一种制备羟基脂肪酸酯均聚物的方法及其专用菌的制作方法

专利名称：一种制备羟基脂肪酸酯均聚物的方法及其专用菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备羟基脂肪酸酯均聚物的方法及其专用菌。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一种能由许多微生物合 成的胞内聚酯，在微生物胞内以颗粒状的内含物形式存在，是细菌胞内的一种碳源和能源 的储备物。由于其与塑料相近的物理材料性能及生物可降解性能，被称为生物可降解塑料。 聚羟基脂肪酸酯具有如下的结构其中，m = 1，2，3或4，通常m = 1 ;n表示聚合度；R为高 度可变侧链，可以是饱和或不饱和、直链或支链、脂肪族或芳香族的基团。当R =乙基或以 下时，为短链PHA ；当R =庚基或以上时，为长链PHA ；当在两者中间时，为中链PHA。 近年来组织工程领域的研究结果表明PHA还具有良好的生物相容性，是非常有潜 力的生物医用材料。PHA按照其单体结构的不同，可以分为三类短链ΡΗΑ，其单体的碳原子 数小于6，如聚3-羟基丁酸酯ΡΗΒ，3-羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV ；短链中长链共聚ΡΗΑ，既 含有短链PHA单体，又含有中长链PHA单体，如聚3-羟基丁酸己酸酯；中长链ΡΗΑ，含有碳 原子数不小于6的单体。不同单体组成的PHA具有不同的物理性质，例如强度、延展性、结 晶速率等。随着长链3-羟基脂肪酸单体含量的升高，中长链PHA性能发生了质的变化，从 柔软甚至粘性变为具有弹性、结晶度以及刚性。一般来说，微生物只能合成聚3-羟基丁酸 酯PHB的均聚物，其它PHA的单体只能以共聚物的形式存在。目前还未发现有能合成非PHB 均聚物的微生物野生菌株。由于均聚物特有的一些性能，加上从均聚物可以方便地得到手 性羟基脂肪酸单体，所以进行均聚物的微生物合成显得十分必要。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)可以以脂肪酸或其盐为碳源，生物合成得到 聚羟基脂肪酸酯。恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2442是一株研究中长链PHA合成 的模式菌种。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组恶臭假单胞菌。本发明所提供的重组恶臭假单胞菌，如下述1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的使出发恶臭假单 胞菌中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶编码基因和3-酮酰辅酶A硫解酶编码基因的编码功能 丧失，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌I ；2)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的使所述重组恶臭 假单胞菌I中的3-羟基脂酰载脂蛋白辅酶A转移酶编码基因的编码功能丧失，得到重组恶 臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌II ；
3)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的向所述重组恶臭假单胞菌II中导入聚-β -羟基丁酸合成酶编码基因和4-羟基丁酰辅酶A转移酶编码基 因，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌III ；4)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的向所述重组恶臭 假单胞菌II中导入PHA颗粒结合蛋白的编码基因、烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因和PHA 合成酶编码基因，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌IV ；5)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的使所述重组恶臭 假单胞菌II中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因和脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因的 编码功能丧失，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌V。上述1)所示重组恶臭假单胞菌中，所述使出发恶臭假单胞菌中的3-羟基脂酰辅 酶A脱氢酶编码基因和3-酮酰辅酶A硫解酶编码基因的编码功能丧失是通过同源重组实 现的；所述同源重组的方法包括如下步骤向所述出发恶臭假单胞菌中导入序列表中序列 1所示DNA和序列表中序列2所示DNA，所述序列表中序列1所示DNA与所述出发恶臭假单 胞菌中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因发生同源重组，所述序列表中序列2所示 DNA与所述出发恶臭假单胞菌中的3-酮酰辅酶A硫解酶的编码基因发生同源重组，得到所 述重组恶臭假单胞菌I ；上述2)所示重组恶臭假单胞菌中，所述使所述重组恶臭假单胞菌I中的3-羟基 脂酰载脂蛋白辅酶A转移酶编码基因的编码功能丧失是通过同源重组实现的；所述同源重 组的方法包括如下步骤向所述重组恶臭假单胞菌I中导入序列表中序列3所示DNA，所述 序列表中序列3所示DNA与所述重组恶臭假单胞菌I中的3-羟基脂酰载脂蛋白辅酶A转 移酶的编码基因发生同源重组，得到所述重组恶臭假单胞菌II ；上述3)所示重组恶臭假单胞菌中，所述聚_ β _羟基丁酸合成酶编码基因和4-羟 基丁酰辅酶A转移酶编码基因是通过重组载体导入的；所述重组载体是按照如下方法制备得到的将质粒PKSSE5.3用限制性内切酶 BamHI和EcoRI进行酶切，回收大片段，记作大片段I ；将载体pBBRl_MCS2用限制性内切酶 BamHI和EcoRI进行酶切，回收载体大片段，记作大片段II ；将所述大片段I和所述大片段 II连接，得到所述重组载体；上述4)所示重组恶臭假单胞菌中，所述PHA颗粒结合蛋白的编码基因、烯脂酰辅 酶A水合酶的编码基因和PHA合成酶编码基因是通过重组载体导入的；所述重组载体是将 所述PHA颗粒结合蛋白的编码基因、PHA合成酶编码基因和烯脂酰辅酶A水合酶的编码基 因构成的融合基因插入载体PBBR1-MCS2的KpnI和EcoRI位点得到的；所述PHA颗粒结合 蛋白的编码基因位于所述融合基因的上游，所述PHA合成酶编码基因位于所述融合基因的 中游，所述烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因位于所述融合基因的下游；上述5)所示重组恶臭假单胞菌中，所述使所述重组恶臭假单胞菌II中的3-羟基 脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因和脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因的编码功能丧失是通过同源 重组实现的；所述同源重组的方法包括如下步骤向所述重组恶臭假单胞菌II中导入序列 表中序列9所示DNA和序列表中序列10所示DNA，所述序列表中序列9所示DNA与所述重 组恶臭假单胞菌II中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因发生同源重组，所述序列表 中序列10所示DNA与所述重组恶臭假单胞菌II中的脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因发生同源重组，得到所述重组恶臭假单胞菌V。上述1)所示重组恶臭假单胞菌中，所述序列表中序列1所示DNA和序列表中序列 2所示DNA是通过重组载体导入的；所述重组载体是将所述序列表中序列1所示DNA和表 中序列2所示DNA构成的融合基因插入出发载体pK18mobSacB的XbaI和HindIII位点得 到的；所述序列表中序列1所示DNA位于融合基因的上游，所述表中序列2所示DNA位于融 合基因的下游；

上述2)所示重组恶臭假单胞菌中，所述序列表中序列3所示DNA是通过重组载 体导入的；所述重组载体是将所述序列表中序列3所示DNA插入出发载体pKlSmobSacB的 HindIII和XmaI位点得到的；上述3)所示重组恶臭假单胞菌中，所述聚_羟基丁酸合成酶编码基因的核苷 酸序列如序列表中序列4所示，所述4-羟基丁酰辅酶A转移酶编码基因的核苷酸序列如序 列表中序列5所示；所述聚- β -羟基丁酸合成酶编码基因位于所述融合基因的上游，所述 4-羟基丁酰辅酶A转移酶编码基因位于所述融合基因的下游；上述4)所示重组恶臭假单胞菌中，所述PHA颗粒结合蛋白的编码基因的核苷酸序 列如序列表中序列6所示，所述烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因的核苷酸序列如序列表中 序列7所示；所述PHA合成酶编码基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示；所述重组载体是按照如下方法得到的以Aeromonas hydrophila 4AK4的基因 组DNA为模板，用如下引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；用限制性内切酶KpnI和EcoRI 对所述PCR扩增产物进行双酶切，回收基因片段；用限制性内切酶KpnI和EcoRI对载体 PBBR1-MCS2进行双酶切，回收酶切大片段；将所述基因片段与所述酶切大片段连接，得到 所述重组载体；上述5)所示重组恶臭假单胞菌中，所述序列表中序列9所示DNA和序列表中序列 10所示DNA是通过重组载体导入的；所述重组载体是将所述序列表中序列9所示DNA和序 列表中序列10所示DNA构成的融合基因插入出发载体pK18mobSacB的HindIII和BamHI位 点得到的；所述序列表中序列9所示DNA位于所述融合基因的上游，所述序列表中序列10 所示DNA位于所述融合基因的下游。上述任一所述的重组恶臭假单胞菌中，所述出发载体为pK18mobSaCB或 PBBR1-MCS2 ；所述出发恶臭假单胞菌为菌株Pseudomonas putida KT0Y06。上述任一所述的重组恶臭假单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用也属于本发 明的保护范围。本发明的最后一个目的是提供一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法。本发明所提供的制备聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤以脂肪酸、可溶性脂 肪酸盐或Y-丁内酯为碳源，用上述任一所述重组恶臭假单胞菌进行生物合成，得到聚羟 基脂肪酸酯。上述方法中，所述生物合成的方法包括如下步骤发酵上述任一所述重组恶臭假 单胞菌，得到含有所述重组恶臭假单胞菌的发酵液；向所述含有重组恶臭假单胞菌的发酵 液中加入所述脂肪酸或所述可溶性脂肪酸盐或所述Y-丁内酯，在温度为30°C的条件下继 续培养39h，得到聚羟基脂肪酸酯。上述方法中，所述脂肪酸为戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸或豆蔻酸，所述可溶性脂肪酸盐为戊酸钠、己酸钠、庚酸钠、辛酸钠、壬酸钠或癸酸钠。上述方法中，所述聚羟基脂肪酸酯为羟基脂肪酸酯均聚物或羟基脂肪酸酯共聚 物；所述生物合成的方法为如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌I，所述可溶性脂肪酸盐为庚 酸钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式I所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为 252X IO3Da,所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为455X IO3Da ；所述庚酸钠在所述含有恶 臭假单胞菌的发酵液中的浓度为5g/L ；
