专利名称：：辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法及其专用引物。技术背景转化生长因子超家族(TransforminggrowthfactorB)是一类在结构上相对保守的生长因子家族，参与细胞增殖与分化等多种细胞生理活动，在胚胎发育、组织器官形态发生、细胞的分化、增值及免疫调节等方面都起着重要作用。TGFB2是TGFB家族成员之一，是影响动物体生长发育的内源性的负调控生长因子。所以，TGFB2基因的变异对动物的体重有显著的影响。鸡TGFB2基因被定位在3号染色体着丝粒末端70cM左右，全长70kp，由7个外显子，6个内含子组成。近几年来，许多研究将影响体重有关的QTLs定位在TGFB2基因所在区域或其区域附近。Kerje等(2003)以一个F2资源家系为材料，分别在鸡的3号染色体的50cM处和117cM处发现影响鸡8日龄体重和46日龄体重的QTLs。Ambo等(2009)研究发现影响35和41日龄体重性状的QTLs位于3号染色体的50-200cM处。因此，TGFB2基因可望成为鸡体重性状的候选基因，作为遗传标记应用于鸡分子育种中。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种特异性DNA体外扩增技术。以少量的DNA为模板，经过变性_退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子，目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。PCR产物经过琼脂糖电泳后即可进行基因型的鉴定工作，检测方法简单易行。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法及其专用引物。本发明提供了序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。所述引物对可应用于辅助鉴定具有不同体重性状的鸡。所述引物对可应用于制备辅助鉴定具有不同体重性状鸡的试剂盒。试剂盒中，还可包括其它PCR分析试剂。如DNA聚合酶、PCR缓冲液、dATP、dGTP、dCTP、dTTP等，这些PCR分析试剂均可为现有的常规试剂。本发明还保护辅助鉴定具有不同体重性状鸡的试剂盒，包括所述引物对。本发明提供的辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤(a)或步骤(b)(a)以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，没有得到336bpPCR产物的鸡的体重在统计学上高于得到336bpPCR产物的鸡的体重；(b)检测待测鸡的基因组DNA中是否具有序列表的序列2所示DNA片段；基因组DNA中不具有序列2所示DNA片段的鸡的体重在统计学上高于基因组DNA中具有序列2所示DNA片段的鸡的体重。本发明提供的辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤(a)或步骤(b)(a)以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，得到398bpPCR产物的鸡的体重在统计学上高于没有得到398bpPCR产物的鸡的体重；(b)检测待测鸡的基因组DNA中是否具有序列表的序列1所示DNA片段；基因组DNA中有序列1所示DNA片段的鸡的体重在统计学上高于基因组DNA中不具有序列1所示DNA片段的鸡的体重。本发明提供的辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤(a)或步骤(b)(a)以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增；如果得到398bpPCR产物且没有得到336bpPCR产物，待测鸡的基因型为AA；如果得到336bpPCR产物且没有得到398bpPCR产物，待测鸡的基因型为BB；如果得到398bp和336bp两种PCR产物，待测鸡的基因型为AB；AA基因型鸡的体重在统计学上高于AB基因型鸡的体重；AB基因型鸡的体重在统计学上高于BB基因型鸡的体重；(b)检测待测鸡的基因组DNA中是否具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；基因组DNA中为序列1所示DNA片段的纯合体，基因型为AA；基因组DNA中为序列2所示DNA片段的纯合体，基因型为BB；基因组DNA中为序列1和序列2所示DNA片段的杂合体，基因型为AB；AA基因型鸡的体重在统计学上高于AB基因型鸡的体重；AB基因型鸡的体重在统计学上高于BB基因型鸡的体重。本发明提供的辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤分别检测每只待测鸡的基因组DNA中是否具有特定DNA片段；基因组DNA中有特定DNA片段的鸡群体的平均体重在统计学上高于基因组DNA中不具有特定DNA片段的鸡群体的平均体重；所述特定DNA片段为序列表的序列1自5’端第37至98位核苷酸所示DNA片段。以上任一所述的方法中，所述待测鸡具体可为北京油鸡。以上任一所述的方法中，所述待测鸡具体可为母鸡。以上任一所述的方法中，所述待测鸡具体可为成鸡。所述待测鸡具体可为7周龄的鸡、11周龄的鸡、13周龄的鸡或17周龄的鸡。以上方法，试剂盒、引物对均可应用于鸡的育种。本发明基于检测鸡TGFB2基因g.