一种辅助鉴定弱冬性小麦的方法及其专用引物的制作方法

专利名称：：一种辅助鉴定弱冬性小麦的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助鉴定弱冬性小麦的方法及其专用引物。
背景技术：
：春化作用是一些一年生或多年生的温带或亚热带植物如小麦、大麦等禾谷类作物必须经历一定时间的低温处理才能开花结实的现象，普通小麦广泛的适应性很大程度上就是由于春化需求的遗传变异引起的。根据小麦的春化反应特性将其分为春性、弱冬性和冬性。春性植物不需要低温春化就能开花，弱冬性的植物需要2-4周的低温处理才能抽穗开花，冬性的植物必须给以6周以上的低温处理才能实现营养生长向生殖生长转变(GardnerFPiBarnettRD(1990).Vernalizationofwheatcultivarsandatriticale.CropSci，30:166-169)。植物品种的春化特性与其地理分布关系密切，其中弱冬性小麦广泛分布于亚洲、欧洲等许多地区，在小麦品种中占有较大的比例。我国具有丰富的小麦品种资源，且分布在十大小麦生态区，有44%以上的品种为弱冬性，其中最大的麦区-黄淮海麦区有60%以上的品种为弱冬性，这种广泛的适应性必然有丰富的遗传基础。现有的有关春化基因的研究多集中在春性与冬性基因上，迄今已有VRN-1、Vrn-2和Vrn-3三个春化基因被克隆(YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003)·PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNLPNAS,100:6263_6268;YanL,LoukoianovA,BlechlA,etal(2004).ThewheatVRN2geneisafloweringrepressordown-regulatedbyvernalization.Science,3031640-1644；YanL,FuD,LiC,etal(2006).FromtheCoverThewheatandbarleyvernalizationgeneVRN3isanorthologueofFT.PNAS,10319581-19586)；研究表明，VRN-1基因在A、B、D三个基因组上的等位基因变异在调节普通小麦春化反应特性上起着重要的作用(McintoshRA,YamazakiY,DevosKM,etal(2003).Catalogueofgenesymbolsforwheat.InProceedingsoftheIOthInternationalWheatGeneticsSymposium,ed(InstitutoSperimentaleperlaCerealicoltura)，l-34)。VRN-I基因对于春性习性来说是显性的，A、B、D三个基因组上的任何一个等位基因为显性时，均表现为春性习性，否则为冬性(YmL，LoukoimovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNl.PNAS,100:6263-6268；YanL,HelgueraΜ,KatoK，etal(2004)·AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet,109:1677—1686;FuD,SzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics,273=54-65)0目前，已有研究证明春性产生的原因，但有关弱冬性产生的原因尚未见报道，因此研究弱冬性习性形成的分子机理、小麦春化反应特性、春化基因VRN-I和Vrn-2的等位变异及不同等位基因组合的地理分布特征具有重要的理论与实际意义。启动子和内含子均属于基因的非编码区域，近年来研究发现它们以增强子、抑制子或促进子的方式参与基因转录调节。启动子通过一系列的顺式作用元件，如TATA-，CCAAT-，E-和CArG-boxes等与转录因子结合，调控下游功能基因的时空表达。多数研究认为内含子区域的调控因子位于第一个内含子内(Gazzrni，S.，Gendall,A.R.，Lister,C.，etal(2003).AnalysisofthemolecularbasisoffloweringtimevariationinArabidopsisaccessions.PlantPhysiol,132:107_1114；Michaels，S.D.，He，Y.，Scortecci，K.C,etal(2003).AttenuationofLOWERINGLOCUSCactivityasamechanismfortheevolutionofsummer-annualfloweringbehaviorinArabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100:10102-10107)。例如，Yan等(YanL,LoukoianovA，TranquilliG，etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNl.PNAS,100:6263_6268；YanLiHelgueraMiKatoK，etal(2004)·AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet，109:1677-1686)发现Vrn-Al启动子的插入或缺失突变与春性生长习性有关；Fu等(FuDiSzucsP，YmL，etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics，273:54_65)石if究认为VRN-I第一个内含子缺失突变也能导致春性生长习性。