(式 I )2)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌II，所述可溶性脂肪酸盐为己酸 钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式II-I所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为 206X IO3Da,所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为272X IO3Da ；所述己酸钠在所述含有恶 臭假单胞菌的发酵液中的浓度为10g/L ；
(式 II-1)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌II，所述可溶性脂肪酸盐为辛酸 钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式II-2所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为 148X IO3Da,所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为ISOXlO3Da ；所述己酸钠在所述含有恶 臭假单胞菌的发酵液中的浓度为10g/L ； 3)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌III，所述碳源为Y-丁内酯，所述 聚羟基脂肪酸酯的化学式如式III所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为487X IO3Da, 所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为854X IO3Da ；所述γ - 丁内酯在所述含有恶臭假单胞 菌的发酵液中的浓度为5g/L;
(式 III)4)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌IV 所述可溶性脂肪酸盐为戊 酸钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式IV所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为 815X103Da，所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为1056X 103Da ；所述戊酸钠在所述含有恶 臭假单胞菌的发酵液中的浓度为5g/L ；
(式 IV)5)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌V 所述可溶性脂肪酸盐为癸酸 钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式V-I所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为 248. 6X IO3Da,所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为361. 4X IO3Da ；所述癸酸钠在所述含
有恶臭假单胞菌的发酵液中的浓度为2g/L ； 所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌V:所述脂肪酸为月桂酸，所述聚羟 基脂肪酸酯的化学式如式V-2所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为119. 4 X IO3Da,所 述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为155. 5X IO3Da ；所述月桂酸在所述含有恶臭假单胞菌的 发酵液中的浓度为6g/L;
(式 V-2)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌V 所述脂肪酸为豆蔻酸，所述聚羟 基脂肪酸酯的化学式如式V-3所示；所述豆蔻酸在所述含有恶臭假单胞菌的发酵液中的浓 度为4g/L ；
(式 V-3)上述方法中，所述含有重组恶臭假单胞菌的发酵液是按照包括如下步骤的方法得 到的将所述重组恶臭假单胞菌接种于LB-Km液体培养基中，在温度为30°C的条件下培养， 得到所述发酵液；所述LB-Km液体培养基由酵母提取物、蛋白胨、NaCl、硫酸卡那霉素和水 组成，酵母提取物在LB-Km液体培养基中的浓度为5g/L，蛋白胨在LB-Km液体培养基中的浓 度为10g/L，NaCl在LB-Km液体培养基中的浓度为10g/L，硫酸卡那霉素在LB-Km液体培养 基中的浓度为50μ g/mL。本发明的重组恶臭假单胞菌中，有的通过敲除脂肪酸的β氧化途径中某些基因 (如ΡΡ2047)，使其丧失编码功能，从而使该菌中的脂肪酸的β氧化途径被遏制；有的是在 脂肪酸的β氧化途径被遏制的基础上，进一步将脂肪酸的从头合成途径中的某些基因(如 PhaG)敲除，从而使该菌中的脂肪酸的从头合成途径被遏制，实现了脂肪酸的从头合成途径 和脂肪酸的β氧化途径同时被遏制；有的是在脂肪酸的β氧化途径和脂肪酸的从头合成 途径同时被遏制的基础上，进一步向菌中导入聚羟基脂肪酸酯合成的相关基因(如orfZ)。由于本发明的重组恶臭假单胞菌中脂肪酸的β氧化途径和脂肪酸的从头合成途 径均被削弱，使脂肪酸或可溶性脂肪酸盐底物既不进入β氧化途径也不进入脂肪酸的从 头合成途径，从而使底物的碳链既不被切除也不被增加，保证底物碳链长度的均一性，使碳 链长度均一的底物进入聚羟基脂肪酸酯合成途径，合成得到羟基脂肪酸酯均聚物。实验证明，无论用上述任何一种重组菌生物合成聚羟基脂肪酸酯，均可得到羟基 脂肪酸酯均聚物，尤其是中长链羟基脂肪酸酯均聚物(C4-C14)。得到的聚羟基脂肪酸酯均聚 物纯度高、产量高。本发明方法可以合成任意长度的中长链聚羟基脂肪酸酯均聚物，克服了 现有技术中生物合成只能得到3-羟基丁酸酯(HB)的均聚物的缺陷。因此，本发明方法在 羟基脂肪酸酯的均聚物的生物合成领域将有广阔的应用前景。


图1为质粒pK18mobSacB的图谱。图2为聚4羟基丁酸酯核磁共振图谱。图3为聚羟基戊酸酯核磁共振图谱。 图4为聚羟基己酸酯核磁共振图谱。图5为聚羟基庚酸酯核磁共振图谱。图6为聚羟基癸酸酯核磁共振图谱。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。酵母提取物购自英国OXOID公司，产品目录号为LP-0042 ；蛋白胨购自英国OXOID 公司，产品目录号为LP-0021 ；LB液体培养基每升培养基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余 为水。LB-Km液体培养基由酵母提取物、蛋白胨、NaCl、硫酸卡那霉素和水组成，酵母提 取物在LB-Km液体培养基中的浓度为5g/L，蛋白胨在LB-Km液体培养基中的浓度为10g/L， NaCl在LB-Km液体培养基中的浓度为10g/L，硫酸卡那霉素在LB-Km液体培养基中的浓度 为 50 μ g/mL0LB-Km固体培养基每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨， 10g/L NaCl和50 μ g/mL硫酸卡那霉素，其余为水。LBS-Amp固体培养基每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨， 10g/L NaCl和100 μ g/mL氨苄青霉素，其余为水。LB-Km-Amp固体培养基每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白 胨，10g/L NaClJOyg/mL硫酸卡那霉素和100 μ g/mL氨苄青霉素，其余为水。菌 株 Pseudomonas putida strain KT2442 (van der Meer, J R, van Neerven, A R, deVries, E J, et al. Cloning and characterization of plasmid—encoded genes for thedegradation of 1, 2-dichloro-,1,4-dichloro-, and 1, 2,4-trichlorobenzene ofPseudomonas sp. strain P51. J Bacteriol 173(1) :6_15 Jan 1991)(由i青华大学提供)。质粒 pK18mobSacB ( Schafer A, Tauch A, Jager W, et al. Small mobiIizblemulti-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 andpK19 !selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene 1994，145 :69_73)(由清华大学提供)。质粒 pK18mobSacB的图谱如图1所示。大肠杆菌E. coli S17-1 ATCC No. 47055 购自 ATCC0^^ Pseudomonas putida KTOYO6 (SP 0uyang,RC Luo,Q Liu,et al. Production ofpolyhydroxyalkanoates with high 3-hydroxydodecanoate monomer content by fadB andfadA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442. Biomacromolecules 2007,8: 2504-2511)(由清华大学提供)。
