一种利用宿主肝脏线粒体基因突变检测家畜内毒素中毒的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用宿主肝脏线粒体基因突变检测家畜体内毒素中毒的方法，不仅省时省力，而且结果可信。提取宿主肝脏线粒体DNA，设计线粒体细胞色素C氧化酶(COI)基因特异性引物，运用PCR-SSCP技术对肝脏COI基因片段进行分析并测序。内毒素中毒后的家畜样本PCR条带泳动异常，测序COI基因片段在5322和5331处同时发生T－G的置换点突变，表明宿主机体已经遭受到内毒素的中毒并产生了毒性效应。该方法重复性、特异性和敏感性较好，具有良好的应用价值。
【专利说明】—种利用宿主肝脏线粒体基因突变检测家畜内毒素中毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及家畜内毒素中毒的检测方法，具体涉及利用宿主肝脏线粒体COI基因点突变来检测家畜内毒素中毒的方法。
【背景技术】
[0002]规模化饲养家畜过程中细菌感染和滥用抗生素容易导致家畜发生内毒素中毒，内毒素中毒检测是诊断家畜疾病的重要手段。传统方法是分离制备毒素，给小白鼠灌胃，通过临床症状进行判断，或者是采集血液，用昂贵的鲎试验法进行诊断。以上两种方法费时费力，检测成本高，检测结果对于不同种类家畜不准确。
【发明内容】
[0003]本发明的目 的在于提供一种准确，快速，简便，检测成本低，易于推广应用的利用宿主肝脏线粒体基因突变检测家畜内毒素中毒的方法。
[0004]本发明公开了一种利用宿主肝脏线粒体基因突变检测家畜内毒素中毒的方法，包括肝脏mtDNA提取、mtDNA COI基因片段的扩增、PCR产物的SSCP分析和DNA序列测定步骤，其特征在于选择了肝脏线粒体基因中的细胞色素C氧化酶(COI)基因，设计了特异性引物，可以扩增该基因的5308-5611位置上的基因片段。
[0005]在上述的检测方法中，所述的mtDNA提取步骤中试剂配方如下:
(1)SE 溶液(pH: 7.8):0.25M 蔗糖、2.5mMCaC12、30mM Tris-HCl、IOmM EDTANa2 ;
(2)溶液I (TEN, ρΗ8.0):0.15Μ NaCl、IOmM EDTANa2、IOmM Tris-HCl ；
(3)溶液I1:1%SDS，其中含0.2NNa0H，现用现配，混匀，立即使用；
(4)溶液II1:3MKac，其中含3MKAc、5M冰乙酸，混匀，高压灭菌，室温保存备用；
(5)TE 溶液(pH: 8.0):10mM Tris-HCl、0.1mM EDTANa2、20ug/ml DNase-free RNase。
[0006]所述的肝脏mtDNA提取步骤如下:
(1)取样品的肝组织0.5g~1.0g，在冰预冷的SE溶液中洗去血污后转入6ml冰预冷SE中剪碎，再转入IOml离心管中，高速分散器上1500rpm匀浆3次，每次间隔20sec，每次匀衆IOsec,然后离心机上2000rpm离心15min,弃沉淀，上清转入1.5ml Eppendorf管中；
(2)Eppendorf管中的上清液12000rpm离心15min,弃上清,每管加Iml 0°C预冷的SE溶液重悬沉淀，混匀后转入第二支的eppendorf管，12000rpm离心8min,弃上清，每管加150 μ I溶液I，轻轻充分混匀，室温静置15min，每管加300 μ I新配制的溶液II，小心混匀，(TC冰箱中冰浴IOmin后，每管加4°C预冷的225 μ I溶液III，小心混匀，于0°C冰箱中冰浴30min后，12000rpm离心6min，弃沉淀，小心取上清(注意不要吸取白色物质以免造成污染)转入第三支的Eppendorf管；
(3)加入水饱和酹于第三支Eppendorf管的上清液中，混匀，上下颠倒轻轻摇动20min后，再加入氯仿-异戍醇，上下颠倒轻摇15min混匀后，12000rpm离心8min,取水相转入第四支的Eppendorf管,重复步骤(2) —至三次至液体中间层无白色物质为止；
(4)取经过步骤(3)处理后的水相于Eppendorf管中，加入2倍体积于水相的无水乙酉享，混匀，于O°C冰箱内冰浴30min, 12000rpm离心10min,弃上清,用0°C预冷的70%乙醇洗涤沉淀2-3次，每次洗涤后，12000rpm离心5min，彻底去上清，所得沉淀即为纯化的mtDNA ；
(5)纯化的mtDNA于空气中自然干燥90-120min(或真空干燥)，然后每管加50 μ I TE溶液，于室温下充分溶解60-90min，转入4°C冰箱中过夜，第二天于恒温水浴箱中68°C水浴30min或100°C水浴IOmin以灭活DNase和RNase，分装后于4°C保存备用或_20°C长期保存。
[0007]所述的mtDNA COI基因片段的扩增步骤如下:
特异性引物序列如下:
表1 COI基因片段的PCR引物序列
【权利要求】
