专利名称：利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析 贝类遗传多样性的方法，更具体地说是一种利用fAFLP标记 技术分析贝类遗传多样性的方法。
背景技术：
AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态 性)技术是目前使用广泛且有效的遗传多样性检测方法，它集RFLPOtestriction Fragment LengthPolymorphism,限制性片段长度多态性)技术的稳定性和RAPD(Random AmplifiedPolymorphism DNA,随机扩增多态性DNA)技术的高效性于一身，具有所需DNA量 小、标记信息量大、多态性丰富、灵敏度高、快速高效、所得数据可靠等诸多优点，且不需预 先知道研究生物的遗传背景，不受组织器官种类、发育阶段、生境条件等因素的影响，结果 遵从孟德尔分离的特点，已被广泛应用于多种生物的遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱 构建、目的基因的克隆和定位等多个遗传学研究领域。在贝类研究方面，潘洁等(2002)应 用AFLP技术对栉孔扇贝的中国长岛群体和韩国东部、韩国西部群体3个群体进行了遗传多 样性分析。陈省平等(2005)对我国4种主要养殖扇贝——椅孔扇贝、华贵栉孔扇贝、虾夷 扇贝、海湾扇贝的群体遗传多样性及特异性AFLP标记进行了研究；万俊芬等(2004)研究了 鲍养殖群体AFLP标记位点及其遗传结构的影响。另外，潘洁等(2002)对栉孔扇贝抗病品 系的AFLP标记进行了分析，发现选育群体的遗传组成已经发生了一些改变。近年发展起来的fAFLP (荧光AFLP)技术是在传统AFLP技术的基础上，利用荧光 物质(FAM、R0X、J0E等)标记过的选择性引物扩增，产物在自动DNA测序仪上进行检测，所 得图像和数据可以自动采集，并且由于荧光内参的使用使实验结果更具准确性和可比性。 相对于传统AFLP技术来说，fAFLP技术省去了做胶、银染的麻烦和不稳定。所以，fAFLP技术不仅秉承了传统技术的优点，而且在高效性、稳定性、准确性 和可重复性等方面表现得更加优越，将成为分子标记技术发展的主流和趋势。目前在 海洋贝类方面，彭永兴等(2008)利用fAFLP技术对文蛤(Meretrix meretrix)、青蛤 (Cyclinasinensis)、菲 _ 宾 @ ff (Ruditapes philippinarum)禾口 IjJ 冑 @ (Mercenaria mercenariaM种帘蛤科贝类的群体遗传多样性和种间关系进行了研究，该文献中对酶切、 预扩增、选择性扩增方面作了试验，并给我们提供了一组反应体系；林志华等(2009)利用 fAFLP标记技术，对采集于广西的形态和壳色变异很大的2个文蛤群体以及山东文蛤群体 进行了遗传结构和亲缘关系研究，该文献在酶切、预扩增、选择性扩增方面没有提供可参考 的反应体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而另外提供一种高效、稳定、 准确的利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法，依次经过贝类DNA提取，限制性内切酶消化DNA，对酶切后的DNA进行接头 连接，PCR预扩增和选择性扩增，产物检测及图像和数据的采集和分析，其特征在于所述的 PCR预扩增和选择性扩增包括如下步骤a、DNA片段的预扩增取5μ L连接完成的DNA样品，加入50ng/y L的Mse I引 物 1. 5μ L，50ng/y L 的 EcoR I 引物 1. 5 μ L，IOXPCR Buffer 5· O μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0. 2μ L,2. 5mM d NTP 4. O μ L，加水至50 μ L，混勻后，在如下PCR条件扩增94°C预变性 2min，94°C变性30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，20个循环，引物带有一个碱基，为M00+C， 预扩增完成后，在琼脂糖胶中检测预扩增的效果；预扩±曾弓I 物为EOl :5 ‘ -GACTGCGTACCAATTCA-3 ‘ ；M02 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAAC-3‘；b、AFLP的选择性扩增荧光引物是在EcoR I引物的5'端加了荧光标记，用多 对引物组合对各个体进行了选择性扩增，取5μ L稀释的预扩增混合液，加入50ng/y L的 EcoR I 弓I 物 1 μ L，50ng/y L 的 Mse I 引物 lyL，2.5mM dNTP 1. 