^ Pseudomonas putida KT0Y06 ^ I^J M M :Pseudomonas putida KT2442 3_羟基脂酰辅酶A脱氢酶基因(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, fadB)及3_酮酰辅 酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase，fadA)缺失突变株的构建1、用于缺失突变Pseudomonas putida KT2442中fadB及fadA基因的大肠杆菌克 隆载体的构建1)以 Pseudomonas putida strain KT2442 的基因组 DNA 为模板，在引物 Pl ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC 和 P2 CTGAAGCTTTGTAATGCCGGTATAC 的引导下，PCR 扩增相连 的两个基因，包括3-酮酰辅酶A硫解酶基因fadA片段(序列表中序列11自5'末端起第 1498-2674位核苷酸)和3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶基因fadB片段(序列表中序列11自 5'末端起第1-1467位核苷酸)，用限制性内切酶XbaI和HindIII对PCR扩增产物进行双 酶切，回收大小约为2. Skb的酶切片段； 2)用限制性内切酶XbaI和HindIII对质粒pK18mobSacB进行双酶切，回收酶切片 段；3)将步骤1)和步骤2)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，连接反应完成后， 将连接产物用电转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中，将转化子涂布于 LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中， 在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XbaI和HindIII对质粒进行 酶切鉴定，结果获得大小为5. 699kb及2. 783kb的DNA片段，进一步将质粒进行测序验证， 结果得到的序列正确，表明构建的质粒正确，将构建正确的含有fadA及fadBPCR片段的大 肠杆菌克隆载体命名为PSPK10。5)用限制性内切酶SalI对质粒pSPKlO进行酶切，回收6. 648kb的酶切片段；6)将步骤5)的回收片段用T4DNA连接酶进行自连，连接反应完成后，将连接产物 用电转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中，将转化子涂布于LB-Km固体 培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；7)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中， 在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XbaI和HindIII对质粒进行 酶切鉴定，结果产生大小为5. 699kb及0. 949kb的DNA片段，进一步测序验证，测得的序列 如序列表中序列11所示，表明构建的质粒正确，将构建正确的自杀质粒命名为pSPKll。2、通过构建好的自杀质粒pSPKll敲除Pseudomonas putida KT2442中fadB及 fadA基因，获得突变株Pseudomonas putida KT0Y06基因工程菌株1)挑取步骤1中获得的含有质粒pSPKll的重组菌E. coli S17-1 (pSPKll)，将 其接种到LB-Km液体培养基中，在37 °C、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonas putidaKT2442菌株接种到LB液体培养基中，在30°C、200rpm下摇床培养12h，然后各取 0. 5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，SOOOrpm离心2分钟，弃去上清液，再 加入ImL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30°C培养箱中1小时，用无菌接种环通过划 线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养 基中，在30°C、200rpm下摇床培养24h ；
3)用无菌接种环通过划线法将一环2)中所获菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板 上，在30°C培养箱中培养24h;4)在3)中的LBS-Amp固体培养平板上挑取20个单菌落，编号，并按次序将各单菌 落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h。5)挑取上一步骤中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体 培养平板上生长的单菌落，分别接种至LB-Amp液体培养基中，在30°C、200rpm下摇床培养 24h ；

6)将5)中获得的培养液各取1ml，离心，去上清，用200 μ 1无菌水重 悬。将重悬的菌液置于沸水浴中10分钟。冷却后，以该菌液为模板，在引物Pl: ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC 和 Ρ2 CTGAAGCTTTGTAATGCCGGTATAC 的引导下，进行 PCR 扩增 鉴定，再将质粒进行测序。结果PCR扩增获得949bp大小片段，测得序列也正确，证明构建 的质粒结构正确，也证明重组菌正确，将此突变株命名为Pseudomonas putida KT0Y06。实施例1、突变菌株Pseudomonas putida KT0Y08的构建及生物合成一、突变菌株 Pseudomonas putida KT0Y08 的构建(一)自杀质粒pSPKO9的构建1)以 Pseudomonas putida strain KT2442 的基因组 DNA 为模板，在引物 Pl ATTTCTAGAGCTGAACCCGGATGGC 和 P2 :AATAAGCTTGCCGAAGCGCAGGATC 的弓丨导下，PCR 扩增 相连的两个基因，3-酮酰辅酶A硫解酶基因(fadAx)和3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶基因 (fadB2x)，用限制性内切酶XbaI和HindIII对PCR扩增产物进行双酶切，回收大小约为 2. 7kb的酶切片段。2)用限制性内切酶XbaI和HindIII对质粒pK18mobSacB进行双酶切，回收大小约 为5. 699kb的酶切片段；3)将步骤1)和步骤2)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，连接反应完成后， 将连接产物用电转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中，将转化子涂布于 LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中， 在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XbaI和HindIII对质粒进 行酶切鉴定，结果产生大小为5. 699kb及2. 692kb的DNA片段，将构建正确的含有fadAx及 fadB2x完整基因的大肠杆菌克隆载体命名为pSPK08。5)用限制性内切酶SalI对质粒pSPK08进行酶切，回收6. 775kb的酶切片段；此 步骤中fadAx完整基因及fadB2x完整基因中的部分片段被切除，剩余的fadAx非完整片段 如序列表中序列2所示，剩余的fadB2x非完整片段如序列表中序列1所示。6)将步骤5)的回收片段用T4 DNA连接酶进行自连，连接反应完成后，将连接产物 用电转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中，将转化子涂布于LB-Km固体 培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆。7)验证将步骤6)得到的单克隆接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下 摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XbaI和HindIII对质粒进行酶切鉴定，结果得 到大小为5. 699kb及1. 066kb的DNA片段，说明质粒构建正确；再将质粒进行测序，结果表 明，插入的fadB2x上游片段和fadAx下游片段的融合片段序列为序列1和序列2构成的融合序列，融合片段位于出发载体pK18mobSacB的XbaI和HindIII位点间，进一步证明构建 的质粒结构正确；将构建正确的质粒命名为PSPK09。将含有质粒pSPK09 的 E. coli S17-1 记作重组菌 E. coli S17-1 (pSPK09)。(二)质粒 pSPKO9 转化菌株 Pseudomonas putida KT0Y06,得到突变菌株 Pseudomonasputida KT0Y08菌株Pseudomonas putida KT0Y06中含有Amp抗性基因；质粒pSPK09中含有Km
抗性基因；1)挑取步骤(一)中获得的含有质粒PSPK09的重组菌E. coli S17-1 (pSPK09)， 将其接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12h ；同时将Pseudomonas putidaKT0Y06菌株接种到LB-Amp液体培养基中，在30°C、200rpm下摇床培养12h ；然后各 取0. 5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，SOOOrpm离心2分钟，弃去上清液， 再加入ImL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30°C培养箱中1小时，用无菌接种环通过 划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养 基中，在30°C、200rpm下摇床培养24h ；3)用无菌接种环通过划线法将一环2)中所获菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板 上，在30°C培养箱中培养24h;4)在3)中的LBS-Amp固体培养平板上挑取20个单菌落，编号，并按次序将各单菌 落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h。5)挑取步骤4)中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体 培养平板上生长的单菌落。6)验证将步骤(5)获得的单菌落分别接种至LB-Amp液体培养基中，在 30°C、200rpm下摇床培养24h ；获得的培养液各取1ml，离心，去上清，用200 μ 1无菌 水重悬。将重悬的菌液置于沸水浴中10分钟。冷却后，以该菌液为模板，在引物Pl ATTTCTAGAGCTGAACCCGGATGGC 和 Ρ2 :AATAAGCTTGCCGAAGC GCAGGATC 的引导下，进行 PCR 扩 增。将PCR扩增产物进行测序。将测得的序列与序列1所示DNA(即fadB2x的上游片段) 和序列2所示DNA (即fadAx的下游片段)进行比对，，比对结果完全匹配，说明序列1所示 DNA与Pseudomonas putida KT0Y06基因组中的fadB2x基因发生了同源重组，序列2所示 DNA 与 Pseudomonas putida KT0Y06 基因组中的 fadAx 基因发生了同源重组，Pseudomonas putida KT0Y06基因组中的fadB2x基因和fadAx基因的大部分片段被敲除。将fadB2x基 因和fadAx基因大部分片段被敲除后的Pseudomonas putida KT0Y06命名为Pseudomonas putida KT0Y08。二、用突变菌株 Pseudomonas putida KT0Y08 生物合成得到 PHA庚酸钠购自上海国药集团；用Pseudomonas putida KT0Y08转化脂肪酸生产中长链PHA的摇瓶实验。(一)生物合成1)将 Pseudomonas putida KT0Y08 接种于 LB-Km 液体培养基中，在 30°C、200rpm 下摇床培养12h，再按5% (V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30°C、200rpm 下摇床培养9h，得到含有Pseudomonas putida KT0Y08的发酵液；