可见，这两个调控位点中的任何一个发生突变都足以引起春性习性(FuD,SzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics，273:54_65)。在二倍体和四倍体春性小麦中，Vrn-Al启动子区域的缺失突变临近或者影响到CArGbox(DubcovskyJandYanL(2003).AllelicvariationinthepromoterofAp1,thecandidategeneforVRN-1.InPognaN(ed)ProceedingsoftheIOthinternationalwheatgeneticssymposium,Paestum,Italy,1243-246；YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.PNAS,1006263-6268；YanL,HelgueraΜ,KatoK,etal(2004).AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet，109:1677_1686)；而在六倍体小麦中检测到Vrn-Al启动子区域差异不是位于CArGbox，而是临近HDD区域(YanL,HelgueraM,KatoK,etal(2004).AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet,1091677-1686)。然而，HDD区域在VRN-I转录起始中可能并没有起重要作用，因为小麦PI349049的春性习性是由于Vrn-Al启动子区域包括HDD区发生了34bp的缺失(YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.PNAS，100:6263_6268)。在六倍体小麦品种中Vrn-Al启动子突变的作用可以被简单地解释为这些突变足以产生春性习性；然而，不能排除由VRN-I基因启动子外的区域的突变产生春性习性，而这个突变与启动子的突变是连锁的。因此，比较VRN-I显性和隐性等位基因的全长序列是非常重要的(FuDjSzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics,273:54_65)。CArG-box(CC(A/T)6GG；Dolan,J.W.andFields,S(1991).Cell-type-specifictranscriptioninyeast.Biochim.Biophys.Acta,1088155-169；Treisman,R(1992).Theserumresponseelement.TrendsBiochem.Sci,17:423_426)是MADS—boxSSW^n(Huang,H.，Mizukami,Y.，Hu,Y.，etal(1993).IsolationandcharacterizationofthebindingsequencesfortheproductoftheArabidopsisfloralhomeoticgeneAGAMOUS.NucleicAcidsRes，1993，21:4769_4776)。在拟南芥中，MADS是个大的基因家族，有100多个成员，大部分已经被证明参与植物生长发育的各个方面(ParenicovaL,deFolterS,KiefferM,etal(2003).MolecularandphylogeneticanalysesofthecompleteMADS—boxtranscriptionfactorfamilyinArabidopsis:newopeningstotheMADSworld.PlantCell，15:1538_1551；DeFolterS，Angenent(2006).GCtransmeetscisinMADSscience.TreadsinPlantScience,11:224_231)。在小麦中，同样有一些MADS-box成员参与开花调控。Jolineetal.(JolineJ.Tilly,DavidW(1998).AllenandThomasJack.TheCArGboxesinthepromoteroftheArabidopsisfloralorganidentitygeneAPETALA3mediatediverseregulatoryeffects.Development,1251647-1657)研究发现拟南芥中花器官形成类的基因APETALA3的调节序列位于启动子区域的CArG-boxes作用元件，其有三个拷贝，通过将其突变与⑶S报告基因融合发现它们对AP3起着不同的调节作用。推测CArGl和CArG2是一个或一类激活因子的结合位点，而CArG3可能是一种负调控因子的结合位点。此外，拟南芥上的两个基因FLOWERINGLOCUSC(FLC)和FRIGIDA(FRI)协同作用调节春化反应，在FRI功能丧失时，表现为春性(MichaelsS.D.andAmasinoR.M(1999).FlowingLocusencodesanovelMADSdomainproteinthatactsasarepressorofflowering.PlantCell,11949~956；SheldonCC,BurnJE,PerezPP,etal(1999).TheFLFMADSboxgene-.arepressoroffloweringinArabidopsisregulatedbyvernalizationandmethylation.PlantCell,11:445-458)。