1.一种利用宿主肝脏线粒体基因突变检测家畜内毒素中毒的方法，包括肝脏mtDNA提取、mtDNA COI基因片段的扩增、PCR产物的SSCP分析和DNA序列测定步骤，其特征在于选择了肝脏线粒体基因中的细胞色素C氧化酶(COI)基因，设计了特异性引物，可以扩增该基因的5308-5611位置上的基因片段，结合SSCP技术检测该基因片段的突变来确定家畜内毒素是否中毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的mtDNA提取步骤中试剂配方如下:
(1)SE 溶液(pH: 7.8):0.25M 蔗糖、2.5mMCaC12、30mM Tris-HClUOmM EDTANa2 ;
(2)溶液I (TEN, ρΗ8.0):0.15M NaCl、IOmM EDTANa2、IOmM Tris-HCl ； (3)溶液I1:1%SDS，其中含0.2NNa0H，现用现配，混匀，立即使用； (4)溶液II1:3MKac，其中含3MKAc、5M冰乙酸，混匀，高压灭菌，室温保存备用；
(5)TE 溶液(pH: 8.0):10mM Tris-HCl.0.1mM EDTANa2、20ug/ml DNase-free RNase。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的肝脏mtDNA提取步骤如下: (1)取样品的肝组织0.5g~1.0g，在冰预冷的SE溶液中洗去血污后转入6ml冰预冷SE中剪碎，再转入IOml离心管中，高速分散器上1500rpm匀浆3次，每次间隔20sec，每次匀衆IOsec,然后离心机上2000rpm离心15min,弃沉淀，上清转入1.5ml Eppendorf管中； (2)Eppendorf管 中的上清液12000rpm离心15min,弃上清,每管加Iml 0°C预冷的SE溶液重悬沉淀，混匀后转入第二支的eppendorf管，12000rpm离心8min,弃上清，每管加150 μ I溶液I，轻轻充分混匀，室温静置15min，每管加300 μ I新配制的溶液II，小心混匀，(TC冰箱中冰浴IOmin后，每管加4°C预冷的225 μ I溶液III，小心混匀，于0°C冰箱中冰浴30min后，12000rpm离心6min，弃沉淀，小心取上清(注意不要吸取白色物质以免造成污染)转入第三支的Eppendorf管； (3)加入水饱和酹于第三支Eppendorf管的上清液中，混匀，上下颠倒轻轻摇动20min后，再加入氯仿-异戍醇，上下颠倒轻摇15min混匀后，12000rpm离心8min,取水相转入第四支的Eppendorf管,重复步骤(2) —至三次至液体中间层无白色物质为止； (4)取经过步骤(3)处理后的水相于Eppendorf管中，加入2倍体积于水相的无水乙酉享，混匀，于O°C冰箱内冰浴30min, 12000rpm离心10min,弃上清,用0°C预冷的70%乙醇洗涤沉淀2-3次，每次洗涤后，12000rpm离心5min，彻底去上清，所得沉淀即为纯化的mtDNA ； (5)纯化的mtDNA于空气中自然干燥90-120min(或真空干燥)，然后每管加50 μ I TE溶液，于室温下充分溶解60-90min，转入4°C冰箱中过夜，第二天于恒温水浴箱中68°C水浴30min或100°C水浴IOmin以灭活DNase和RNase，分装后于4°C保存备用或_20°C长期保存。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的mtDNACOI基因片段的扩增步骤如下: 特异性引物序列如下: 表1 COI基因片段的PCR引物序列
Table I PCR primer sequncee of every target gene fragment
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的PCR产物的SSCP分析步骤如下: (1)制备聚丙烯酰胺凝胶电泳装置，对PCR样品进行变性处理； 0.3-1.5μ I PCR样品、8 μ I灭菌去离子水和8μ I SSCP载样缓冲液在0.5ml灭菌PCR管中混合、于PCR仪中98°C变性13-18min，变性完毕，迅速取出各样品置于_20°C冰箱中？冷却3-5min以避免温度缓慢下降导致ssDNA退火重新形成dsDNA ； (2)各点样孔依次加满0.5 X TBE缓冲液，然后将经过变性处理的PCR样品依次加入凝胶加样孔中，跑胶，电泳电压和电泳时间分别是520V和2-3h ； (3)将玻璃板中的凝胶块小心剥离，放入染色盘中，用银染法显色，数码相机拍照或在凝胶成像系统上照相。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的DNA序列测定是在SSCP分析结果中，将出现泳动异常的PCR样品，及正常对照的PCR样品进行DNA序列测定，序列测定由上海生物工程有限公司完成。
【文档编号】C12Q1/68GK103993080SQ201410208494
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】高洪, 严玉霖, 彭辂, 周铭涛, 陈利平, 陈玲, 赵汝 申请人:云南农业大学