6 μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0. 2μ L, IOXPCR Buffer 2· O μ L，力口 H2O 至 20 μ L，PCR 扩增94°C 预变性 2min，94°C 变性 30S，65°C退火30S，72°C延伸60S，进行12个循环，每个循环退火温度降低0. 7°C，至56°C ； 94°C变性30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，进行8个循环，扩增完成后，取5 μ L在1 %琼脂 糖胶中检测扩增效果，扩增后的样品中加入15 μ L变性Buffer，混合，95°C变性5min后，立 刻冷却到4°C。进一步，所述的DNA提取为如下步骤取贝类的肌肉组织或内脏团，用酚/氯仿法 提取基因组DNA，并用1 %琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测DNA的纯度和完整性，调 整所有样品DNA的浓度在IOOng/ μ L。进一步，所述的限制性内切酶消化DNA为如下步骤用EcoR I、Mse I两种核酸内 切酶酶切，每个DNA样品酶切的混合液包括DNAlOOng，Mse I 5U, EcoR I 5U，酶切Buffer 8 μ L，加水至50μ L，37°C酶切3 6h，酶切完成后，65°C处理lOmin。进一步，所述的接头和连接处理为如下步骤取酶切完成后的样品，加入 2 μ mol/L 的 EcoR I 接头 1. O μ L，20 μ mol/L 的 Mse I 接头 1· O μ L，IOmM ATP 1· O μ L，IOU/ μ L的T4-DNA连接酶0. 2 μ L，10 X连接Buffer 5. O μ L,加水至50 μ L ； 16°C连接过夜，连 接结束后，65°C处理lOmin，EcoRI接头5' -CTCGTAGACTGCGTACC-3 ‘3' -CTGACGCATGGTTAA-5‘，]\^6 1接头5' -GACGATGAGTCCTGAG-3 ‘3' -TACTCAGGACTCAT-5‘。进一步，所述的产物检测为如下步骤在自动DNA测序仪上进行检测选扩产物在 ABI公司的3760XL型测序仪上进行检测。进一步，所述的图像和数据的采集和分析为如下步骤用GeneMarker 1. 6软件进 行分析，将100-500bp间的扩增带谱转换成0、1数据矩阵，用PopGene 32软件计算各群体 的多态率、基因多样性指数、香农信息指数以及种群间的相对遗传距离和遗传相似性系数。 与现有技术相比，本发明的优点在于采用fAFLP标记技术结合自创的反应体系， 对贝类遗传多样性分析来说高效、稳定、准确，另外，本方法具有扩增位点多，多态位点比例高，Nei基因多样性和香农信息指数大的优点。
图1为引物组合E33M62对SD种群和GX种群的银染AFLP扩增图谱。
图2为引物组合E33M62对SD种群和GX种群的fAFLP扩增图谱。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。下面结合文蛤不同地理群体AFLP多样性检测的银染法和荧光标记法具体实施 例，进一步阐述本发明的优越性。(1)高质量DNA的提取2006年7月，取文蛤山东种群(简称SD)和广西种群(简 称GX)各20个的闭壳肌，用酚/氯仿法提取基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分 光光度仪检测DNA的纯度和完整性，调整所有样品DNA的浓度在lOOng/μ L。(2)限制性内切酶消化DNA 用EcoR I、Mse I两种核酸内切酶酶切。每个DNA样 品酶切的混合液包括DNA100ng，Mse I 5U, EcoR I 5U，酶切Buffer 8 μ L，加水至50 μ L。 37°C酶切3 6h，酶切完成后，65°C处理lOmin。(3)接头连接
权利要求
