胃肠肿瘤诊断和预示的新分子标记的制作方法

专利名称：胃肠肿瘤诊断和预示的新分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，更具体的，本发明涉及一种胃肠癌症标志物及 其用途，胃肠道癌症诊断、动态检测以及预后判断的试剂或试剂盒及其使用方法。
背景技术：
近年来恶性肿瘤的发病率持续上升，其中60%以上为消化系统肿瘤，以胃癌、大肠 癌最为常见。在全球范围内，胃癌发病率在男性恶性肿瘤中仅次于肺癌占第二位，在女性恶 性肿瘤中居第四位。而在我国死亡率居恶性肿瘤首位，年平均死亡率为每10万人口中有 25. 53人。大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是近几十年来发病数和死亡数在世界大多数国家和 地区上升最快的肿瘤之一。近年的流行病学资料显示，大肠癌已上升为全球第三位最常见 的癌症，2000年全世界有70万人患大肠癌，其中50万人因此而死亡。早期发现胃肠道肿瘤，早期治疗，是提高胃肠道恶性肿瘤疗效的关键。肿瘤分期 越高，则表明发现越晚。据国外资料报道I、II、III、IV期直肠癌患者5年生存率则分别为 93%、84%、44%和8%。但是胃肠道恶性肿瘤的临床症状常常不典型，往往被我们自认为是 我们常说的胃炎、胃溃疡、消化不良、便秘等，从而延误诊断和治疗。目前中国临床诊断多为症状性筛选，即出现腹部不适、隐痛、泛酸、嗳气或消瘦、黑 便等症状后进行内镜等检查，最终检出的癌绝大部分为进展期癌。现有的诊断方法如血清 学免疫检测通常使用的标志物如CEA、CA系列抗原，普遍存在灵敏度低、特异性差，尤其对 早期癌检出率、有效性都很低。常用的细胞学检测虽然低廉简便，灵敏度同样偏低，而影像 学检测仅对有较大占位的恶变肿瘤有很高的诊断率。中国是发展中的人口大国，经济条件 欠发达，开展以影像为主的全民性普查筛选困难重重。另外，多数胃肠道癌症患者临床确诊 时已属中晚期，如何进行手术后病人预后的监测和有效治疗方法的选择，是改善预后的有 效方法。发展具有高灵敏度、特异性强的胃肠道诊断产品，是提高胃肠癌症早期检出率、 改善患者预后的关键之一。在肿瘤发生发展过程中，作为组织蛋白酶的天然抑制蛋白 Cystatin基因家族与肿瘤的发生发展关系密切。在组织和体液中，Cystatin家族蛋白可逆 性地结合半胱氨酸蛋白酶，防止组织蛋白酶的活性过度。Cystatin C是组织蛋白酶B最强 的抑制蛋白，但是在卵巢癌和头颈部癌症中，cystatin C的表达有不同水平的上升。而在非 小细胞肺癌中，stefin A (cystatin家族成员)的表达水平有所增加；在脑膜瘤中，stef inB 在mRNA水平上有明显降低；cystatin F(亦称为Ieukocystatin或CMAP)在多种肿瘤中的 表达水平都有显著增加。研究结果显示，cystatin的几个家族成员在不同肿瘤中的表达水 平有所上升，很可能是由于在肿瘤发生发展过程中需要组织蛋白酶的参与，先诱导其表达 量增加，再激活机体本身的应激机制，导致cystatin的表达量上升以抑制过盛的蛋白酶活 性。但cystatin的表达量并不与肿瘤的发展成正相关的关系，因为在胶质瘤中，cystatin C的低表达意味着疾病的晚期，病人的生存期较短，且易于复发，该结论在mRNA和蛋白水平 上都得到了验证。
本发明证实cystatin家族成员CSTl及其剪切子的表达水平与胃肠道肿瘤关系密 切。CST1，又名cystatin SN，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)家族成员，含141个氨 基酸，2个二硫键，16. 4Kda，分布于多种体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。

发明内容
本发明目的在于提供一种预示和提供诊断胃肠肿瘤信息的检测方法，解决了现有 技术中胃肠肿瘤难以早期检测的难题。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种提供胃肠肿瘤易感性信息的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)获取待测样品；(2)测定选自下列编码mRNA或cDNA的基因在样品中的表达水平是否过表达，所 述基因为具有SEQ ID No 39的CSTl基因；或特异性识别CSTl基因的mRNA、CSTl剪切子、 CSTl基因的cDNA、CSTl剪切子的cDNA的其中一种的引物或/和探针所识别的基因；或通过 至少一种CSTl剪切子引物对应的扩增子所鉴定的基因。其中CSTlmRNA有2中剪切拼接方 式，第一种(splicel) (SEQ ID No :43)，包含 CSTl 外显子 1 ((SEQ ID No :40)、外显子 2 (SEQ ID No :41)、外显子3(SEQ ID No 42)；而第二种剪切方式(splice2) (SEQ ID No 44)仅包 含CSTl外显子1( (SEQ ID No 40)和外显子2 (SEQ ID No 41)；当基因表达水平超过预定 阈值时则预示胃肠肿瘤易感或形成。优选的，所述引物为具有SEQ ID No :1 2或SEQ ID No :4 21至少之一序列的 引物；所述探针为具有SEQ ID No 3序列的探针。优选的，所述CSTl第一个剪切子引物对应的扩增子具有SEQ ID No 45的序列。优选的，所述方法中特异性引物是具有SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的序列 形成的引物对以及具有SEQ ID No :3所示序列的探针。优选的，所述方法步骤(2)中检测表达水平的方法采用基于核酸序列扩增法的体 外RNA扩增技术或多聚酶链式反应法。优选的，所述方法步骤(2)中检测表达水平的方法采用实时定量PCR法，所述实时 定量PCR法选自基于非特异性双核苷酸染料的实时PCR或基于特殊荧光探针的实时PCR。本发明的另一目的在于提供一种检测胃肠功能的试剂盒，其特征在于所述试剂盒 包括用于捕获SEQ ID No 39的CSTl基因和/或CSTl基因剪切子(SEQ ID No :43，44)的 引物或探针以及使CSTl和/或其剪切子及其捕获引物或探针混合物可视化的反应试剂。优选的，所述反应试剂通过选自琼脂糖凝胶电泳、酶联凝胶法、电化学发光技术、 原位杂交技术、荧光检测法使CSTl和/或其剪切子及其捕获引物或探针混合物可视。优选的，所述试剂盒还包括作为阳性参照品的胃癌细胞株、作为阴性参照品的正 常的胃细胞株、核酸提取试剂、逆转录试剂、聚合酶链反应试剂。本发明首次发现该基因异常表达和胃肠癌具有密切的相关性，并根据该相关性提 供了基于特异性分子Marker的，用于诊断胃肠疾病、监控胃肠疾病、监控胃肠疾病治疗效 果以及监控和评价胃肠癌是否转移复发的测定法、试剂盒及其使用方法，从而为胃肠癌症 提供有效的分子诊断标记或评价胃肠癌症是否转移的分子标记或判断胃肠癌症患者预后 的分子标记，这些可以用于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断。