Scott等(2003)(ScottD.Michaels,YuehuiHe,etal(2003).AttenuationofFLOWERINGLOCUSCactivity.PNAS,100(17)10102-10107)报道了一些含有FRI功能的品种开花仍然比较早，这是由于FLC的第一个内含子中的插入突变产生了FLC的弱的等位基因；相对于FLC强等位基因，它们的转录水平较低。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助鉴定弱冬性小麦的方法及其专用引物。本发明所提供的辅助鉴定弱冬性小麦的方法，是以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表中序列1和序列2所示的引物进行PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；再以所述第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表中序列3和序列4所示的引物进行PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物；将第二轮PCR扩增产物用限制性内切酶BfaI进行酶切，若酶切产物为两条带，则待测小麦为弱冬性小麦；若酶切产物不为两条带，则待测小麦为候选非弱冬性小麦。上述小麦为普通小麦。上述辅助鉴定弱冬性小麦的引物也属于本发明的保护范围。本发明所提供的辅助鉴定弱冬性小麦的引物，由两对引物组成，其中一对引物的核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，另一对引物的核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。本发明的第三个目的是提供一种辅助鉴定弱冬性小麦的试剂盒。本发明所提供的辅助鉴定弱冬性小麦的试剂盒，包括核苷酸序列为序列表中序列3和序列4所示的一对引物和限制性内切酶Bfal。本发明对不同品种的春性和弱冬性小麦的Vrn-Dl基因进行比较，结果发现，在弱冬性小麦Vrn-Dl基因启动子区的CArG-box中，胞嘧啶突变为腺嘌呤突变，形成了一个新的等位基因Vrn-Dlb。根据该突变位点，开发出该等位基因的CAPS标记。在一个BC4F2群体中发现基因Vrn-Dlb与材料的弱冬性共分离；实时定量PCR结果表明，携带有基因Vrn-Dlb的弱冬性小麦中，Vrn-Dl的表达受到抑制。因此，认为Vrn-Dlb是控制小麦弱冬性的基因。实验结果表明，相对于春性小麦品春16，带有等位基因Vrn-Dlb的弱冬性小麦莱州953的春化敏感性增加，基因表达水平降低与启动子区域的CArG-box的点突变的相关性可以被解释为CArG-box是一个正向作用因子的结合位点，而且这个正调控因子在调节Vrn-Dl表达水平上起着重要作用；Vrn-Dl弱等位性当CArG-box发生点突变时，导致上游正调控因子不能识别它，产生了Vrn-Dl弱等位基因Vrn-Dlb，以致Vrn-Dl表达水平降低，春化敏感性增加。现有的研究表明，VRN-I的三个显性等位基因Vrn-Al、Vrn-Bl和Vrn-Dl均能使得植株对春化不敏感，表现为春性习性。然而，本发明发现一些带有Vrn-Dl显性等位基因的品种有弱的春化需求，属于弱冬性类型。本发明的研究认为，Vrn-Dl启动子区域CArG-box的点突变导致了弱冬性习性。理由如下第一，将携带相同基因型Vrn-Alvrn-BlVrn-Dl的春性和弱冬性小麦品种(各5份)的D基因组上的VRN-I全基因组序列进行测序，比较发现，除了起始密码子上游161bp位置的一个SNP外，没有任何差异。该点突变位于CArG-box内。为了区别该突变位点，将春性品种的Vrn-Dl命名为Vrn-Dla，而将弱冬性品种的Vrn-Dl命名为Vrn-Dlb；第二，在一个148个单株的BC4F2群体中弱冬性习性与Vrn-Dlb的标记表现为共分离，且自然群体中，Vrn-Dlb的标记仅出现在弱冬性习性的材料中；第三，在春性、弱冬性和冬性习性的材料间Vrn-Dl的表达分析也证明了启动子区域CArG-box内的A/C突变确实影响了Vrn-Dl基因的表达，且改变了材料的春化反应特性。可以提出一个简单的模型对春性、弱冬性和冬性习性的产生进行解释。基因型为Vrn-Alvrn-Blvrn-Dl的小麦，VRN-I基因A基因组上启动子区域InDel或VRN-I基因的第一个内含子区域缺失使得作用于该位点的抑制子不能识别，该基因能正常表达，表现为春性；而当VRN-I基因D基因组上同时出现第一个内含子区域缺失和启动子区域CArG-box点突变时，一方面作用于内含子上的抑制子不能识别，另一方面又使得作用于启动子区域CArG-box上的促进子也不能识别它，在两个调节位点的共同作用下，Vrn-Dl的表达量低于那些只携带第一个内含子缺失的春性材料，却又高于那些没有任何突变的冬性材料，植物最终表现为弱冬性。可见，生物体内的调节过程是复杂的，有时是某个部分单独起作用，如春性习性由启动子区域或内含子区域的变化(YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNLPNAS,100:6263_6268;YanL,HelgueraM,KatoK,etal(2004).AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet,109:1677-1686；FuD,SzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics,27354~65；YanL,FuD,LiC,etal.FromtheCover:ThewheatandbarleyvernalizationgeneVRN3isanorthologueofFT.PNAS，2006，10319581-19586)来调节。