2)将庚酸钠加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KT0Y08的发酵液中，使发 酵液中庚酸钠的浓度为5g/L，然后在30°C、200rpm下继续摇床培养39h，得到生物合成后的 发酵液；3)得到的生物合成发酵液在SOOOrpm离心5分钟，收集菌体。4)收集的菌体用去离子水重悬，然后SOOOrpm离心5分钟，收集菌体。5)将收集的菌体用70%乙醇水溶液重悬，然后SOOOrpm离心5分钟，收集菌体。
6)收集得到的菌体在冷冻条件下进行真空抽干过夜，得到干菌体，用于气相色谱 分析。7)将干菌体称重放入反应釜中，以1 10的比例(体积比)加入氯仿，100°C下反
应4小时。8)将反应釜中溶有PHA的氯仿用滤纸过滤，得到母液按照1 10的比例(体积 比)加入冰乙醇沉淀。9)收集沉淀，进行常温真空抽干，得到的产物即为最后的PHA均聚物，用于核磁共 振法分析。(二)产物验证检测生物合成后的发酵液中菌体细胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、组 成。培养结束后按照文献(0uyang，S.P·；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法1)取干菌体约30mg于干燥的酯化管中，加入2ml氯仿，2ml酯化液(3%浓硫酸的 甲醇溶液)，于100°c反应4h ；2)加入Iml去离子水，混勻，静置过夜；3)取下层液体0. 5 μ 1进行气象色谱分析。1、均聚物结构验证PHA组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；均聚物的分子结构式
(式 I )数均分子量为252 X IO3Da (或重均分子量为455 X IO3Da)；均聚物PHHp的核磁共 振图谱如图5所示(a 聚羟基己酸酯核磁共振氢谱；b 聚羟基己酸酯核磁共振碳谱)。2、PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式
PHA含量=各单体含量之和
标准曲线斜率X单体峰面粉内标峰面积

单体含量=标准曲线斜率X单体峰面积/内标峰面积；结果突变菌株ΚΤ0Υ08在以庚酸钠为单一碳源的培养条件下，可以合成单体组成 只含有3-羟基庚酸(3Ηρ)的均聚物(表1)。表1、P. putida ΚΤ0Υ08转化脂肪酸生物合成PHA 实施例2、菌株Pseudomonas putida KT0Y08-G的构建及生物合成一、工程菌株 Pseudomonas putida KT0Y08-G 的构建(一 )重组载体pKQQOl的构建1)以 Pseudomonas putida KT2442 的基因组 DNA 为模板，用引物 phaG-up-l 和phaG-up-2进行PCR扩增，得到3-羟基脂酰载脂蛋白辅酶A转移酶编码基因 (3-hydroxyacyl-acylcarrier protein-coenzyme A transferase 或口H PhaG)的上游片段 (序列表中序列3自5'末端起第1-448位核苷酸所示)；用限制性内切酶XbaI和HindIII 对PCR扩增产物进行双酶切，回收大小约为400bp的酶切片段；以 Pseudomonas putida KT2442 的基因组 DNA 为模板，用引物 phaG-down-l 和phaG-down-2进行PCR扩增，得到3-羟基脂酰载脂蛋白辅酶A转移酶编码基因 (3-hydroxyacyl-acylcarrier protein-coenzyme A transferase 或口H PhaG)的下游片段 (序列表中序列3自5'末端起第449-913位核苷酸所示)；用限制性内切酶XbaI和XmaI 对PCR扩增产物进行双酶切，回收大小约为400bp的酶切片段；phaG-up-l =ATAGAT AAGCTT TATCGTGAACTGACGGCCAATGAGAphaG-up-2 :GC TCTAGA GCGATAGAACTCCGTGTAAACCCGAphaG-down-1 :GC TCTAGA GCAAGCATGTGGGCAGAAGCCAGTTCAphaG-down-2 :AT CCCGGG CATGGGCCAGGTCAAGGCAGGA2)用限制性内切酶XbaI和Hindi 11对质粒pK18mobSacB进行双酶切，回收酶切大 片段；3)将步骤1)的PhaG上游片段酶切产物和步骤2)的回收大片段用T4 DNA连 接酶进行连接，连接反应完成后，将连接产物用化学转化的方法导入到大肠杆菌E. coli S17-1 (ATCC编号47055)中，将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培 养 12h;4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中， 在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XbaI和HindIII对质粒进行 酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为448bp及5696bp的DNA片段，将构建正确的含有phaG上游PCR片段的大肠杆菌克隆载体命名为pKQQOl-1。5)用限制性内切酶XbaI和XmaI对质粒pKQQ01_l进行酶切，回收6145bp的酶切 片段；6)将步骤1)的phaG下游片段和步骤5)的回收片段用T4 DNA连接酶进行连接， 连接反应完成后，将连接产物用化学转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055) 中，将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；挑取在LB-Km固体 培养平板上长出的单克隆。7)验证将步骤6)得到的单克隆接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下 摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶XbaI和XmaI对质粒进行酶切鉴定。结果得到 大小为467bp及6145bp的DNA片段；再将质粒进行测序，结果表明，测得的序列如序列表中 序列3所示，并且序列表中序列3所示的基因(即PhaG基因的上游片段与下游片段的融合 基因，但不是完整的PhaG基因)位于出发载体pK18mobSacB的HindIII和XmaI位点间，证 实构建的质粒结构正确，将构建正确的含有PhaG上游和下游两段PCR片段的大肠杆菌克隆 载体命名为pKQQOl。

将含有质粒pKQQOl 的 E. coli S17-1 命名为重组菌 E. coli S17-1 (pKQQOl)。( 二)工程菌株 Pseudomonas putida KT0Y08-G 的构建1)挑取步骤(一)中获得的含有质粒pKQQOl的重组菌E. coli S17-1 (pKQQOl)， 将其接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12h ；同时将Pseudomonas putidaKT0Y08菌株接种到LB液体培养基中，在30°C、200rpm下摇床培养12h ；然后各取 0. 5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，SOOOrpm离心2分钟，弃去上清液，再 加入ImL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30°C培养箱中1小时，用无菌接种环通过划 线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养 基中，在30°C、200rpm下摇床培养24h ；3)用无菌接种环通过划线法将一环2)中所获菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板 上，在30°C培养箱中培养24h;4)在3)中的LBS-Amp固体培养平板上挑取20个单菌落，编号，并按次序将各单菌 落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h。5)挑取上一步骤中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体 培养平板上生长的单菌落。6)验证将步骤5)得到的单菌落分别接种至LB-Amp液体培养基中，在 30°C、200rpm下摇床培养24h ；获得的培养液各取1ml，离心，去上清，用200 μ 1无菌 水重悬。将重悬的菌液置于沸水浴中10分钟。冷却后，以该菌液为模板，在引物Pl ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC 和 Ρ4 :ATACCCGGGCCGGAGTAGATGC GGAACGACAACG 的引导下， 进行PCR扩增。将扩增片段大小约为SOObp的PCR扩增产物进行测序。将测得的序列与 序列3所示DNA(即PhaG基因的上游片段与下游片段的融合片段，但不是完整的PhaG基 因)进行比对，比对结果完全匹配，说明序列3所示DNA与Pseudomonas putida KT0Y08 基因组中的phaG基因发生了同源重组，Pseudomonas putida KT0Y08基因组中的phaG 基因的大部分片段被敲除。将PhaG基因的大部分片段被敲除后的Pseudomonas putidaKT0Y08命名为Pseudomonas putida KT0Y08-G。判断发生同源重组的原理首先扩增的序 列大小要在913bp左右，然后测序的结果要和上述的phaG基因的上游片段与下游片段的 融合基因，但不是完整的PhaG基因相匹配。就是说如果在没有敲除的情况下用phaG-up-1 和phaG-down-2这两条引物以基因组为模板进行PCR，那么得到的序列将会是1552bp，这 1552bp包括上述的phaG基因的上游片段与下游片段的融合基因，但同时还包括phaG基因 的大部分片段，而重组成功的则把PhaG基因的大部分片段重组掉了，只留下了 phaG基因的 上游片段与下游片段的融合基因。二、用工程菌株 Pseudomonas putida KT0Y08-G 生物合成，得到 PHA用Pseudomonas putida KT0Y08-G转化脂肪酸生产中长链PHA的摇瓶实验。