根据本发明的第一个方面，提供一种CSTl基因的用途，用于制备胃肠癌症诊断、 动态监测以及预后判断的试剂或试剂盒。检测方法包括检测CSTl mRNA和/或CSTl剪切子过表达或检测CSTl cDNA和/ 或CSTl剪切子CDNA过表达。优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CSTlmRNA和/或CSTl剪切子 的引物和/或一条至少与部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互补的寡聚核苷酸。优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CSTl cDNA和/或CSTl剪切子 cDNA的引物和/或一条至少与部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互补的寡聚核苷酸。优选的，检测方法包括基于核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)的体外 RNA 扩增技术、转录介导的扩增(Transcription-median amplification, TMA)、连接酶链反应(Ligase chain reaction, LCR)、适温链置换 反应(thermophilicstrand displacement amplification, tSDA)、多聚酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)、最佳的是实时定量 PCR(quantitative real-time PCR)。优选的，实时定量PCR包括基于非特异性双核苷酸染料如SYBR Green的实时PCR、 基于特殊荧光探针的实时PCR。优选的，检测方法进一步包括使CSTl和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可视化 的反应试剂。本发明提供了一种检测受试者样品胃肠功能的方法，该方法包括检测所述样品中 CSTl mRNA和/或CSTl剪切子的水平。优选的，所述检测进一步包括诊断所述受试者的胃、肠疾病，监控所述受试者的 胃、肠疾病，判断所述受试者的胃、肠疾病的预后，监控给予所述受试者的胃、肠疾病治疗的 效果，分期所述受试者的癌症。优选的，所述受试者包括胃、肠不适就医者，慢性胃炎、肠炎患者，有家族性胃、肠 道癌症者，且所述的检测进一步包括对受试者进行筛查以检测胃、肠道癌症。优选的，所述 受试者为胃、肠道癌症患者，且所述的检测进一步包括监控所述受试者的胃、肠癌症，判断 所述受试者的预后，监控给予所述受试者的治疗效果。优选的，所述检测方法进一步包括定量所述样品中CSTl mRNA和/或CSTl剪切子 的水平。优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CSTlmRNA和/或CSTl剪切子 的引物和/或一条至少与部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互补的寡聚核苷酸。优选的，检测方法包括定量检测CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA过表达的水平。优选的，检测方法包括使用至少一对能特异性结合CSTl cDNA和/或CSTl剪切子 cDNA的引物和/或一条至少与部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互补的寡聚核苷酸。所述方法中所述待测样品包括手术组织、镜检组织、淋巴结组织、骨髓、血清样 品、血浆样品、尿样、血样、全血样品、血液级分样品。优选的检测方法，包括基于核酸序
5列扩增法(Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)的体外RNA扩增技术、转录介导 W Γ ii (Transcription-median amplification, TMA) >Slljl Jx. IS (Ligase chain reaction, LCR)、适温链置换反应(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)、多聚酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、最佳的是实时定量 PCR(quantitativereal-time PCR)。实时定量PCR，包括基于非特异性双核苷酸染料如SYBR Green的实时PCR、基于特 殊荧光探针的实时PCR。也可以进一步包括使CSTl和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可 视化的反应试剂。—种用于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断的试剂或材料，所述的试剂选自 下组CST1基因或转录本的特异性引物；和/或CSTl基因或转录本的特异性识别探针或表 面固定有所述探针的芯片。在另一优选例中，所述的试剂是引物，所述的引物是针对CSTl外显子的引物。更 优选的优选例中，所述的引物是针对CSTl基因第一个剪切子(SEQ ID No 43)的特异性引 物；或所述的引物是针对CSTl第二个剪切(SEQ ID No 44)子的特异性引物；或所述的引物 是针对 CSTl 基因的外显子 1 (Exonl) (SEQ ID No 40)和外显子 2(Exon2) (SEQ ID No 41) 的特异性引物(即扩增产物跨越外显子1和外显子2)；或所述的引物是针对CSTl基因的外 显子I(Exonl)和外显子3(Εχοη3) (SEQ ID No 42)的特异性引物(即扩增产物跨越外显子 1和外显子3)；或所述的引物是针对CSTl基因的外显子2 (Εχοη2)和外显子3(Εχοη3)的特 异性引物(即扩增产物跨越外显子2和外显子3)。优选的引物是针对CSTl基因第一个剪切子的外显子1的特异性引物。在另一优 选例中，所述的特异性引物是具有SEQ ID No :1和SEQID No :2所示的序列的引物对以及 SEQ ID No 3 的探针。一种用于预示或检测胃肠肿瘤的基因芯片，其特征在于所述基因芯片包括用于捕 获对应于SEQ ID No 39的CSTl基因或对应于SEQ ID No :43的CSTl基因第一个剪切子的 引物或探针。根据本发明的第一个方面，提供了检测受试者样品的方法，包括检测样品中CSTl 第一个剪切子mRNA的水平。