有时又是几个部分协同调控，就会产生一系列新的表型，从而造就了自然界的多样性。本发明的辅助鉴定弱冬性小麦的方法，可以在早期对小麦的春化习性进行判断，以加快育种速度、降低育种成本，并具有操作简单、成本低廉和周期短的优点，适于推广应用，为小麦品种的春化习性鉴定提供了一种快捷的方法。图IA为D基因组特异性引物IF和3R在中国春及其缺体-四体材料基因组中的扩增结果图IB为四对重叠PCR引物的扩增结果图2A为引物VRN1-1000F和VRN1-INT1R在不同小麦品种中的扩增结果图2B为引物VRNlweakD2-lF和VRNlweakDl-IR以引物VRN1-1000F和VRN1-INT1R的PCR产物为模板的扩增结果图2C为不同小麦品种的两轮PCR扩增产物的BfaI酶切结果图3为不同春性、弱冬性小麦品种的Vrn-Dl基因部分序列比对结果图4为CAPS标记对亲本及部分F2单株的检测结果图5A为不同生长习性的小麦品种在不同春化条件处理下的抽穗天数图5B为不同生长习性的小麦品种在不同春化条件处理下叶片中Vrn-Dl基因的表达量比较结果图6为CAPS标记对携带不同VRN-I基因型的春性、弱冬性及冬性小麦品种的PCR检测结果具体实施例方式本发明实施例中所用到的各个品种的小麦均由中国农业科院作物科学研究所和农业部作物品种资源与生物技术重点实验室提供。具体可以登陆“中国作物种质信息网，，http://www.cRris.net/query/croplist.php查询禾口获耳又。实施例1、VRN-I基因的D基因组全长序列的获得一、DNA的提取与检测将小麦种子(中国春的缺体_四体材料5NATD、5NBTD、5NDTA及中国春)表面消毒后，播种于培养钵中，室温条件下长至两叶一心时分别采集叶片，液氮速冻后，置于-70°C冰箱中备用。总DNA的提取采用酚-氯仿法(DevosKM，AtkinsonMD,ChinoyCN,etal.RFLPbasedgeneticmapofthehomoeologousgroup3chromosomesofwheatandrye.TheorApplGenet,1992,83:931_939)。具体步骤如下1)将新鲜的上述叶片置于液氮中低温下磨碎，转入1.5ml离心管中，加入500μ1缓冲液S(100mMρΗ8.5的Tris-HCl，IOOmMNaCl,50mMpH8.0的EDTA，2%(质量百分含量)SDS)，65°C水浴l_2h。2)加入500μ1酚-氯仿(11体积比)混合液，混勻后10，OOOrpm离心IOmin；取上清液加入0.6倍体积的异丙醇，混勻后静置5min，10，OOOrpm离心lOmin，弃上清，用70%乙醇将DNA洗1-2次后室温下干燥。3)将DNA溶于500μ11XTE(ρΗ8·0)，力口2μ1RNA酶(10mg/ml)，37°C保温3h；加500μ1氯仿，轻柔混勻，10，OOOrpm离心IOmin。4)取上清液加入1/10体积的3Μ乙酸钠(ρΗ5.2)和2倍体积的冷无水乙醇(或95%乙醇)，轻轻混勻后静置5min，10，OOOrpm离心lOmin，轻轻倒掉液相，用70%乙醇将DNA洗1-2次后室温下干燥，将干燥后的DNA溶于1XTE(ρΗ8.0)中。5)用紫外分光光度计测定提取得到的DNA的浓度和相对纯度；0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带的完整性。结果表明，提取得到的DNA的浓度为800-1000ng/ul；相对纯度为OD26(1/OD28(1=1.75-1.80；琼脂糖凝胶电泳的DNA为一条完整的条带，无降解。二、基因组DNA的扩增与测序1、引物设计及基因组DNA的扩增根据NCBI中提供的VRN-I基因的A、B和D基因组序列，利用DNAStar软件中的SeqMan比较序列间的差异，PrimerSelect设计D基因组特异引物IF和3R。为证实该引物的基因组特异性，分别在中国春的缺体-四体材料5NATD、5NBTD、5NDTA及中国春中扩增VRN-I基因。PCR反应体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR扩增程序如下先95"C4min；然后95°C30s,68"CIOmin,30个循环；再72°C10min，4°C保温。1-2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增得到的片段大小，结果如图IA所示。其中，M为GeneRulerIkb的DNA分子量标准；5NA、5NB和5ND分别为中国春第五同源群上的缺体-四体材料5NATD、5NBTD和5NDTA；CS为中国春。结果表明，除了缺少5D染色体的缺体-四体5NDTA中无扩增条带外，其余材料均扩增得到大小约为8.Ikb的目的条带，从而证明引物IF和3R为D基因组特异性的引物。另外，由于扩增得到的片段过长，不利于扩增及测序，又以IF和3R为引物，以从中国春中扩增出的产物为模板，设计四对重叠PCR引物1F和AR、BnewlF和BnewR、CF和C2R和DF和3R，分四段扩增出Vrn-Dl基因的全长序列。具体的PCR扩增引物序列、产物大小及退火温度如表1所示。PCR反应体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR扩增程序如下先950C4min；然后95°C30s，退火(51-60°C)30s,72°Clmin/kb，34个循环；再72°C10min，4°C保温。