1.一种利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法，依次经过贝类DNA提取，限制 性内切酶消化DNA，对酶切后的DNA进行接头连接，PCR预扩增和选择性扩增，产物检测及图 像和数据的采集和分析，其特征在于所述的PCR预扩增和选择性扩增包括如下步骤a、DNA片段的预扩增取5yL连接完成的DNA样品，加入^Ong/yL的MseI弓丨 物 1. 5μ L，50ng/y L 的 EcoR I 引物 1. 5 μ L，IOXPCR Buffer 5· O μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0. 2μ L,2. 5mM d NTP 4. O μ L，加水至50 μ L，混勻后，在如下PCR条件扩增94°C预变性 2min，94°C变性30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，20个循环，引物带有一个碱基，为M00+C， 预扩增完成后，在琼脂糖胶中检测预扩增的效果；预扩增 引 物为:E01 5 ‘ -GACTGCGTACCAATTCA-3 ‘ ；M02 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAAC-3‘；b、AFLP的选择性扩增荧光引物是在EcoRI引物的5'端加了荧光标记，用多对引物 组合对各个体进行了选择性扩增，取5 μ L稀释的预扩增混合液，加入50ng/ μ L的EcoR I 弓 I 物 1 μ L，50ng/ μ L 的 Mse I 引物 1 μ L，2. 5mM dNTP 1· 6 μ L，5U/ μ L 的 Taq 酶 0. 2 μ L, IOXPCR Buffer 2. O μ L，加 H2O 至 20 μ L，PCR 扩增94°C预变性 2min，94°C变性 30S，65°C 退火30S，72°C延伸60S，进行12个循环，每个循环退火温度降低0. 7°C，至56°C ；94°C变性 30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，进行8个循环，扩增完成后，取5 μ L在1 %琼脂糖胶中检 测扩增效果，扩增后的样品中加入15 μ L变性Buffer，混合，95°C变性5min后，立刻冷却到 4°C。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的DNA提取为如下步骤取贝类的肌 肉组织或内脏团，用酚/氯仿法提取基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度 仪检测DNA的纯度和完整性，调整所有样品DNA的浓度在lOOng/μ L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶消化DNA为如下步骤 用EcoR I、Mse I两种核酸内切酶酶切，每个DNA样品酶切的混合液包括DNAlOOng，Mse I 5U, EcoR I 5U，酶切Buffer 8 μ L，加水至50 μ L，37°C酶切3 6h，酶切完成后，65°C处理 IOmin0
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的接头和连接处理为如下步骤取酶 切完成后的样品，加入2ymol/L的EcoR I接头1. O μ L，20 μ mol/L的Mse I接头1.0 μ L， IOmM ATP 1. Ομ L，lOU/μ L 的 T4-DNA 连接酶 0. 2μ L，IOX 连接 Buffer 5. O μ L，加水至 501^;161连接过夜，连接结束后，651处理lOmin，已(；01 1接头5' -CTCGTAGACTGCGTACC-3 ‘3 ‘ -CTGACGCATGGTTAA-5‘，皿86 1接头5' -GACGATGAGTCCTGAG-3 ‘3 ‘ -TACTCAGGACTCAT-5‘。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产物检测为如下步骤在自动DNA 测序仪上进行检测选扩产物在ABI公司的3760 XL型测序仪上进行检测。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的图像和数据的采集和分析为如下步 骤用GeneMarker 1. 6软件进行分析，将100_500bp间的扩增带谱转换成O、1数据矩阵，用 PopGene 32软件计算各群体的多态率、基因多样性指数、香农信息指数以及种群间的相对 遗传距离和遗传相似性系数。
全文摘要
一种利用fAFLP标记技术分析贝类遗传多样性的方法，依次经过贝类DNA提取，限制性内切酶消化DNA，对酶切后的DNA进行接头连接，PCR预扩增和选择性扩增，产物检测及图像和数据的采集和分析。与现有技术相比，本发明的优点在于采用fAFLP标记技术结合自创的反应体系，可对贝类遗传多样性进行高效、稳定、准确地分析，另外，本方法具有扩增位点多，多态位点比例高，Nei基因多样性大的优点。
文档编号C12Q1/68GK102041303SQ20101016128
公开日2011年5月4日 申请日期2010年4月7日 优先权日2009年10月10日
发明者林志华, 董迎辉 申请人:浙江万里学院