根据本发明所述的第一个方面优选实施方案中的特征，检测包 括诊断受试者的胃肠疾病，监控受试者的胃肠疾病，监控受试者胃肠疾病治疗效果，受试者 癌症分期或样品中CSTl第一个剪切子mRNA的水平。根据本发明更进一步的特征，受试者为胃肠部不适就医者，且检测包括对受试者 进行筛查以检测胃肠癌症。根据本发明更进一步的特征，受试者为慢性胃炎、肠炎患者，且 检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。根据本发明更进一步的特征，受试者有家族 性胃肠癌症，且检测包括对受试者进行筛查以检测胃肠癌症。根据如下所述的优选方案，样 品包括胃肠手术、胃肠镜、淋巴结、骨髓、血清、血浆、血样、尿样。根据优选实施方案的特征， 血样可包括全血样品或血液级分样品。本发明的另外方面提供了胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断的试剂盒，所述 的试剂盒中含有针对CSTl基因的至少一对引物和一条探针。根据如下所述的优选方案， 试剂盒中的引物对为SEQ ID No 1和SEQ ID No :2，探针为SEQ ID No :3。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有胃癌细胞株和正常的胃细胞株分别作为阳性和阴性参照品，其中优选方案为胃癌细胞株(NCI-N87)，人胃上皮细胞株(GES-I)； CSTl重组质粒作为标准品。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有肠癌细胞株和不表达CSTl的肠癌 细胞株分别作为阳性和阴性参照品，其中优选方案为肠癌细胞株(SW480)，肠癌细胞株 (HCT116) ；CSTl重组质粒作为标准品。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有核酸提取试剂、逆转录试剂、聚合酶链 反应(PCR)试剂、描述胃癌诊断、动态监测以及预后判断方法的说明书。根据本发明所述的优选方案的更进一步的特征，检测试剂盒可用于实际场所，包 括但不限于医院、诊所以及私人住宅。根据本发明的另一面，提供用于根据受试者样品评价受试者是否为胃肠癌症，或 胃肠癌症是否转移复发的测定法，包括针对CSTl基因的至少一对引物和一条探针，取自样 品中的总RNA，逆转录试剂、聚合酶链反应(PCR)试剂，由此能评估是否为胃肠癌症、治疗效 果如何以及是否转移复发。优选的检测试剂盒由以下几个部分组成CST1和/或其剪切子的捕获物；一种使 CSTl和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可视化的方法；反应试剂以及使用说明书。其中 所述CSTl和/或其剪切子的捕获物包括至少一对能特异性结合CSTlmRNA和/或CSTl剪 切子的引物和/或一条至少与部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互补的寡聚核苷酸。其中 所述CSTl和/或其剪切子的捕获物也可以包括至少一对能特异性结合CSTl cDNA和/或 CSTl剪切子cDNA的引物和/或一条至少与部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互补 的寡聚核苷酸。所述使CSTl和/或其剪切子及其捕获试剂混合物可视化的方法，包括琼 脂糖凝胶电泳、酶联凝胶法(enzyme-linked gel assay, ELGA)、电化学发光技术 (electroluminescence，ECL)、原位杂交技术(in situ hybridization，ISH)、荧光检测法。 可以按照如下步骤进行检测从受试者处获得样品；检测样品中CSTlmRNA和/或其剪切子 水平；检测结果与对照样本中CSTl水平比较，从而判断受试者胃肠状况。所述的样品包括 手术组织、镜检组织、淋巴结组织、骨髓、血清样品、血浆样品、尿样、血样、全血样品、血液级 分样品。对照样品，包括正常人样品、患者治疗的不同阶段的样品。受试者胃肠状况可以分 为正常、炎、癌，改善、未改善，治疗措施有效、无效。本发明的检测试剂盒可以用实际场所如医院、诊所、私人住宅。本发明人经过深入的研究，首次发现CSTl第一个剪切子表达水平的改变与胃肠 癌症或胃肠癌症组织转移密切相关。具体的，CSTl基因表达的上调与胃肠癌症或胃肠癌症 组织转移密切相关。因此可以通过检测CSTl基因表达(特别是CSTl mRNA表达)来诊断 胃肠癌症或胃肠癌症组织转移。CSTl基因是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，其含有两个个剪切子，三个外显 子。本发明人通过对大量的胃癌、肠癌或胃癌、肠癌组织转移患者的组织进行研究，并与胃 炎、肠炎患者的组织或正常对照等进行比较，从而有力的证实了 CSTl基因与胃癌、肠癌或 胃癌、肠癌组织转移的相关性。在本发明的实施例中，首先，本发明人比较了人体不同组织 中CSTl mRNA的表达，发现除唾液腺外，人体正常组织中CSTl均低度表达，因此对于CSTl 用于病理条件下检测极为有利。然后，本发明人比较已经报道的CST1，2，4 ；CSTl ；CST2 ；CST4在胃癌、肠癌和对应癌旁中的表达量差异，发现CSTl在胃癌和癌旁以及肠癌和癌旁 中的表达量差异最大，其次是CST4，均优于报道的CST1，2，4。然后，本发明人分别比较了 胃癌与癌旁手术组织中CSTl两种剪切方式(splicel、splice2)表达差异，发现第一种剪 切方式(splicel) (SEQ ID No 43)在癌与癌旁组织中的表达差异程度优于第二中剪切方 式(spliCe2) (SEQ ID No 44)；接着，本发明人分别比较了胃癌与癌旁手术组织、胃癌与炎 /正常人胃镜组织、胃癌转移阳性淋巴结与阴性淋巴结、胃癌与炎/正常人血浆cell-free RNA CSTl第一个剪切子mRNA表达差异，发现胃癌中CSTl第一个剪切子mRNA的表达中位 数比癌旁组织高57. 5倍，胃镜样本高24倍，转移样本高11. 469倍，血浆Cell-freeRNA高 37. 18倍。本发明人还分别比较了肠癌与癌旁手术组织、肠癌与炎/正常人肠镜组织、肠癌 转移阳性淋巴结与阴性淋巴结、肠癌与炎/正常人血浆cell-free RNA CSTl第一个剪切子 mRNA表达差异，发现肠癌中CSTl第一个剪切子mRNA的表达中位数比癌旁组织高48. 95倍， 肠镜样本高约23倍，转移样本高11. 469倍，血浆Cell-free RNA高约20倍。因此，以CSTl 第一个剪切子作为诊断的标志物，灵敏度高(可高于95% )且特异性良好(可达100% )。