(一)生物合成己酸钠购自上海国药集团；辛酸钠购自上海国药集团；IMfPseudomonas putida KT0Y08-G接种于LB-Km液体培养基中，在 30°C、200rpm 下摇床培养12h，再按5% (V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30°C、200rpm 下摇床培养9h，得到含有Pseudomonas putida KT0Y08-G的发酵液；2)分别将己酸钠和辛酸钠加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KT0Y08-G 的发酵液中，使得发酵液中己酸钠、辛酸钠的浓度均为10g/L，然后在30°C、200rpm下继续 摇床培养39h，得到生物合成后的发酵液。3)获得菌体的方法与实施例1中所述一致。(二)产物验证检测生物合成后的发酵液中菌体细胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、组 成。培养结束后按照文献(Ouyang，S.P.；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌体的前处理方法与实施例1中所述一致。1、以己酸钠为底物时的产物验证(I)PHA组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；结果均聚物的分子结构式
(式 II-1)数均分子量为206 X IO3Da (或重均分子量为272 X IO3Da)；均聚物HHx的核磁共振 图谱如图4所示(a 聚羟基己酸酯核磁共振氢谱；b 聚羟基己酸酯核磁共振碳谱)。(2) PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式 与实施例1中所述一致。
结果突变菌株KT0Y08在以己酸钠为单一碳源的培养条件下，可以合成单体组成 只含有3-羟基己酸(3HHx)的均聚物，(表2)。2、以辛酸钠为底物时的产物验证(I)PHA组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；结果共聚物的分子结构式
(式 II-2)共聚物的数均分子量为148 X IO3Da (或重均分子量为180 X IO3Da)；(2) PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式PHA含量=各单体含量之和 单体含量=标准曲线斜率X单体峰面积/内标峰面积；结果突变菌株KT0Y08在以辛酸钠为单一碳源的培养条件下，可以合成单体组成 含有3-羟基己酸(3HHx)和3-羟基辛酸(3H0)的共聚物，(表2)。表2. P. putida KT0Y08-G转化脂肪酸生物合成PHA。 实施例3、菌株Pseudomonas putida KTHH06的构建及生物合成PHA载体 pKSSE5. 3(Hein S, Sohling B, Gottschalk G, Steinbuchel A. Biosynthesis ofpoly(4-hydroxybutyric acid)by recombinant strains of Escherichia coli. FEMSMicrobiol. Lett. 1997 ；153 :411-418.)(由清华大学提供)；载体pKSSE5. 3中含有来自于罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)基因组的 聚-β-羟基丁酸合成酶编码基因(phbC基因)；来自于罗氏真养菌(Ralstonia eutropha) 基因组的聚-β-羟基丁酸合成酶编码基因(phbC基因)的核苷酸序列如序列表中序列4 所示，为1767bp。载体pBBRl-MCS2(Michael Ε.Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill etal· Fournew derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995 ； 166 :175_176·)(由清华大学 提供)；载体pBBRl-MCS2中含有来自于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)基因组的4-羟 基丁酰辅酶A转移酶编码基因(orfZ基因)；来自于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)基 因组的4-羟基丁酰辅酶A转移酶编码基因(orfZ基因)的核苷酸序列如序列表中序列5 所示，为1290bp。一、菌株 Pseudomonas putida KTHH06 的构建(一)载体pBHHOl的构建 1)将质粒pKSSE5. 3用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行酶切，得到4520bp禾口 2943bp的2个DNA片段，回收大小为5420bp DNA片段。将载体pBBRl-MCS2用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行酶切，得到18bp和5126bp 的2个DNA片段，回收大小为5126bp DNA片段。2)将步骤1)的5420bp bp和5126bp两个DNA片段用T4 DNA连接酶进行连接，连 接反应完成后，将连接产物用化学转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中， 将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；3)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中， 在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶BamHI和EcoRI对质粒进行 酶切鉴定。结果得到酶切后产生大小5420bp和5126bp两个DNA片段的质粒，为阳性质粒， 将得到的正确的含有PhbC and orfZ(Ralstonia eutropha)基因的大肠杆菌克隆载体命名 为 pBHHOl。将pBHHOl进一步测序验证，结果表明，序列4所示基因(phbC基因)与序列5所 示基因(orfZ基因)构成融合基因(融合基因序列为序列4和序列5融合后的序列)，phbC 基因位于融合基因的上游，orfZ基因位于融合基因的下游。将含有pBHHOl 的 E. coli S17-1 记作重组菌 E. coli S17-1 (pBHHOl)。( 二 )质粒 pBHHOl 转化 Pseudomonas putida KT0Y08-G1)挑取步骤(一)中获得的含有质粒pBHHOl的重组菌E. coli S17-1 (pBHHOl)， 将其接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12h ；同时将Pseudomonas putidaKT0Y08-G菌株接种到LB液体培养基中，在30°C、200rpm下摇床培养12h ；然后各取 0. 5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，SOOOrpm离心2分钟，弃去上清液，再 加入ImL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30°C培养箱中1小时，用无菌接种环通过划 线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆。3)验证从步骤(2)获得的单克隆中提取质粒，用限制性内切酶BamHI和EcoRI 对质粒进行酶切鉴定，结果，获得大小为5420bp和5126bp两个DNA片段，证实单克隆中导 入的质粒为pBHHOl。将含有质粒pBHHOl的突变株KT0Y08-G命名为Pseudomonas putida KTHH06。二、用菌株 Pseudomonas putida KTHH06 合成 PHA用Pseudomonas putida KTHH06转化脂肪酸生产PHA的摇瓶实验。
Y-丁内酯购自上海国药集团。(一 )生物合成

1)将 Pseudomonas putida KTHH06 接种于 LB-Km 液体培养基中，在 30°C、200rpm 下摇床培养12h，再按5% (V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30°C、200rpm 下摇床培养9h，得到含有Pseudomonas putida KTHH06的发酵液；2)将Y-丁内酯加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KTHH06的发酵液中， 使得发酵液中Y-丁内酯的浓度为5g/L，然后在30°C、200rpm下继续摇床培养39h，得到生 物合成后的发酵液。3)获得菌体的方法与实施例1中所述一致。(二)产物验证检测生物合成后的发酵液中菌体细胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、组 成。培养结束后按照文献(Ouyang，S.P.；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌体的前处理方法与实施例1中所述一致。1、均聚物结构验证P4HB组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；均聚物的分子结构式
III)数均分子量为487 X IO3Da (或重均分子量为854 X IO3Da)；均聚物P4HB的核磁共振图谱如图2所示(a 聚羟基丁酸酯核磁共振氢谱；b 聚羟 基丁酸酯核磁共振碳谱)。2、PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式与 实施例1中所述相同。结果突变菌株KT0Y08在以Y - 丁内酯为单一碳源的培养条件下，可以合成单体 组成只含有4-羟基丁酸(4HB)的均聚物，(表3)。上述结果表明，在Y-丁内酯的存在下，4-羟基丁酸(HD)均聚物P4HB的形成(表 3)。表3. P. putida KTHH06转化脂肪酸生物合成PHA。 实施例4、菌株Pseudomonas putida KTHH08的构建及生物合成一、菌株 Pseudomonas putida KTHH08 的构建菌株嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila) 4AK4基因组中PHA颗粒结合蛋 白的编码基因(PhaP)片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示，菌株嗜水气单孢菌 (Aeromonashydrophila) 4AK4基因组中烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因(phaj)片段的核 苷酸序列如序列表中序列7所示；菌株嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila) 4AK4基因组 中聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶编码基因(又称PHA合成酶编码基因、PHBHHx合酶基因或 PhaC基因)的核苷酸序列如序列表中序列8所示。

