-F(10 μ Μ)，3 μ I 引物 LeC0I_R(10 μ Μ)，0.5 μ I rTaq 酶(5 μ / μ I) ,2 μ I DNA 模板(10ng) ,34 μ I 双蒸水。
[0009]所述的PCR扩增条件是:94°C预变性5分钟，94°C变性I分钟15秒，53°C退火温度I分钟15秒，72°C延伸I分钟5秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。
[0010]本发明根据鳞翅目COI基因序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过比对鳞翅目不同科物种COI基因序列设计出扩增引物。采用本发明的鳞翅目线粒体COI基因的扩增引物，可以有效地扩增出鳞翅目不同科物种的COI基因序列，基本为农林业重要害虫，填补了鳞翅目COI基因没有专门的扩增引物的空白，对典型鳞翅目昆虫进行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近缘物种，为我国鳞翅目昆虫的种类鉴定、系统发育、种群遗传结构、群口演化历史和地理种群鉴别提供了重要工具。本发明涉及的扩增引物较过去通用引物有较大的优势，具体表现为:本引物能有效扩增出1200bp的COI基因片段，长度接近COI基因全长，而过去通用引物有效扩增长度一般为500-750bp，且扩增片段大多为保守区域，不利于上述研究的数据分析；同时，该引物的扩增产物可以直接进行测序，且测序峰图良好，无需借助载体连接，转化和克隆等繁琐程序，对典型鳞翅目昆虫进行大规模的遗传背景分析，能显著降低实验成本，缩短实验周期，提高实验的准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明引物对典型鳞翅目昆虫扩增效果图。1、2为斜纹夜蛾；3、4为甜菜夜蛾；5、6为大螟；7、8为二化螟；9、10为稻纵卷叶螟；11、12为美国白蛾；13、14为台湾稻螟。
[0012]图2是本发明引物对大螟COI基因扩增效果图。
[0013]图3是本发明引物扩增产物部分测序结果峰谱图。
[0014]图4是通用引物对大螟COI基因扩增效果图。
[0015]图5是通用引物扩增产物部分测序结果峰谱图。
【具体实施方式】
[0016]本发明的鳞翅目COI基因的扩增引物筛选方法共分两个步骤:1.以已经测得的鳞翅目昆虫的线粒体基因组序列中COI基因的序列为基础，通过比对找出COI基因相对保守的序列片段，设计引物；2.将合成的引物对鳞翅目昆虫COI基因进行扩增，检测其在鳞翅目中的通用性和扩增效率。
[0017]下面结合实例对发明做进一步说明:
[0018]1.样品采集:2013年8月，采集鳞翅目不同科的昆虫，主要涉及农林业上的重要害虫，包括夜蛾科，螟蛾科和灯蛾科等昆虫。
[0019]2.DNA提取:Axygen试剂盒提取DNA,具体步骤参照说明书。
[0020]3.数据来源:数据来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI，http:/www.ncb1.nlm.gov/)。
[0021]4.序列比对:利用B1Edit软件将鳞翅目昆虫的线粒体基因组全序列中COI基因的序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。
[0022]5.引物合成:根据上述的比对结果,利用引物设计软件Primer Premier 5在碱基变异度最小的序列片段设计出I对引物。引物序列为LeCO1-F:5’ GGAGCAGGAACTGGATGA3，(SEQ ID N0.1) ;LeC01-R:5’GCAGGGGGTAGATTTTGA 3，(SEQ ID N0.2)。为了验证本发明引物的特异性，我们同时合成了过去mtDNA COI的通用引物作为对照。其具体序列为:forward:5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’ (SEQ ID N0.3) ;reword:5’-TCCATGCACTAATCTGCCATATTA-3’ (SEQ ID N0.4)。
[0023]6.引物扩增:将上述扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的样本。设置PCR热循环退火温度范围为50-60°C。
[0024]7.扩增结果检测:扩增引物用I %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，该引物可以有效地扩增鳞翅目昆虫的线粒体COI基因，扩增效率达100%。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为1200bp (图1)，接近鳞翅目昆虫线粒体COI基因的全长(全长为1500bp左右)，且琼脂糖凝胶电泳检测条带较为单一(图2)，测序峰图较好(图3)。相反，通用引物扩增出的DNA片段长度约为750bp (图4)，小于本发明引物的扩增长度，而且，琼脂糖凝胶电泳检测条带大多数为多条带(图4)，测序峰谱图较乱(图5)。很明显，该通用引物不适合用于部分鳞翅目昆虫COI基因的扩增，且结果不准确。而本发明引物可以有效地扩增出鳞翅目不同科物种的COI基因序列，且测序结果较准确。
[0025]8.引物扩增条件:上述引物 50 μ I PCR 体系为:5μ1 10 Xbuffer (+Mg2+)，2.5 μ IdNTP (2.5mM)，3 μ I 引物 LeC0I_F(10 μ Μ)，3 μ I 引物 LeC0I_R(10 μ Μ)，0.5 μ I rTaq 酶(5μ/μ I), 2 μ I DNA 模板 (10ng), 34 μ I 双蒸水。
【权利要求】
1.一对用于鳞翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增的引物，其特征在于，其序列如SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.—种鳞翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增方法，其特征是采用权利要求1所述的的引物，用50 μ IPCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的50μ I PCR体系是:5 μ I1X buffer (+Mg2+), 2.5 μ IdNTP (2.5mM) , 3 μ I 弓丨物 Le⑶1-F (10 μ Μ)，3 μ I 弓丨物LeCO1-R (10 μ Μ), 0.5 μ I rTaq 酶(5 μ / μ I)，2 μ I DNA 模板(10ng)，34 μ I 双蒸水。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的特定的PCR扩增条件是:94°C预变性5分钟，94°C变性I分钟15秒，53 °C退火温度I分钟15秒，72°C延伸I分钟5秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。
【文档编号】C12N15/10GK104164433SQ201410446927
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】陆明星, 汤小天, 杜予州 申请人:扬州大学