因此，基于本发明人的新发现，可利用CSTl基因(1)进行胃癌或胃癌组织转移 的鉴别诊断、和/或易感性分析；(2)评估相关人群的胃癌或胃癌组织转移治疗药物、药物 疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(3)早期评估相关人群胃癌或胃癌组织转移患病风 险，早期检测早期预防；(4)进行肠癌或肠癌组织转移的鉴别诊断、和/或易感性分析；(5) 评估相关人群的肠癌或肠癌组织转移治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方 法；(6)早期评估相关人群肠癌或肠癌组织转移患病风险，早期检测早期预防。本发明还提供了用于检测胃肠癌症或胃肠癌症组织转移的试剂。所述试剂可以 是CST1基因或转录本的特异性(与人类其它基因没有序列重复或互补)引物；或CSTl基 因或转录本的特异性(不识别人类其它基因)探针；或表面固定有所述探针的芯片。作为本发明的优选方案，所述的试剂是引物和探针，所述的引物是针对CSTl基因 外显子的引物和探针，更佳的是针对CSTl第一个剪切子外显子一的引物和探针；或针对 CSTl第一个剪切子外显子二、三的引物和探针。作为本发明的更优选的方式，所述的引物和探针是针对CSTl第一个剪切子外显 子一的引物和探针，该引物和探针能仅识别CSTl第一个剪切子，与CSTl第二个剪切子及人 类其它基因均不会互补结合。所述的特异性引物是具有SEQ ID No :1和SEQ ID No:2，探 针为SEQ ID No:3。所述的引物和探针特异性好，扩增效果良好。本发明还提供一种检测胃肠癌症或胃肠癌症组织转移的试剂盒，所述的试剂盒比 已有的胃肠癌症检测试剂盒具有更好的特异性和选择性。所述的试剂盒中含有用于检测 胃肠癌症或胃肠癌症组织转移的试剂。所述的试剂可以是CST1基因或转录本的特异性引 物；或CSTl基因或转录本的特异性探针；或同时包括引物和探针。通常，所述的试剂存在于 适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述的引物和探针调整到至少一种需要量 的浓度，分装于容器中。为了便于进行分析和比对，作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有胃肠 癌细胞株和不表达CSTl的细胞株分别作为阳性和阴性参照品和制备标准曲线所用的标准
P
ΡΠ O此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色
8或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括描述胃肠癌症诊断、动态检测以及预后判断的说 明书和/或芯片图像分析软件等。本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对不同的检测方法)的多种不同试 剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于CSTl基因或转录本的检测来进行胃肠癌症诊 断、动态检测以及预后判断的产品均包含在本发明范围内。所述的试剂也可以是CSTl基因或转录本的特异性识别探针或表面固定有所述的 芯片。探针或芯片的制备方法是本领域的常规技术，制备方法例如可参照王申五主编的 《基因诊断技术_非放射性操作手册》；J. L. erisi，V. R. iyer，P. 0. BROWN. Exploring the metabolicand genetic control of gene expression on a genomic scale. Science, 1997 ；278 :680。所述的针对CSTl基因或转录本的特异性识别探针，包括但不限于TaqMan水解探 针、MGB探针、杂交探针、分子信标等。检测受试者组织样品中CSTl基因或转录本的表达的方法优选的是Real-time PCR方法。本发明优选方案是Real-time PCR方法检测诊断受试者的胃肠疾病，监控受试者 的胃肠疾病，监控受试者胃肠疾病治疗效果，受试者癌症分期或样品中CSTlmRNA水平。本发明试剂盒所针对的受试者可以为胃肠不适就医者，且检测包括对受试者进行 筛查以检测胃肠癌症。本发明试剂盒所针对的受试者可以为慢性胃炎、肠炎患者，且检测包括对受试者 进行筛查以检测胃肠癌症。本发明试剂盒所针对的受试者可以为有家族性胃肠癌症者，且检测包括对受试者 进行筛查以检测胃肠癌症。一种检测方法是获得组织样品，从所述组织样品分离RNA ；使用CSTl特异性引物 和探针从RNA样品中扩增cDNA拷贝，量化扩增的cDNA拷贝，使用量化的扩增cDNA拷贝来 评估胃肠疾病进展或治疗效果。检测CSTl mRNA表达的方法还有很多种，，包括但不限于基于核酸序列扩增法 ((Nucleic Acid based Amplificatin,NASBA)的体外 RNA扩增技术。当然，RNA体外扩增技 术不限于NASBA，其它已知的RNA扩增方法和即刻的方法和试剂盒也是可用的。非限制性的 例子有多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，扩增产物通过Beacon方法用 荧光探针在均勻相中被检测，或产物可通过荧光或测热法(fluorescent orcalorimetric method)在固相中被检测。根据当前发明检测和/或定量靶基因RNA，多种荧光、侧热或酶 法可以被应用。最佳的是，基于特殊荧光探针的实时PCR技术，其中荧光探针可以是标记 了荧光的特异互补于CSTl的序列，也可以是非特异性的双核苷酸染料，包括但不限于SYBR Green, Eve Green，LC Green 等。组织样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入 性的方法获得。所述的组织样品可以是(但不限于)外周血、血清、血浆、唾液、胃液、肠道 分泌物、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、尿样等。根据本发明所述的检测试剂盒可用于实际场所，包括但不限于医院诊所以及私人住宅。此外，还可应用多变量统计学分析，将待测样品的数据与对照数据比较，有利于作出 关于胃肠癌症诊断、进展或治疗效果的判断。本发明的主要优点在于1、首次发现并证实CSTl基因与胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断具有密切 相关性，并且证实CSTl第一个剪切子在胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断方面更具有 优越性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为胃肠癌症诊断、动态监测以及预后 判断提供了新的途径。2、开发了适合于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断的试剂或试剂盒，检测灵 敏度良好。