菌株嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)4AK4(van der Meer, J R, van Neerven, A R, de Vries, E J, et al.Cloning and characterization of plasmid-encoded genes forthe degradation of 1,2-dichloro-,1,4-dichloro-,and 1， 2,4-trichlorobenzene ofPseudomonas sp. strain P51. J Bacteriol 173 (1) 6-15 Jan 1991)(由清华大学提供)。(一)质粒pZWJ4-31 的构建1)以 Aeromonas hydrophila 4AK4 的基因组 DNA 为模板，在引物 Pl TTTGGTACCTGGAGACCGATGATGAATATGG 和 P2 :ATGAATTCTTAAGGCAGCTTGACCACGG 的引导下，PCR 扩增相连的3个基因，包括PHA颗粒结合蛋白基因(phaP)片段、PHBHHx合酶基因(phaC)片 段和烯脂酰辅酶A水合酶基因(phaj)片段；用限制性内切酶KpnI和EcoRI对PCR扩增产 物进行双酶切，回收大小约为2. 6kb的酶切片段；PCR扩增产物中含有如下融合片段phaP 片段、phaC片段和phaj片段依次连接构成的融合片段，融合片段的基因序列为序列序列6、 序列8和序列7依次连接构成的序列；所述PHA颗粒结合蛋白基因(phaP)位于所述融合基 因的上游，所述PHA合酶基因(phaC)位于所述融合基因的中游，所述烯脂酰辅酶A水合酶 基因(PhaJ)位于所述融合基因的下游。2)用限制性内切酶KpnI和EcoRI对质粒pBBRl_MCS2进行双酶切，回收酶切大片 段；3)将步骤1)和步骤2)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，连接反应完成后， 将连接产物用电转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中，将转化子涂布于 LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中， 在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶KpnI和EcoRI对质粒进行 酶切鉴定，结果产生大小为5. IOOkb及2. 643kb的DNA片段，初步验证质粒构建正确，进一 步进行测序验证，结果测得的融合片段的序列正确，且融合序列位于PBBR1-MCS2的KpnI和 EcoRI间，表明构建的质粒正确，将构建正确的含有融合片段(phaP片段、phaC片段和phaj 片段)的大肠杆菌克隆载体命名为PZWJ4-31。将含有质粒pZWJ4-31 的 E. coli S17-1 记作重组菌 E. coli S17-1 (pZWJ4-31)。( 二 )菌株 Pseudomonas putida KTHH08 的构建1)挑取步骤(一)中获得的含有质粒pZWJ4-31的重组菌E. coli S17-1 (pZWJ4-31)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12h ；同时 将Pseudomonasputida KT0Y08-G菌株接种到LB液体培养基中，在30°C、200rpm下摇床培养12h ；然后各取0. 5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，SOOOrpm离心2分 钟，弃去上清液，再加入ImL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30°C培养箱中1小时，用 无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30°C培养箱 中培养24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆。3)验证从步骤(2)得到的单克隆中提取质粒，并用限制性内切酶PstI对质 粒进行酶切；结果得到大小为1754bp、2087bp及3902bp的DNA片段，表明导入的质粒为 pZWJ4-31o 将含有质粒 pZWJ4-31 的突变株 KT0Y08-G 命名为 Pseudomonas putida KTHH08。二、用Pseudomonas putida KTHH08转化脂肪酸生产PHA的摇瓶实验

戊酸钠购自上海国药集团。(一 )生物合成1)将 Pseudomonas putida KTHH08 接种于 LB-Km 液体培养基中，在 30°C、200rpm 下摇床培养12h，再按5% (V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30°C、200rpm 下摇床培养9h，得到含有Pseudomonas putida KTHH08的发酵液；2)将戊酸钠加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KTHH08的发酵液中，使得 发酵液中戊酸钠的浓度为5g/L，然后在30°C、200rpm下继续摇床培养39h，得到生物合成后 的发酵液。3)获得菌体的方法与实施例1中所述一致。( 二)产物验证检测生物合成后的发酵液中菌体细胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、组 成。培养结束后按照文献(Ouyang，S.P. ；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌体的前处理方法与实施例1中所述一致。1、均聚物结构验证PHA组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；均聚物的分子结构式
O a/
2(式 IV)数均分子量为815 X IO3Da (或重均分子量为1056 X IO3Da)；均聚物HV的核磁共振图谱如图3所示(a 聚羟基戊酸酯核磁共振氢谱；b 聚羟基 戊酸酯核磁共振碳谱)。2、PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式与 实施例1中所述相同。
结果突变菌株KT0Y08在以戊酸钠为单一碳源的培养条件下，可以合成单体组成 只含有3-羟基戊酸(3HV)的均聚物，(表4)。上述结果表明，在戊酸钠的存在下，3-羟基戊酸(HV)均聚物PHV的形成(表4)。。表4. P. putida KTHH08转化脂肪酸生物合成PHA。 实施例5、菌株Pseudomonas putida KTQQ20的构建及生物合成一、菌株 Pseudomonas putida KTQQ20 的构建(一 )大肠杆菌克隆载体PKQQ12的构建1)以Pseudomonas putida KT2442的基因组DNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR 扩增，得到3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶基因PP2047的上游片段(PP2047的上游片段的序列 如序列表中序列9所示)；用限制性内切酶HindIII和PstI对PCR扩增产物进行双酶切， 回收大小约为430bp的酶切片段；以Pseudomonas putida KT2442的基因组DNA为模板，用引物P3和P4进行PCR 扩增，得到脂酰辅酶A脱氢酶基因PP2048的下游片段(PP2048的下游片段如序列表中序列 10所示)；用限制性内切酶PstI和BamHI对PCR扩增产物进行双酶切，回收大小约为488bp 的酶切片段；Pl:AATAAGCTTGCGATGGCTGCGCTGAP2 CATCTGCAGGATTGATCGGGAAGGGAP3 :AATCTGCAGCTAGCGCACGGCAAACP4 TGATGGATCCTCCGAACCGGTACCTG2)用限制性内切酶HindIII和PstI对质粒pK18mobSaCB进行双酶切，回收酶切大 片段；3)将步骤1)的上游片段和步骤2)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，连接反 应完成后，将连接产物用化学转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中，将转 化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中， 在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶PstI和Hindi 11对质粒进行 酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小为430bp的DNA片段，将构建正确的含有PP2047 上游PCR片段的大肠杆菌克隆载体命名为PKQQ12-1。5)用限制性内切酶PstI & BamHI对质粒pKQQ12_l进行酶切，回收6576bp的酶切 片段；6)将步骤1)的下游片段和步骤5)的回收片段用T4DNA连接酶进行连接，连接反 应完成后，将连接产物用化学转化的方法导入到E. coli S17-1(ATCC编号47055)中，将转 化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37°C培养箱中培养12h ；挑取在LB-Km固体培养平板 上长出的单克隆。7)验证将步骤6)得到的单克隆接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶PstI和NcoI对质粒进行酶切鉴定，结果获得大 小为1598bp及5022bp的DNA片段；将质粒进行测序，结果表明，序列9所示DNA (即PP2047 的上游片段)和序列10所示DNA (即PP2048的下游片段)构成融合片段，融合片段(融合 片段的序列为序列9和序列10融合构成的序列)位于出发载体pK18mobSacB的HindIII 和BamHI位点间，证明质粒结构正确，将构建正确的含有PP2047上游和PP2048下游的两段 PCR片段的大肠杆菌克隆载体命名为PKQQ12。所述序列表中序列9所示DNA(PP2047上游 片段)位于所述融合基因的上游，所述序列表中序列10所示DNA(PP2048下游片段)位于 所述融合基因的下游。( 二 )通过自杀质粒 pKQQ12 敲除 Pseudomonas putida KT0Y08-G 中 PP2047 禾口 PP2048基因