-851_-790del多态位点，提供了辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法、引物对和试剂盒。本发明的方法具有如下优点简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，不需要特殊仪器，适合常规试验室检测的需要。图1为各个基因型的样本的PCR产物电泳图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、PCR引物对设计和制备对北京油鸡的若干个体的TGFB2基因(GenBank登录号X58071)及其周边区域进行检测。发现部分个体中，TGFB2基因启动子区内转录起始位点-851到-790处发生了一个62bp的缺失突变(g.-851_-790del)，从而影响了TGFB2基因的表达。根据突变区域设计引物对如下上游引物(F):5，-GGAGGAAAAGAGTGGAGTGCT-3，(序列3)；下游引物(R):5，-CTGCGTCTGCAATTCAGTTT-3，(序列4)。弓丨物由北京奥科生物公司合成。实施例2、应用PCR引物对辅助鉴定具有不同体重性状的鸡群体试验用鸡为北京油鸡母鸡(共1030只)，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所试验基地赠送，饲养于国家家禽测定中心，中国农业大学保证向公众提供。参考文献刘琛；文杰；赵桂苹；郑麦青；陈继兰；A-FABP和AMPDl基因SNP位点对北京油鸡部分肉质性状的组合效应分析、畜牧兽医学报，2009,40(10):1555-1559。一、表型记录测定个体的生长性状表型值7、11、13、17周龄体重。7、11、13周龄为早期体重。17周龄体重为成年体重。二、基因型检测1、血样采集9周龄时，翅下采血，加入A⑶抗凝，-20°C保存。2、血液基因组DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒DP318进行血液基因组DNA的提取。3、PCR扩增以步骤2提取的基因组DNA为模板，用实施例1制备的两条引物(序列3和序列4)作为引物对，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系(25μ1):DNA模板(lOOng/μ1)1μ1；两条引物各0.6μ1，终浓度均为IOpmol/μ1；dNTP混和物2.0μ1，四种dNTP的浓度均为2.5mmol/L；TaqDNA聚合酶(5υ/μ1)0.2μ1；10XPCR缓冲液(Mg2+Free)2.5μ1；25mmol/lMgCl21.5ul；加超纯水至25ul。PCR扩增条件先95°C预变性5min；然后95°C30s,61°C30s,72°C30s，共35个循环；最后72°C延伸IOmin04、测序分别将步骤3的PCR产物进行测序。结果表明，样本根据PCR产物可分为三种第一种PCR产物为一条DNA片段(398bp)，如序列表的序列1所示；将样本基因型命名为插入型纯合子(AA基因型)；第二种PCR产物为一条DNA片段(336bp)，如序列表的序列2所示；将样本基因型命名为缺失型纯合子(BB基因型)；第三种PCR产物为两条DNA片段(398bp和336bp)，分别如序列表的序列表的序列1和序列表的序列2所示；将样本基因型命名为杂合子(AB基因型)；序列2与序列1相比，缺失了序列1自5’端第37位至98位核苷酸。5、琼脂糖凝胶电泳将步骤3的PCR扩增产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。图1中泳道MDNA分子量标准MarkerI(天根)；泳道2、5、7、8、9、11插入型纯合子；泳道1、4、6、10杂合子；泳道3:缺失型纯合子。琼脂糖凝胶电泳结果表明，该1030只北京油鸡中插入型纯合子647只，杂合子356只，缺失型纯合子27只。三、关联分析采用SASV9.2软件的MIXED过程对7、11、13、17周龄体重和基因型进行关联分析，线性方程如下y=μ+S+D(S)+G+e；其中y=生长性状(7、11、13、17周龄体重观察值)μ=群体均值S=公鸡效应(随机效应)D=公鸡内母鸡效应(随机效应)G=基因型效应(固定效应)e=随机残差效应加性效应(a)和显性效应(d)计算公式为a=(AA-BB)/2；d=AB-(AA+BB)/2。Bofferoni多重比较结果见表1，关联分析的结果见表2。表IBofferoni多重比较结果一埤状—基因型7周体重(g)11周体重(g)13周体重(g)17周体重(g)553.50±4.75λ738.68±9.6Γ1003.05±8.97a1302.55±10.65Α纯合子_____杂合子535.18±5.45β712.20±11.38h978.04±10.24b1276.46±12.34ΑΒ535.80±13.43αβ690.82±30.57ab973.31±24.85β1211.65±31.31Β纯合子_____注Α，B表示差异极显著(P<0.01)；a,b表示差异显著(0.01<P<0.05)。表2g.-851_-790del基因型关联分析结果性状7周体重(g)11周体重(g)13周体重(g)17周体重(g)P值0.0013**0.0369*0.0241*0.0035**加性效应8.85+6.6323.93士15.3014.87士12.2445.45士15.54**<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注广表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(0.01<P<0.05)。