下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为CSTl与Pmdl8_T重组质粒图谱；图2为CSTl在人体正常组织中的表达情况(芯片)，所述组织包括扁桃体、垂体 后叶、甲状腺、唾液腺、骨骼肌、骨髓、除去红细胞和血小板的外周血、肺、胃、肝脏、心脏、肾、 肾上腺、肠、结肠、胰脏脾脏、膀胱、前列腺、卵巢、子宫、胎盘、睾丸以及肠癌细胞株SW480， Caco2，LOVO, HCT16，胃癌细胞株NCI-N87，人胃上皮细胞株GES-1 ；图3为染料法实时定量PCR给出的CSTl，2，4 ;CST1 ；CST2 ;CST4在20对胃癌和癌 旁组织中的表达量差异；图4a为染料法实时定量PCR给出的20对胃癌、癌旁组织中ACTB CP值；图4b为染料法实时定量PCR反映的是CSTl第一种剪切方式(splicel)、第二种剪 切方式(splice2)在20对胃癌、癌旁组织中癌旁的CP值与对应癌组织的CP之差的中位数 比较；图5为Real-time PCR绝对定量法给出的CSTl的第一个剪切子在100例胃癌和
癌旁组织中的表达量分布；图6为Real-time PCR绝对定量法给出的CSTl的第一个剪切子在36例胃癌以及 29例胃炎胃镜表中的表达量分布；图7为Real-time PCR绝对定量法给出的CSTl的第一个剪切子在20枚胃癌病理 阳性淋巴结，15枚病理阴性淋巴结中表达量分布；图8为通过Real-time PCR绝对定量法检测外周血游离胃癌细胞的准确度与细胞 学检测的对比；图9为通过Real-time PCR绝对定量法检测胃癌骨髓转移的准确度与细胞学检测 的对比；图IOa为通过Real-time PCR绝对定量法，胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA 中CSTl第一个剪切子量与炎(30例)/正常人(30例)的差异；图IOb为通过Real-time PCR绝对定量法获得的ROC曲线，区分胃癌/炎/正常 的敏感性和特异性；图11为通过连接酶链反应(Ligase chain reaction, LCR)方法，胃癌病人(50 例)血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎(30例)/正常人(30例)的差异；
图 12 为通过适温链置换反应(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)方法，胃癌病人(50例)血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子 量与炎(30例)/正常人(30例)的差异；图 13 为通过核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplif icatin，NASBA)，20 例 胃癌，10例胃炎，10例正常人尿样中CSTl第一个剪切子量的表达差异。图 14 为通过转录介导的扩增(Transcription-mediated amplification, TMA), 检测50例胃癌(ρ Μ分期，Ι+ΙΙ 30例，III+IV50例)不同分期CSTl第一个剪切子表达量
的差异。图15为Real-time PCR绝对定量法给出的CSTl的第一个剪切子在100例肠癌和
癌旁组织中的表达量分布。图16为Real-time PCR绝对定量法给出的CSTl的第一个剪切子在36例肠癌以 及29例肠炎肠镜组织表中的表达量分布。图17为Real-time PCR绝对定量法给出的CSTl的第一个剪切子在20枚肠癌病 理阳性淋巴结，15枚病理阴性淋巴结中表达量分布。图18a为通过Real-time PCR绝对定量法，肠癌病人(50例)血浆Cell-free RNA 中CSTl第一个剪切子量与炎(30例)/正常人(30例)的差异。图18b显示了通过Real-time PCR绝对定量法得到的ROC曲线，区分胃癌/炎/ 正常的敏感性和特异性。图 19 为通过核酸序列扩增法(Nucleic Acid based Amplif icatin，NASBA)，30 例 肠癌，20例肠炎，20例正常人尿样中CSTl第一个剪切子量的表达差异。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份 数按重量计算。材料和方法实施例中所用标本均与病人签署知情同意书后按医院规定途径获取。内镜下获取的病理部位标本和非病理部位样本作为对比，也可是非镜检方式如手 术或胃肠壁擦拭法获取的细胞、手术中获取的淋巴结等样本应立即提取RNA或置于液氮或 RNAlater (Ambion公司产品)中保存。外周血、骨髓或尿液样本首先通过离心机4000rpm，4°C，离心20分钟，取上清， 13000rpm，4°C，离心10分钟，分离上清和沉淀，立即提取RNA或置于_20°C至_80°C保存。TaqMan水解探针的Real-time PCR法上述样本用商业化的核酸抽提方法进行， 一个常用的非限制性例子是酚/氯仿抽提方法，如用Invitrogen公司生产的Trizol方 法抽提总RNA，并进行RNA质量鉴定，相关方法可参照《分子生物学实验》等参考书描述。 mRNA的逆转录过程采用商业化逆转录试剂盒并按操作说明书进行，所得cDNA按比例稀释 成需要的工作浓度。所用特异性引物经优化设计，CSTl的第一个剪切子的上下游引物设计
11在外显子1上。制备包含CSTl第一个剪切子扩增子的重组质粒，所需的质粒为商业化的 Pegm-T (promega)(图1)，上下游引物设计在外显子1，2上。采用基于TaqMan水解探针的 Real-time PCR法进行CSTl第一个剪切子扩增。针对CSTl第一个剪切子的引物和探针，最优的如下上游引物TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQID No 1)下游引物TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQID No 2)探针5'-FAM-CTCCAGCTTTGTGCTCTGCCTCT-TAMRA-3' (SEQ ID No :3)扩增长度 为 141bp。针对制备包含CSTl第一个剪切子扩增子的重组质粒的引物，最优的如下上游引物GGGCTCCCTGCCTCGGGCTCTCAC(SEQID No 22)下游引物ACGGTCTGTTGCCTGGCTCTTAGT(SEQID No 23)实验组，阳性对照组，阴性对照组与重组质粒标准品一起扩增。依据重组质粒浓度 梯度和扩增后对应的CP (cross point)作标准曲线。依据该标准曲线给出实验组、阳性对 照组和阴性对照组的拷贝数。