1)挑取步骤(一)中获得的含有质粒PKQQ12的重组菌E. coli S17-1 (ρ_2)， 将其接种到LB-Km液体培养基中，在37°C、200rpm下摇床培养12h ；同时将Pseudomonas putidaKT0Y08-G菌株接种到LB液体培养基中，在30°C、200rpm下摇床培养12h ；然后各取 0. 5mL上述两种菌株的培养液混合至同一无菌小管中，SOOOrpm离心2分钟，弃去上清液，再 加入ImL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，置于30°C培养箱中1小时，用无菌接种环通过划 线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Amp液体培养 基中，在30°C、200rpm下摇床培养24h ；3)用无菌接种环通过划线法将一环2)中所获菌液涂布于LBS-Amp固体培养平板 上，在30°C培养箱中培养24h;4)在3)中的LBS-Amp固体培养平板上挑取20个单菌落，编号，并按次序将各单菌 落分别接种在LBS-Amp固体培养平板和LB-Km固体培养平板上，在30°C培养箱中培养24h。5)挑取上一步骤中只能在LBS-Amp固体培养平板上生长而不能同时在LB-Km固体 培养平板上生长的单菌落。6)验证将步骤5)获得的单菌落分别接种至LB-Amp液体培养基中，在 30°C、200rpm下摇床培养24h ；获得的培养液各取1ml，离心，去上清，用200ul无菌 水重悬。将重悬的菌液置于沸水浴中10分钟。冷却后，以该菌液为模板，在引物Pl AATAAGCTTGCGATGGCTGCGCTGA 和 P4 TGATGGATCCTCCGAACCGGTA CCTG 的引导下，进行 PCR 扩 增。将PCR扩增产物进行测序。将测得的序列与序列9所示DNA(即PP2047的上游片段) 和序列10所示DNA(即PP2048的下游片段)的融合片段进行比对，结果完全匹配，说明序 列9所示DNA与Pseudomonas putidaKT0Y08-G基因组中的PP2047基因发生了同源重组， 序列10所示DNA与Pseudomonas putidaKT0Y08_G基因组中的PP2048基因发生了同源重 组，Pseudomonas putida KT0Y08-G基因组中的PP2047基因的大部分片段和PP2048基因 的大部分片段被敲除。将PP2047基因的大部分片段和PP2048基因的大部分片段被敲除后 ^ Pseudomonas putida KT0Y08-G ^^^J Pseudomonasputida KTQQ20。二、用Pseudomonas putida KTQQ20转化脂肪酸生产PHA的摇瓶实验癸酸钠购自上海国药集团；月桂酸(十二烷酸)购自汕头光华试剂厂；和豆蔻酸 (十四烷酸)购自上海国药集团；(一 )生物合成
1)将 Pseudomonas putida KTQQ20 接种于 LB-Km 液体培养基中，在 30°C、200rpm 下摇床培养12h，再按5% (V/V)的比例将菌液接种到LB-Km液体培养基中，在30°C、200rpm 下摇床培养9h，得到含有Pseudomonas putida KTQQ20的发酵液；2)分别将癸酸钠、月桂酸(十二烷酸)和豆蔻酸(十四烷酸)加入到步骤1)中含 有Pseudomonas putida KTQQ20的发酵液中，使得发酵液中癸酸钠的浓度为2g/L、月桂酸 (十二烷酸)的浓度是6g/L、豆蔻酸(十四烷酸)的浓度是4g/L，然后在30°C、200rpm下继 续摇床培养39h，得到生物合成后的发酵液。月桂酸和豆蔻酸的加入方式于菌体培养12h后一次性加入培养基中；癸酸钠的加入方式平分成两次加入，第一次是在菌体培养12h后，第二次是在第 一次加入12h后。；3)获得菌体的方法与实施例1中所述一致。 (二)产物验证检测生物合成后的发酵液中菌体细胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、组 成。培养结束后按照文献(Ouyang，S.P. ；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌体的前处理方法与实施例1中所述一致。1、以癸酸钠为碳源，得到的产物的验证(1)均聚物结构验证PHA组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；均聚物的分子结构式
(式 V-l)数均分子量为248. 6 X IO3Da (或重均分子量为361. 4 X IO3Da)；均聚物PHD的核磁 共振图谱如图6所示(a 聚羟基癸酸酯核磁共振氢谱；b 聚羟基癸酸酯核磁共振碳谱)。(2) PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式 与实施例1中所述一致。结果突变菌株KT0Y08在以癸酸钠为单一碳源的培养条件下，可以合成单体组成只含有3-羟基癸酸(3HD)的均聚物，(表5)。2、以月桂酸为碳源，得到的产物的验证(1)共聚物结构验证PHA组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；共聚物的分子结构式 数均分子量为119. 4 X IO3Da (或重均分子量为155. 5 X IO3Da)；(2) PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式 与实施例2中所述一致。结果突变菌株KT0Y08在以月桂酸为单一碳源的培养条件下，可以合成单体组成 含有3-羟基癸酸(3HD)和3-羟基十二酸(3HDD)的共聚物，(表5)。3、以豆蔻酸为碳源，得到的产物的验证(1)均聚物结构验证PHA组成的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；均聚物的分子结构式
(式 V-3)重均分子量为> 50 X IO3Da ；(2) PHA含量的检测方法气相色谱分析和核磁共振法分析；PHA含量的计算公式与实施例2中所述一致。结果突变菌株KT0Y08在以豆蔻酸为单一碳源的培养条件下，可以合成单体组成 含有3-羟基十二酸(3HDD)和3-羟基十四酸(3HTD)的共聚物，(表5)。上述结果表明，在癸酸、十二酸和十四酸的存在下，3-羟基癸酸(HD)均聚物PHD和 3-羟基十四酸(HTD)均聚物PHTD分别形成(表5)。表5. P. putida KTQQ20转化脂肪酸生物合成PHA。 “ND”表示未检测到数值。
权利要求
重组恶臭假单胞菌，如下述1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的使出发恶臭假单胞菌中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶编码基因和3-酮酰辅酶A硫解酶编码基因的编码功能丧失，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌I；2)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的使所述重组恶臭假单胞菌I中的3-羟基脂酰载脂蛋白辅酶A转移酶编码基因的编码功能丧失，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌II；3)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的向所述重组恶臭假单胞菌II中导入聚-β-羟基丁酸合成酶编码基因和4-羟基丁酰辅酶A转移酶编码基因，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌III；4)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的向所述重组恶臭假单胞菌II中导入PHA颗粒结合蛋白的编码基因、烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因和PHA合成酶编码基因，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌IV；5)所述重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的使所述重组恶臭假单胞菌II中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因和脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因的编码功能丧失，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌V。
2.根据权利要求1所述的重组恶臭假单胞菌，其特征在于 所述1)所示重组恶臭假单胞菌中，所述使出发恶臭假单胞菌中的3-羟基脂酰辅酶A 脱氢酶编码基因和3-酮酰辅酶A硫解酶编码基因的编码功能丧失是通过同源重组实现的； 所述同源重组的方法包括如下步骤向所述出发恶臭假单胞菌中导入序列表中序列1所示 DNA和序列表中序列2所示DNA，所述序列表中序列1所示DNA与所述出发恶臭假单胞菌中 的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因发生同源重组，所述序列表中序列2所示DNA与所 述出发恶臭假单胞菌中的3-酮酰辅酶A硫解酶的编码基因发生同源重组，得到所述重组恶 臭假单胞菌I ；所述2)所示重组恶臭假单胞菌中，所述使所述重组恶臭假单胞菌I中的3-羟基脂酰 载脂蛋白辅酶A转移酶编码基因的编码功能丧失是通过同源重组实现的；所述同源重组的 方法包括如下步骤向所述重组恶臭假单胞菌I中导入序列表中序列3所示DNA，所述序列 表中序列3所示DNA与所述重组恶臭假单胞菌I中的3-羟基脂酰载脂蛋白辅酶A转移酶 的编码基因发生同源重组，得到所述重组恶臭假单胞菌II ；所述3)所示重组恶臭假单胞菌中，所述聚_ β _羟基丁酸合成酶编码基因和4-羟基丁 酰辅酶A转移酶编码基因是通过重组载体导入的；所述重组载体是按照如下方法制备得到的将质粒PKSSE5. 3用限制性内切酶BamHI和 EcoRI进行酶切，回收大片段，记作大片段I ；将载体PBBR1-MCS2用限制性内切酶BamHI和 EcoRI进行酶切，回收载体大片段，记作大片段II ；将所述大片段I和所述大片段II连接， 得到所述重组载体；所述4)所示重组恶臭假单胞菌中，所述PHA颗粒结合蛋白的编码基因、烯脂酰辅酶A 水合酶的编码基因和PHA合成酶编码基因是通过重组载体导入的；所述重组载体是将所述 PHA颗粒结合蛋白的编码基因、PHA合成酶编码基因和烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因构成 的融合基因插入载体PBBR1-MCS2的KpnI和EcoRI位点得到的；所述PHA颗粒结合蛋白的编码基因位于所述融合基因的上游，所述PHA合成酶编码基因位于所述融合基因的中游， 所述烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因位于所述融合基因的下游；所述5)所示重组恶臭假单胞菌中，所述使所述重组恶臭假单胞菌II中的3-羟基脂酰 辅酶A脱氢酶的编码基因和脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因的编码功能丧失是通过同源重组 实现的；所述同源重组的方法包括如下步骤向所述重组恶臭假单胞菌II中导入序列表中 序列9所示DNA和序列表中序列10所示DNA，所述序列表中序列9所示DNA与所述重组恶 臭假单胞菌II中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因发生同源重组，所述序列表中序 列10所示DNA与所述重组恶臭假单胞菌II中的脂酰辅酶A脱氢酶的编码基因发生同源重 组，得到所述重组恶臭假单胞菌V。