关联分析结果表明3682基因8.-851_-790如1多态位点对北京油鸡7、17周龄体重达到极显著(P<0.01)水平，对11、13周龄体重达到显著水平(ρ<0.05)。Bonferroni多重比较分析证明了TGFB2插入型纯合子的平均体重显著高于杂合子和缺失型纯合子基因型的平均体重(P<0.05)。在11周龄以后，杂合子的平均体重，显著高于缺失型纯合子基因型的平均体重。等位基因替代效应表明，17周龄体重的加性效应达到了极显著的水平(P<0.01)，说明g.-851_-790del位点的效应是可遗传的。权利要求序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。2.权利要求1所述引物对在辅助鉴定具有不同体重性状鸡中的应用。3.权利要求1所述引物对在制备辅助鉴定具有不同体重性状鸡的试剂盒中的应用。4.一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的试剂盒，包括权利要求1所述引物对。5.一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤(a)或步骤(b)(a)以待测鸡的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，没有得到336bpPCR产物的鸡的体重在统计学上高于得到336bpPCR产物的鸡的体重；(b)检测待测鸡的基因组DNA中是否具有序列表的序列2所示DNA片段；基因组DNA中不具有序列2所示DNA片段的鸡的体重在统计学上高于基因组DNA中具有序列2所示DNA片段的鸡的体重。6.一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤(a)或步骤(b)(a)以待测鸡的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，得到398bpPCR产物的鸡的体重在统计学上高于没有得到398bpPCR产物的鸡体的体重；(b)检测待测鸡的基因组DNA中是否具有序列表的序列1所示DNA片段；基因组DNA中有序列1所示DNA片段的鸡的体重在统计学上高于基因组DNA中不具有序列1所示DNA片段的鸡的体重。7.一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤(a)或步骤(b)(a)以待测鸡的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增；如果得到398bpPCR产物且没有得到336bpPCR产物，待测鸡的基因型为AA；如果得到336bpPCR产物且没有得到398bpPCR产物，待测鸡的基因型为BB；如果得到398bp和336bp两种PCR产物，待测鸡的基因型为AB；AA基因型鸡的体重在统计学上高于AB基因型鸡的体重；AB基因型鸡的体重在统计学上高于BB基因型鸡的体重；(b)检测待测鸡的基因组DNA中是否具有序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段；基因组DNA中为序列1所示DNA片段的纯合体，基因型为AA；基因组DNA中为序列2所示DNA片段的纯合体，基因型为BB；基因组DNA中为序列1和序列2所示DNA片段的杂合体，基因型为AB；AA基因型鸡的体重在统计学上高于AB基因型鸡的体重；AB基因型鸡的体重在统计学上高于BB基因型鸡的体重。8.一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法，包括如下步骤检测待测鸡的基因组DNA中是否具有特定DNA片段；基因组DNA中有特定DNA片段的鸡的体重在统计学上高于基因组DNA中不具有特定DNA片段的鸡的体重；所述特定DNA片段为序列表的序列1自5’端第37至98位核苷酸所示DNA片段。9.如权利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述待测鸡为北京油鸡。10.如权利要求5至9中任一所述的方法，其特征在于所述待测鸡为7周龄的鸡、11周龄的鸡、13周龄的鸡或17周龄的鸡。全文摘要本发明公开了辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法及其专用引物。所述专用引物序列3和序列4所示DNA组成的引物对。所述引物对可用于辅助鉴定具有不同体重性状的鸡。所述方法以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR；如得到398bpPCR产物且没得到336bpPCR产物，鸡的基因型为AA；如得到336bpPCR产物且没得到398bpPCR产物，鸡的基因型为BB；如得到398bp和336bp两种PCR产物，鸡的基因型为AB；AA基因型鸡的体重在统计学上高于AB基因型鸡；AB基因型鸡的体重在统计学上高于BB基因型鸡。所述方法的优点如下简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，不需要特殊的仪器。文档编号C12N15/11GK101812450SQ20101016123公开日2010年8月25日申请日期2010年4月28日优先权日2010年4月28日发明者俞英,唐韶青,孙东晓,张毅,张沅,徐桂云,欧江涛,王雅春申请人:中国农业大学