染料法实时定量PCR 样本处理同TaqMan水解探针的Real-time PCR法，CST1，2，4 引物，上游AGTCCCAGCCCAACTTGGA(SEQ ID No 24)下游GGGAACTTCGTAGATCTGGAAAGA (SEQ ID No 25) ；CSTl的第一种剪切子的上下游引物同TaqMan水解探针的Real-time PCR法；CSTl的第二种剪切子的上下游引物，上游GCACTGGGGAAGAGAGGCAT(SEQ ID No 26)下游AGGAGCAGCAGGGTACTCAGATA(SEQ ID No :27)CST2 弓丨物，上游 CAGAAGAAACAGTTGTGCTC (SEQ ID No :28)下游GGAGTAGGAGGTGGTCAG(SEQ ID No :29)CST4 引物，上游GCTCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No 30)下游TATCCTATTCTCCTCCTTGG (SEQ ID No 31)内参基因 β-actin，上游引物AAGATCATTGCTCCTCCTG(SEQ ID No:32)，下游引物: CGTCATACTCCTGCTTGC(SEQ ID No :33)。癌和癌旁组织目的基因和内参基因一起扩增，通过 2"(-Δ ACT)公式计算目的基因在癌和癌旁组织中的相对表达量。荧光染料如SYBR Green, Eve Green, LC Green 等。核酸序列扩增法(NucleicAcid based Amplif icatin, NASBA)的体外 RNA 扩增 技术T7RNA聚合酶，RNase H，禽骨髓白血病病毒(AMV)逆转录酶，核糖核苷酸(NTP)，脱氧 核糖核苷酸(dNTP)，CSTl的第一个剪切子的上下游引物同TaqMan水解探针的Real-time PCR法，RNA荧光染料(Ribo-Green fluorescent dye)。42度，2小时，可将RNA模板扩增 2" (9-12)，反应产物放入荧光检测仪内检测荧光强度(U)，从而反应初始模板量。实施例1.人体不同组织中CSTl的表达差异所用人体组织标本除正常胃黏膜，结肠黏膜组织为发明人从合作医院收集外，其 它各组织均从商业化机构购买。采用Affymetrix的核苷酸芯片HG_U95Av进行各正常组织 CSTl mRNA表达比较，操作过程参照产品说明书。本实验的相对表达量的值是通过管家基因 β -actin荧光值进行归一化处理后的标准化信号值。结果如图2所示，除唾液腺中CSTl表达量较高外，其它组织中CSTl不表达，说明 CSTlmRNA表达在正常组织中的背景值很低，这对CSTl用于病理条件下检测极为有利。在胃 癌细胞株NCI-N87，结肠癌细胞株SW480，Caco2中过表达，在人胃上皮细胞GES-I，大肠癌细 胞株L0V0，HCTl 16中不表达，说明CSTl极有可能可作为胃癌，肠癌分子诊断的Marker。
实施例2.胃癌及癌旁手术组织样本CSTl与CST1，2，4，CST2 mRNA表达量比较通过比较20对(G1-G20)胃癌及癌旁组织中CST1, CST1，2，4，CST2 mRNA表达量， 发现CSTl mRNA在胃癌和癌旁组织中表达量差异最大，结果见图3。上述标本均通过病理证 明，采用染料法实时定量PCR。实施例3.胃癌、癌旁组织样本中CSTl第一种剪切方式(splicel)，第二种剪切方 式(spliCe2)表达量差异通过手术取样的样本均经病理验证后才进行RNA抽提和逆转录cDNA，采用染料 法实时定量PCR，首先检测样本中管家基因ACTB表达量，发现样本ACTB中CP值基本一 致，如图4a，也就是说样本中总的cDNA量基本一致，然后比较了 CSTl第一种剪切方式 (splicel)，第二种剪切方式(spliCe2)在20对胃癌、癌旁组织中的癌旁的CP值与癌之差 的中位数，见图4b，发现CSTl第一种剪切方式(splicel)在癌与癌旁中的表达量差异明显 优于splice2，也就是说CSTl第一种剪切方式(splicel)在判别是否为癌时，更具有优越 性。实施例4.胃癌、癌旁及正常手术组织样本CSTl的第一个剪切子(splicel)的表 达差异通过手术取样的样本均经病理验证后才进行RNA抽提和逆转录cDNA， Real-timePCR绝对定量法鉴定CSTl第一个剪切子在胃癌、癌旁以及正常组织中的表达差 异，测试样本数为100例。图5的结果表明，胃恶性病理条件下特异性高表达CSTl的第一个剪切子mRNA，而 癌旁及正常组织低表达。癌拷贝的中位数是癌旁/正常拷贝中位数的57. 5倍，提示CSTl 的第一个剪切子mRNA可作为良好的胃癌分子标志物。在100. 68拷贝处划线，可将癌与正 常区分开来，因此100. 68拷贝可作为胃癌临床诊断的一个参考值。实施例5.胃镜下取样的胃癌、胃炎中CSTl的第一个剪切子的表达差异胃镜下取样与手术取样的样本具有较大差别，主要表现在取样组织中胃癌细胞的 比例变动很大，有时可能仅占到整块组织的很小一部分，有的甚至没有。因此本发明人统计 比较了 36例胃癌以及36例胃炎病人胃镜取样标本中CSTl的第一个剪切子的表达差异，癌 标本拷贝数的中位数是炎标本拷贝数中位数的24倍，如果在98. 89拷贝处划线，可以将癌 和炎区分开来，可为胃镜下取样胃癌诊断提供一参考值。结果见图6，方法同样采用Real-time PCR绝对定量的方法。实施例6. CSTl的第一个剪切子在胃癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差
已 升手术中获得的经病理证明为胃癌转移阳性的淋巴结20枚，且转移灶大小不等。病 理阴性淋巴结15枚主要取自早期胃癌病人，原因是尽可能减少病理诊断阴性但实际有微 转移存在的淋巴结，以避免实验误差。实验采用Real-time PCR检测方法，具体材料和过程 同实施例2。图7的结果表明，CSTl的第一个剪切子在转移阳性淋巴结中高表达，而在阴性淋 巴结中只有较低表达。转移阳性淋巴结CSTl的第一个剪切子mRNA表达量是阴性淋巴结中 的11. 469倍。如果从98. 5拷贝处划线，基本可区分胃癌转移阳性和阴性淋巴结。病理阴 性淋巴结中有两例检出CSTl的第一个剪切子弱阳性的淋巴结，经病理医师连续切片细致观察，鉴定有微转移的存在。因此，从CSTl的第一个剪切子mRNA表达程度划分不仅100% 区分了细胞学检测结果，而且能检测细胞血不能检出的有微转移存在的淋巴结，相比细胞 学检测该检测方法具有更高的灵敏度。实施例7.定量PCR检测外周血中游离胃癌细胞的准确度与细胞学检测对比除去红细胞和血小板的外周血有核细胞提取RNA，经Real-time PCR方法定量检 测CSTl的第一个剪切子mRNA表达水平，通过和胃炎病人和正常人表达量的对比，判断胃癌 患者的外周血中是否有游离胃癌细胞的存在，并和细胞学检测比对。图8的结果表明，本发明的检测方法100%确认细胞学鉴定的阳性结果，同时可检 测出细胞学鉴定胃阴性的病例中有部分转移病例，说明该方法比细胞学检测具有更高的灵 敏度，能检测到细胞学无法检测的微转移的存在。实施例8.定量PCR方法检测胃癌骨髓转移与细胞学检查结果对比穿刺等方法获得的胃癌患者骨髓经Real-time PCR方法定量检测CSTl的第一个 剪切子mRNA表达水平，通过和正常骨髓的比较判断CSTl的第一个剪切子mRNA是否高表 达，确认骨髓是否存在转移和微转移，并与细胞学结果进行了比较。图9的结果表明，本发明的检测方法可95%确认细胞学阳性结果，同时阳性率高 于细胞学结果，表明敏感性比细胞学检测方法要高。实施例9.胃癌病人血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎/正常人的