表IPCR引物序列、产物大小及退火温度<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>琼脂糖凝胶电泳检测扩增得到的片段大小，结果如图IB所示。其中，M为天根生物公司的200bp的DNA分子量标准；1、2、3和4分别为四对重叠PCR引物IF和AR、BnewlF和BnewR、CF和C2R、DF和3R的扩增产物(均以引物IF和3R在中国春中扩增得到的产物为模板)。结果表明，以IF和AR为引物扩增得到大小约为900bp的条带；以BnewlF和BnewR为引物扩增得到大小约为800bp的条带；以CF和C2R为引物扩增得到大小约为4.5kb的条带；以DF和3R为引物扩增得到大小约为3.4kb的条带。这四条扩增产物条带的大小均与预期相符。2、PCR产物的纯化1)100μ1的PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用洁净消毒的刀片将目标片段挖出，分别放入1.5ml离心管中。2)向1.5ml离心管中加入3倍体积的溶胶液，50°C水浴lOmin，待凝胶完全溶化后，倒入吸附柱中，13，OOOrpm离心lmin，弃溶胶液。3)向吸附柱中加入700μ1漂洗液，13，OOOrpm离心lmin。4)倒出漂洗液，再向吸附柱中加入500μ1漂洗液，13，OOOrpm离心lmin。5)将离心管中的漂洗液倒掉，13，OOOrpm离心2min。6)将吸附柱转移至一新的1.5ml离心管上，加入适量洗脱液，室温放置2min。7)13，OOOrpm离心lmin，弃吸附柱，离心管内即为高纯度的PCR纯化产物。3、PCR产物测序采用引物延伸(primerwalking)的方法设计测序引物，分别将上述四段扩增产物直接测序，采用BigDyeKTerminatorv3.ICycleSequencingKit(ABI)进行测序PCR反应，测序使用ABI3730XLDNAAnalyzer。三、序列组装、拼接和比对采用http//www.DNAStar.com中的LasergeneSeqManIIModule(DNAStar)进行序列的组装和拼接。将拼接后的序列与NCBI中的Vrn-Dl基因序列进行相似性比较，结果表明，表明从中国春中获得了Vrn-Dl基因的全长序列。实施例2、Vrn-Dl的一个新等位基因Vrn-Dlb的发现为解释基因型均为Vrn-Dl的小麦中出现两种表现型的现象，将携带Vrn-Dl等位基因的春性小麦(品春16、偃展1号、双吉4号、中国春和郑花2563)与弱冬性小麦(蚂蚱麦、茶淀红、莱州953、复壮30和百农3217)进行VRN-I基因的D基因组全序列扫描、比较。利用表1中的引物，分别获得各个品种小麦的Vrn-Dl基因全长序列及四段重叠序列，按照实施例1的方法测序、拼接和比对后发现，春性小麦与弱冬性小麦之间只有一个碱基的差异，比较结果如图3所示。图3的10条序列从上至下依次为蚂蚱麦、品春16、偃展1号、双吉4号、中国春、郑花2563、茶淀红、莱州953、复壮30和百农3217。其中，490bp处为起始密码子ATG，其上游161bp处为序列间的差异位点，框内为CArG-box，BfaI和CAP位点均用下划线标出。该突变位点位于起始密码子ATG上游的161bp处，5个弱冬性小麦品种均为腺嘌呤A，而5个春性小麦品种均为胞嘧啶C。该位点正好位于预测的转录起始位点CAT上游的CArG-box内。为了区别该突变位点，将春性小麦品种的Vrn-Dl基因命名为Vrn-Dla，而将弱冬性小麦品种的Vrn-Dl基因命名为Vrn_Dlb。实施例3、检测新等位基因Vrn-Dlb的CAPS标记的开发为了有利于对小麦种质资源中的这个突变位点进行检测，将该突变开发成一个标记。经DNAStar中的Mapdraw程序进行酶切位点预测，发现该单碱基的突变正好形成了一个限制性内切酶BfaI的酶切位点。采用巢式PCR,以VRN1-1000F和VRN1_INT1R(序列1和序列2)为第一轮PCR引物，从小麦的基因组DNA中扩增出约为1200bp的片段，扩增结果如图2A所示，其中1-10为10个不同的小麦品种的PCR扩增结果，M2为200bp的DNA分子量标准。再以此1200bp的扩增产物为模板(稀释100倍)，以VRNlweakD2_lF禾口VRNlweakDl-IR为引物(序列3和序列4)进行第二轮PCR扩增，获得大小为442bp的含突变位点的目标区域，扩增结果如图2B所示，其中1-10为10个不同的小麦品种的PCR扩增结果，M1为50bp的DNA分子量标准，M2为200bp的DNA分子量标准。最后用BfaI酶对第二轮PCR产物进行酶切。反应体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>37°C酶切l_3h，2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，携带Vrn-Dlb等位基因的弱冬性小麦品种经酶切产生301bp和141bp两个新的片段；而携带Vrn-Dla等位基因的春性小麦品种均未被切开，酶切结果如图2C所示。其中1-5为春性小麦品种品春16、偃展1号、双吉4号、中国春和郑花2563的BfaI酶酶切结果，6-10为弱冬性小麦品种蚂蚱麦、茶淀红、莱州953、复壮30和百农3217的BfaI酶酶切结果，M1为50bp的DNA分子量标准，S为春性小麦品种，丽为弱冬性小麦品种。以上结果说明，利用巢式PCR经两轮扩增后，再用BfaI酶酶切能够成功地检测到该突变位点，即利用这个CAPS标记可以检测到新等位基因Vrn-Dlb。实施例4、小麦春化敏感性差异与新等位基因Vrn-Dlb的关系用CAPS标记检测已知基因型为Vrn-Alvrn-BlVrn-Dl的弱冬性小麦65份和其它基因型的春性、弱冬性及冬性小麦共53份，见表2和表3(中国作物种质信息网http://www.CRris.net/query/croplist.php)。