3.根据权利要求1或2所述的重组恶臭假单胞菌，其特征在于所述1)所示重组恶臭假单胞菌中，所述序列表中序列1所示DNA和序列表中序列2所 示DNA是通过重组载体导入的；所述重组载体是将所述序列表中序列1所示DNA和表中序 列2所示DNA构成的融合基因插入出发载体pK18mobSacB的XbaI和HindIII位点得到的； 所述序列表中序列1所示DNA位于融合基因的上游，所述表中序列2所示DNA位于融合基 因的下游；所述2)所示重组恶臭假单胞菌中，所述序列表中序列3所示DNA是通过重组载体导入 的；所述重组载体是将所述序列表中序列3所示DNA插入出发载体pK18mobSacB的HindIII 和XmaI位点得到的；所述3)所示重组恶臭假单胞菌中，所述聚_ β _羟基丁酸合成酶编码基因的核苷酸序 列如序列表中序列4所示，所述4-羟基丁酰辅酶A转移酶编码基因的核苷酸序列如序列表 中序列5所示；所述聚-β -羟基丁酸合成酶编码基因位于所述融合基因的上游，所述4-羟 基丁酰辅酶A转移酶编码基因位于所述融合基因的下游；所述4)所示重组恶臭假单胞菌中，所述PHA颗粒结合蛋白的编码基因的核苷酸序列如 序列表中序列6所示，所述烯脂酰辅酶A水合酶的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列 7所示；所述PHA合成酶编码基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示；所述重组载体是按照如下方法得到的以Aeromonas hydrophi 1 a 4AK4的基因组 DNA为模板，用如下引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；用限制性内切酶KpnI和EcoRI 对所述PCR扩增产物进行双酶切，回收基因片段；用限制性内切酶KpnI和EcoRI对载体 PBBR1-MCS2进行双酶切，回收酶切大片段；将所述基因片段与所述酶切大片段连接，得到 所述重组载体；所述5)所示重组恶臭假单胞菌中，所述序列表中序列9所示DNA和序列表中序列10 所示DNA是通过重组载体导入的；所述重组载体是将所述序列表中序列9所示DNA和序列 表中序列10所示DNA构成的融合基因插入出发载体pK18mobSacB的HindIII和BamHI位 点得到的；所述序列表中序列9所示DNA位于所述融合基因的上游，所述序列表中序列10 所示DNA位于所述融合基因的下游。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组恶臭假单胞菌，其特征在于所述出发恶臭假 单胞菌为菌株 Pseudomonas putida KT0Y06。
5.权利要求1-4中任一所述的重组恶臭假单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。
6.一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤以脂肪酸、可溶性脂肪酸盐或Y-丁内酯为碳源，用权利要求1-4中任一所述重组恶臭假单胞菌进行生物合成，得到聚羟基脂肪酸酯。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述生物合成的方法包括如下步骤发酵 权利要求1-4中任一所述重组恶臭假单胞菌，得到含有所述重组恶臭假单胞菌的发酵液； 向所述含有重组恶臭假单胞菌的发酵液中加入所述脂肪酸或所述可溶性脂肪酸盐或所述 Y-丁内酯，在温度为30°C的条件下继续培养39h，得到聚羟基脂肪酸酯。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述脂肪酸为戊酸、己酸、庚酸、辛 酸、壬酸、癸酸、月桂酸或豆蔻酸，所述可溶性脂肪酸盐为戊酸钠、己酸钠、庚酸钠、辛酸钠、 壬酸钠或癸酸钠。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述聚羟基脂肪酸酯为羟基脂 肪酸酯均聚物或羟基脂肪酸酯共聚物；所述生物合成的方法为如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌I，所述可溶性脂肪酸盐为庚酸钠，所 述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式I所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为252 X IO3Da, 所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为455X IO3Da ；所述庚酸钠在所述含有恶臭假单胞菌的 发酵液中的浓度为5g/L; 2)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌II，所述可溶性脂肪酸盐为己酸钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式II-I所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为206X IO3Da,所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为272X IO3Da ；所述己酸钠在所述含有恶臭假单胞菌的发酵液中的浓度为10g/L ； )所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌II，所述可溶性脂肪酸盐为辛酸钠， 所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式II-2所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为 148X IO3Da,所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为ISOXlO3Da ；所述己酸钠在所述含有恶 臭假单胞菌的发酵液中的浓度为10g/L ； 2(式 II-2)3)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌III，所述碳源为Y-丁内酯，所述聚羟 基脂肪酸酯的化学式如式III所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为487X IO3Da,所述 聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为854Χ IO3Da ；所述γ _ 丁内酯在所述含有恶臭假单胞菌的 发酵液中的浓度为5g/L; 4 (式 III)4)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌IV所述可溶性脂肪酸盐为戊酸 钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式IV所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为 815X103Da，所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为1056X 103Da ；所述戊酸钠在所述含有恶 臭假单胞菌的发酵液中的浓度为5g/L ； (式 IV)5)所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌V:所述可溶性脂肪酸盐为癸酸钠，所述聚羟基脂肪酸酯的化学式如式V-I所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为`248. 6X IO3Da,所述聚羟基脂肪酸酯的重均分子量为361. 4X IO3Da ；所述癸酸钠在所述含 有恶臭假单胞菌的发酵液中的浓度为2g/L ； 所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌V:所述脂肪酸为月桂酸，所述聚羟基脂 肪酸酯的化学式如式ν-2所示，所述聚羟基脂肪酸酯的数均分子量为119. 4 X IO3Da,所述聚 羟基脂肪酸酯的重均分子量为155. 5X IO3Da ；所述月桂酸在所述含有恶臭假单胞菌的发酵 液中的浓度为6g/L ； 所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌V 所述脂肪酸为豆蔻酸，所述聚羟基脂 肪酸酯的化学式如式ν-3所示；所述豆蔻酸在所述含有恶臭假单胞菌的发酵液中的浓度为 4g/L；
10.根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述含有重组恶臭假单胞菌 的发酵液是按照包括如下步骤的方法得到的将所述重组恶臭假单胞菌接种于LB-Km液体 培养基中，在温度为30°C的条件下培养，得到所述发酵液；所述LB-Km液体培养基由酵母提 取物、蛋白胨、NaCl、硫酸卡那霉素和水组成，酵母提取物在LB-Km液体培养基中的浓度为 5g/L，蛋白胨在LB-Km液体培养基中的浓度为10g/L，NaCl在LB-Km液体培养基中的浓度为 10g/L，硫酸卡那霉素在LB-Km液体培养基中的浓度为50 μ g/mL。
全文摘要
本发明公开了一种制备羟基脂肪酸酯均聚物的方法及其专用菌。重组恶臭假单胞菌是按照包括如下步骤的方法制备的使出发恶臭假单胞菌中的3-羟基脂酰辅酶A脱氢酶编码基因和3-酮酰辅酶A硫解酶编码基因的编码功能丧失，得到重组恶臭假单胞菌，记作重组恶臭假单胞菌I。实验证明，用本发明的重组菌生物合成聚羟基脂肪酸酯，均可得到羟基脂肪酸酯均聚物，尤其是中长链羟基脂肪酸酯均聚物(C4-C14)。得到的羟基脂肪酸酯均聚物纯度高、产量高。本发明方法可以合成任意长度的中长链羟基脂肪酸酯均聚物，克服了现有技术中生物合成只能得到3-羟基丁酸酯(HB)的均聚物的缺陷。因此，本发明方法在羟基脂肪酸酯的均聚物的生物合成领域将有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/40GK101845414SQ20101016131
公开日2010年9月29日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者陈国强 申请人:清华大学