差异应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA, Real-time PCR检测胃癌病人 (50例)血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差
已 升。结果如图10所示，图IOa显示CSTl第一个剪切子在癌中拷贝数的中位数是炎/正 常的约20倍，在拷贝数13. 972处划线，可将癌和炎/正常区分开来。图IOb的ROC曲线显 示基于CSTl第一个剪切子表达量诊断胃癌的方法具有较高的灵敏度和特异性，因此CSTl 可作为非侵入性的血浆样本胃癌诊断的特异性Marker。实施例10.连接酶链反应(Ligase chain reation, LCR)方法检测胃癌病人血样 Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎/正常人的差异应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA, Real-time PCR检测胃癌病人 (50例)血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差
已结果如图11所示，CSTl第一个剪切子在癌中相对荧光强度(relative light units, RLU)的中位数是炎/正常的约19倍，在相对荧光强度13. 66RLU处划线，可将癌和 炎/正常区分开来。实施例11 适温链置换扩增(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)方法胃癌病人血样Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎/正 常人的差异应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA, Real-time PCR检测胃癌病人 (50例)血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差
巳 ^to
14
结果见图12，CSTl第一个剪切子在癌中相对荧光强度(relative light units, RLU)的中位数是炎/正常的约19倍，在相对荧光强度12. 44RLU处划线，可将癌和炎/正常 区分开来。实施例12.胃癌病人尿样Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎/正常人 的差异应用商品化的试剂盒，抽提尿液中Cell-free RNA，荧光检测的核酸序列扩增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)检测胃癌病人(20 例)尿样 Cell-free RNA 中CSTl第一个剪切子量与炎(10例)，正常人(10例)的差异。结果如图13所示，CSTl第一个剪切子在癌中荧光强度的中位数是炎/正常的约7 倍，在14. 329U处划线，可将癌和炎/正常区分开来，即可作为非侵入性的尿液样本胃癌诊 断的一个参考值。实施例13. CSTl第一个剪切子表达量与胃癌pTW分期的关系应用商 品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA,应用Gen-probe转录介导的扩增 (Transcription-Mediated amplification, TMA)方法，检测 50例胃癌(pTNM分期，I+II 30 例，III+IV50例)不同分期CSTl第一个剪切子表达量的差异。结果见图14，CSTl第一个剪切子在胃癌I+II中相对荧光强度(relative light units, RLU)的中位数是III+IV的2. 1倍，在相对荧光强度(relative light units, RLU) 12. 44RLU处划线，可将癌和炎/正常区分开来。实施例14.大肠癌及癌旁手术组织样本CSTl的第一个剪切子的表达差异通过手术取样的样本均经病理验证后才进行RNA抽提和逆转录cDNA， Real-timePCR绝对定量法鉴定CSTl第一个剪切子在大肠癌和癌旁组织中的表达差异，测 试样本数为100对。图15的结果表明，结肠恶性病理条件下特异性高表达CSTl的第一个剪切子mRNA， 而癌旁的正常组织低表达。癌拷贝的中位数是癌旁拷贝中位数的48. 95倍，提示CSTl的第 一个剪切子mRNA可作为良好的肠癌分子标志物。在77. 7拷贝处划线，可将癌与正常区分 开来，因此77. 7拷贝可作为大肠癌临床诊断的一个参考值。实施例15.肠镜下取样的肠癌、肠炎中CSTl的第一个剪切子的表达差异。肠镜下取样与手术取样的样本具有较大差别，主要表现在取样组织中肠癌细胞的 比例变动很大，有时可能仅占到整块组织的很小一部分，有的甚至没有。因此本发明人统计 比较了 36例肠癌以及36例肠炎病人肠镜取样标本中CSTl的第一个剪切子的表达差异，癌 标本拷贝数的中位数是炎标本拷贝数中位数约23. 1倍，如果在87. 5拷贝处划线，可以将癌 和炎区分开来，可为肠镜下取样胃癌诊断提供一参考值。结果见图16，方法同样采用Real-time PCR绝对定量的方法。实施例16. CSTl的第一个剪切子在肠癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达 差异手术中获得的经病理证明为肠癌转移阳性的淋巴结20枚，且转移灶大小不等。病 理阴性淋巴结15枚主要取自早期肠癌病人，原因是尽可能减少病理诊断阴性但实际有微 转移存在的淋巴结，以避免实验误差。实验采用Real-time PCR检测方法，具体材料和过程 同实施例2。