按照实施例3的方法进行巢式PCR、用BfaI酶对第二轮PCR产物进行酶切和检测酶切产物，检测结果如表2和图6所示。表2中，在鉴定的65份基因型为Vrn-Alvrn-BlVrn-Dl的弱冬性小麦中，有53份小麦检测到CAPS标记，出现的频率为82%，推测其基因型为Vrn-Alvrn-BlVrn-Dlb；有12份小麦没有检测到CAPS标记，可能是其它位点发生了突变；而在其它基因型的春性、弱冬性及冬性小麦中均未检测到CAPS标记。表2CAPS标记对携带不同VRN-I基因型的春性、弱冬性及冬性小麦的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2中，“+”表示按照实施例3的方法进行巢式PCR、用BfaI酶对第二轮PCR产物进行酶切并电泳检测后产生两条新的条带，“_”表示按照实施例3的方法进行巢式PCR、用BfaI酶对第二轮PCR产物进行酶切并电泳检测后未产生新的条带。表3不同春化基因型的113份材料<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>图6中，M为50bp的DNA分子量标准；1_35依次分别为1，春小麦(弱冬性，abd)、2，火燎麦(春性，Abd)、3，晋春3号(春性，Abd)、4，豫麦29(弱冬性，abd)、5，徐州14(弱冬性，abd)、6，辐63(弱冬性，abd)、7，丹麦1号(冬性，abd)、8，中麦9号(冬性，abd)、9，京411(冬性，abd)、10，克涝4号(春性，ABD)、11，白大头(春性，ABD)、12，VAI0LET(春性，aBD)、13，大粒黄(春性，aBD)、14，克丰3号(春性，aBD)、15，深根(春性，AbD)、16，黑小麦(春性，abD)、17，GUADALUPE(春性，abD)、18，品春16(春性，abD)、19，百农3217(弱冬性，&匕013)、20，科遗26(弱冬性，abD)、21，光头(春性，ABd)、22，郑花0840-3(春性，abD)、23，复壮30(弱冬性，abDb)、24，绵阳79_2(春性，abD)、25，藁城8901(弱冬性，abDb)、26，洋麦(春性，ABd)、27，敦化春麦(春性，ABd)、28，恩麦4号(春性，aBd)、29，邯8014(弱冬性，abDb)、30，内乡182(弱冬性，abD)、31，冀933235(弱冬性，abDb)、32，定西24(春性，ABd)、33，安阳1号(春性，aBd)、34，贵农10号(春性，aBd)和35，茶淀红(弱冬性，abDb)的CAPS标记检测结果；括号内为材料的生长习性及基因型。结果表明，图6中检测的35份材料中，只有基因型为vrnAlvrnBlVrnDlb(abDb)的弱冬性材料19、23、25、29、31和35酶切后能产生两条新的条带，其余各种基因型的春性、弱冬性和冬性材料均不能被酶切。实施例5、基因Vrn-Dlb的功能验证春性小麦品种偃展1号(基因型为Vrn-AlVrn-BlVrn-Dla)和弱冬性小麦品种莱州953(基因型为Vrn-Alvrn-BlVrn-Dlb)在B、D基因组上的等位基因存在差异。为了证明基因Vrn-Dlb的功能，将偃展1号与莱州953杂交，并用偃展1号作轮回亲本进行回交，在其BC4F1群体中鉴定出一株基因型为Vrn-AlVrn-AlVrn-BlVrn-BlVrn-DlaVrn-Dlb的单株。将偃展1号、莱州953及其该单株自交获得的种子BC4F2分离群体的148个单株播种于20-25°C的温室，16小时的长日照下生长60天。采集植株解剖镜下观察生长锥，鉴定其生长发育阶段。进入幼穗分化阶段的植株标志其处于生殖生长阶段，反之为营养生长阶段；未经低温处理就能进入生殖生长阶段的植株表现为春化不敏感性(即春性小麦)，而必须经4°C低温春化处理15-30天后才能进入生殖生长阶段的植株表现为春化敏感性(即弱冬性小麦)。结果表明，亲本偃展1号表现为春化不敏感(I)，莱州953表现为春化敏感(S)。148个单株的鉴定结果表明，其中103株表现为春化不敏感(1)，45株表现为春化敏感(S)，不敏感与敏感株数之比符合3:1的分离比(χ2=1.796<Xaci52=3.841)。可见该群体对春化反应特性是由一对显性基因控制的。利用Vrn-Dlb的CAPS标记对这148个单株进行鉴定，检测结果如图4所示。其中，M为200bp的DNA分子量标准；1为莱州953；2为偃展1号；3和21为携带纯合基因Vrn-Dlb的春化敏感F2代单株；其余为春化不敏感单株，其中5、7和19为基因Vrn-Dla与Vrn-Dlb的杂合体F2代单株，4、6、8-18、20、22-25为携带纯合基因Vrn-Dla的春化不敏感F2代单株。结果发现45株春化敏感的F2代单株全部携带纯合的Vrn-Dlb基因，而春化不敏感的103个单株有29株均携带有纯合的Vrn-Dla基因，其余为基因Vrn-Dla与Vrn-Dlb的杂合体，即春化特性与基因Vrn-Dlb的标记表现为共分离。由此可见该群体单株间在春化敏感性上的差异是由于D基因组上的显性等位基因Vrn-Dla和Vrn-Dlb的差异引起的。实施例6、启动子区突变对Vrn-Dl表达的影响一、春化处理及取样方法选取携带Vrn-Dl等位基因的春性(品春16)、弱冬性(莱州953)和冬性(丹麦1号)小麦种子各80粒，随机分为四组，每组的每个品种20粒，播种于20°C的温室中，16h长日照下生长一个月。从第一组中选取五株最幼嫩的全展叶片提取RNA，作为未经春化处理的对照；其余三组转入4°C16h长日照下生长，分别于4°C16h长日照下生长2周、4周和6周后，每组选取五株最幼嫩的全展叶片提取RNA，作为春化处理2周、4周和6周的RNA样品。于播种120天后记载小麦的抽穗期，结果如图5A所示，图5A中数值为平均值士标准误差。其中，1为无春化处理；2、3和4为分别进行2周、4周和6周的春化处理；S为春性小麦；MW为弱冬性小麦；W为冬性小麦。从图5A中可以看出，总的趋势为随着低温春化处理时间的延长，所有小麦品种中抽穗所需的天数逐渐减少。对于春性小麦品种，抽穗所需天数也在减少，但差异不显著；冬性小麦品种的春化敏感性更强，低温处理必须达到6周以上，才能使植株抽穗。二、实时定量PCR为了进一步了解Vrn-Dl的不同等位基因与春化敏感性间的关系，利用VRN-I的D基因组特异引物SYBER_BD_F和SYBER_D_R(LoukoianovA,YanL,BlechlA,SanchezA,&DubcovskyJ(2005)RegulationofVRN-IVernalizationGenesinNormalandTransgenicPolyploidWheat.PlantPhysiol.138(4):2364_2373)，以ACTIN基因为内参(YanL,etal.(2003)PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.ProcNatlAcadSciUSAlOO(IO):6263_6268)，对给予不同低温春化处理O周、2周、4周和6周的春性小麦品春16(Vrn-Dla)、弱冬性小麦莱州953(Vrn-Dlb)和冬性小麦丹麦1号(vrn-Dl)分别提取总RNA，进行实时定量PCR分析，并与上述抽穗所需天数进行对照，具体步骤如下1、总RNA的提取灭菌的一次性使用的塑料制品如枪头、1.5ml离心管基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA；反复使用的塑料制品如40ml离心管、研钵和玻璃器皿等经常有RNA污染，用前需用0.1%(体积百分含量)的DEPC水浸泡过夜，然后高压蒸汽灭菌45min。新开封的试剂基本上无RNA污染，可直接使用。提取过程中所配制的试剂均用灭菌的0.(体积百分含量)的DEPC水配制。1)将研钵先充分预冷，分别称取0.Ig步骤一中的小麦叶片，在液氮低温下充分研磨；将粉末转入1.5ml离心管中，加入ImlTrizol(购自Invitrogen公司)，充分混勻。2)将勻浆样品在室温15-30°C下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。40C10，OOOrmp离心lOmin。3)将上清液转入另一新的离心管中，加入200μ1氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min,10,OOOrmp4°C离心15min。4)将水相转移到另一新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，混勻，室温静置lOmin，4°C10，OOOrmp离心IOmin05)倒掉液相，加入Iml75%乙醇，4°C不超过7500rmp离心5min，弃上清。短暂干燥，加入50ulDEPC水溶解，-70°C保存。2、总RNA中DNA的处理(1)在无RNase的0.2ml离心管中依次加入下述试剂<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)37°Cgi^30min。(3)加入25mMEDTA1μ1，65°C温育lOmin。3、RNA浓度及纯度鉴定利用紫外分光光度计测定上述提取得到的总RNA的浓度并鉴定其纯度；利用1.2%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。胶板、胶槽、梳子和电泳槽用洗涤灵浸泡洗涤后，用0.5%的SDS浸泡过夜，洗净后，用蒸馏水冲洗干净，备用。配制甲醛变性1.2%琼脂糖凝胶在1.2g琼脂糖中加入IOmlIOXFABuffer，加灭菌的DEPC水至IOOml；溶胶后待胶冷却至50°C时加入1.8ml甲醛及1μ1ΕΒ，混勻后倒胶(厚度0.5-0.6cm)。待胶凝固后，将胶放入盛有IXFArunningbuffer的电泳池中平衡至少0.5h，在上述RNA样品中加入1/4体积的IXRNAloadingbuffer，混勻后，65°C温育3-5min，冰浴至少5min，上样，电泳。电压100V,电泳时间1.5h。结果表明，提取得到的总RNA浓度在1.5-2.Oug/ul之间；相对纯度为D26(1/D28(1吸光值的比率在2.0-2.1之间；变性琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S、5.8S(5S)三条清晰的rRNA条带。4、cDNA第一链的合成分别取上述经DNaseI处理过的不同时间低温处理的小麦叶片总RNA，用SuperScriptIIReverseTranscriptase(Invitrogen)直接反转录为cDNA第一链。1)将如下试剂加入无RNA酶离心管<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>65°C保温5min后，迅速置于冰上。2)将上述混合液短暂离心后，弃去上清，在沉淀中加入下述试剂<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>轻轻混勻，37°C保温2min。3)加入1μ1反转录酶(购自Invitrogen公司)(200units/μ1)，用枪头混勻，42°C保温50min。4)70°C15min终止反应。