图17的结果表明，CSTl的第一个剪切子在转移阳性淋巴结中高表达，而在阴性淋 巴结中只有较低表达。转移阳性淋巴结CSTl的第一个剪切子mRNA表达量是阴性淋巴结中 的11. 469倍。如果从100拷贝处划线，基本可区分肠癌转移阳性和阴性淋巴结。病理阴性 淋巴结中有两例检出CSTl的第一个剪切子弱阳性的淋巴结，经病理医师连续切片细致观 察，鉴定有微转移的存在。因此，从CSTl的第一个剪切子mRNA表达程度划分不仅100%区 分了细胞学检测结果，而且能检测细胞血不能检出的有微转移存在的淋巴结，相比细胞学 检测该检测方法具有更高的灵敏度。实施例17.肠癌病人血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎/正常人 的差异应用商品化的试剂盒，抽提血浆中Cell-free RNA, Real-time PCR检测肠癌病人 (50例)血浆Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎(30例)，正常人(30例)的差
已 升。结果如图18所示，图18a显示CSTl第一个剪切子在癌中拷贝数的中位数是炎/正 常的约20倍，在拷贝数13. 89处划线，可将癌和炎/正常区分开来。图18b的ROC曲线显 示基于CSTl第一个剪切子表达量诊断肠癌的方法具有较高的灵敏度和特异性，因此CSTl 可作为非侵入性的血浆样本肠癌诊断的特异性Marker。实施例18.肠癌病人尿样Cell-free RNA中CSTl第一个剪切子量与炎/正常人 的差异应用商品化的试剂盒，抽提尿液中Cell-free RNA，荧光检测的核酸序列扩增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)检测肠癌病人 C30 例)尿样 Cell-free RNA 中CSTl第一个剪切子量与炎(20例)，正常人(20例)的差异。结果如图19所示，CSTl第一个剪切子在癌中拷贝数的中位数是炎/正常的约7 倍，在拷贝数16. 96U处划线，可将癌和炎/正常区分开来，即可作为非侵入性的尿液样本肠 癌诊断的一个参考值。实施例19. CSTl第一个剪切子表达量用于胃癌、肠癌治疗过程中动态监测应用实时定量PCR方法，通过检测病人血液中CSTl第一个剪切子表达量，实时监 测胃癌化疗病人3人，放疗病人2人，肠癌化疗病人3人，放疗2人，治疗效果。结果见表1，治疗有效的病人CSTl第一个剪切子表达量随着疗程的增加逐渐降 低，影像学结果也显示，肿块逐渐减小；而治疗无效的病人CSTl第一个剪切子表达量随着 疗程的增加逐渐增加，影像学结果显示，肿块有变大的趋势。因此，CSTl第一个剪切子可作 为胃癌、肠癌患者治疗过程中一个动态监测的指标。表1为通过实时定量PCR检测放化疗过程中胃肠肿瘤患者血液中CSTl第一个剪
切子的量
1权利要求
一种用于预示和诊断胃肠肿瘤的检测方法，其特征在于所述方法包括(1)获得待测样品；(2)检测选自下列的编码mRNA的基因在待测样品中是否过表达；所述基因选自i)对应于SEQ ID No39的CST1基因；或ii)特异性识别选自CST1基因的mRNA、CST1剪切子、CST1基因或CST1基因剪切子的cDNA的其中一种的引物或探针所识别的基因；或iii)通过至少一种CST1引物对应的扩增子所鉴定的基因；当基因表达水平超过预定阈值时则预示胃肠肿瘤容易产生或已经形成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中引物选自对应于SEQ ID No :1 2或SEQ ID No :4 21中至少之一的引物；所述探针为对应于SEQ ID No:3序 列的探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物为对应于SEQIDNo :1和SEQ ID No 2的引物对，所述探针为对应于SEQ ID No 3的探针。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述CSTl基因或剪切子的引物对应的扩 增子的扩增方法选自聚合酶链反应法、实时定量PCR法、转录介导的扩增法、连接酶链反应 法、适温链置换扩增法、基于核酸序列的扩增方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述获得对应于SEQID No:43的CSTl 基因第一个剪切子的引物相对应的扩增子为CSTl基因第一个剪切子的引物通过实时定量 PCR法进行扩增而得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述CSTl第一个剪切子的扩增子为对应于 SEQ ID No 45的扩增子。
7.一种用于预示或检测胃肠肿瘤的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于捕获对应 于SEQ ID No 39的CSTl基因或对应于SEQ ID No :43的CSTl基因第一个剪切子的引物或 探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括使对应于SEQID No 39的CSTl基因或对应于SEQ ID No 43的CSTl基因第一个剪切子的引物相对应的扩增子 可视化的反应试剂；所述反应试剂包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、酶联凝胶法、电化学发光 技术、原位杂交技术、荧光检测法使CSTl基因或CSTl基因第一个剪切子的引物对应的扩增 子可视化的试剂。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括阳性参照品的胃癌细胞 株、作为阴性参照品的正常的胃细胞株、标准品、核酸提取试剂、逆转录试剂、聚合酶链反应 试剂、对应于SEQ ID No :1 2的引物对和对应于SEQ ID No 3的探针。
10.一种用于预示或检测胃肠肿瘤的基因芯片，其特征在于所述基因芯片包括用于捕 获对应于SEQ ID No :39的CSTl基因或对应于SEQ ID No :43的CSTl基因第一个剪切子的 引物或探针。
全文摘要
本发明公开了一种用于预示和诊断胃肠肿瘤的检测方法及其试剂盒和基因芯片，该方法包括以下步骤(1)获取待测样品；(2)检测选自下列编码mRNA基因在样品中是否过表达，所述基因为具有SEQ ID No39的CST1基因；或特异性识别CST1基因的mRNA、CST1剪切子(SEQ ID No43，SEQ ID No44)、CST1基因的cDNA、CST1剪切子的cDNA的其中一种的引物或/和探针所识别的基因；或通过至少一种CST1引物对应的扩增子所鉴定的基因。该方法可应用于胃肠癌症诊断、动态监测以及预后判断方面，该方法具有验证的样本量多，结果准确可靠、灵敏度高等优点。
文档编号C12Q1/68GK101985651SQ20101016068
公开日2011年3月16日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者渠香云, 王弢, 陈菲 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司