5、实时定量PCR(1)引物来源D基因组特异引物为SYBER_BD_F:5，-CAGCCTCAAACAAGCTCTTCT-3，(序列5)禾口SYBER_D_R:5，-CTGCCCTCTCGCCTGC-3，(序列6)(LoukoianovA,YanL,BlechlA,SanchezA,&DubcovskyJ(2005)RegulationofVRN-IVernalizationGenesinNormalandTransgenicPolyploidWheat.PlantPhysiol.138(4):2364_2373)。内#ACTIN自(YanL,etal.(2003)PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.ProcNatlAcadSciUSAlOO(10):6263_6268)。ACTINF-ATGGAAGCTGCTGGAATCCAT-3'(序列7)禾口ACTINR5，-CCTTGCTCATACGGTCAGCAATAC-3，(序列8)。(2)实时定量PCR采用天根生化科技有限公司的SYBR试剂盒中提供的方法，25μ1的反应体系如下试剂_im_2.5xRealMastermix11.25μ1.10M引物F(序列5)0.625μ110M引物R(序列6)0.625μ11/10cDNA第一链2μ1ddH2010.5μ1总计_25.0μ1_反应程序为先95°C2min；然后95°C20s，60°C30s,72°C40s，40个循环；再10°C保温。6、数据计算按照文献(LivakKJ&SchmittgenTD(2001)Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method.Methods25(4)402-408)中提出的公式计算2(-ΔΔσ)的值。ΔΔCt=(CT,Target-C1,Actin)Timeχ-(Ct,Target-C1,Actin)Time0。Ct中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。Timeχ代表不同的处理时间点，TimeO代表处理的零占。图5B中的数值为平均值士标准差。结果如图5B所示，其中，1为无春化处理；2、3和4为分别进行2周、4周和6周的春化处理；S为春性小麦；MW为弱冬性小麦；W为冬性小麦。图5B中的表达量用D基因组的特异引物(序列5和序列6)及绿色荧光染料进行实时定量PCR来检测，以ACTIN作为内参。从图5B中可以看出，总的趋势为随着低温春化处理时间的延长，所有材料中Vrn-Dl的表达量均增加。对于春性小麦，未经春化处理也能检测到一定量的Vrn-Dl的表达，随着春化处理时间的延长，Vrn-Dl的表达量逐渐增加，但差异不显著；在携带Vrn-Dlb基因的弱冬性小麦中，不经低温处理，只能检测到微量Vrn-Dl基因的表达，显著低于春性小麦，给以2周低温处理，Vrn-Dl的表达量略有增加，处理4周以后，Vrn-Dl的表达量显著提高，以致能从营养生长向生殖生长转变；冬性小麦的春化敏感性更强，低温处理必须达到6周以上，才能使植株抽穗。这一结果表明启动子区的胞嘧啶突变为腺嘌呤的确影响了Vrn-Dl基因的表达，且改变了材料的春化反应特性。权利要求一种辅助鉴定弱冬性小麦的方法，是以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表中序列1和序列2所示的引物进行PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；再以所述第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表中序列3和序列4所示的引物进行PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物，将所述第二轮PCR扩增产物用限制性内切酶BfaI进行酶切；若酶切产物为两条带，则待测小麦为弱冬性小麦；若酶切产物不为两条带，则待测小麦为候选非弱冬性小麦。2.辅助鉴定弱冬性小麦的引物，由两对引物组成，其中一对引物的核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，另一对引物的核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。3.权利要求2所述引物在制备辅助鉴定弱冬性小麦试剂盒中的应用。4.权利要求2所述引物在辅助鉴定弱冬性小麦中的应用。5.一种辅助鉴定弱冬性小麦的试剂盒，包括核苷酸序列为序列表中序列3和序列4所示的一对引物和限制性内切酶BfaI。6.权利要求5所述试剂盒在辅助鉴定弱冬性小麦中的应用。全文摘要本发明公开了一种辅助鉴定弱冬性小麦的方法。以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表中序列1和序列2所示的引物进行PCR扩增，获得第一轮PCR扩增产物；再以所述第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表中序列3和序列4所示的引物进行PCR扩增，获得第二轮PCR扩增产物，将所述第二轮PCR扩增产物用限制性内切酶BfaI进行酶切，若酶切产物为两条带，则待测小麦为弱冬性小麦；若酶切产物不为两条带，则待测小麦为候选非弱冬性小麦。发明的辅助鉴定弱冬性小麦的方法，可以在早期对小麦的春化习性进行判断，以加快育种速度、降低育种成本，并具有操作简单、成本低廉和周期短的优点，适于推广应用，为小麦品种的春化习性鉴定提供了一种快捷的方法。文档编号C12N15/11GK101805797SQ201010145950公开日2010年8月18日申请日期2010年4月9日优先权日2010年4月9日发明者周荣华,孙清明,贾继增,高丽锋申请人:中国农业科学院作物科学研究所