专利名称：麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重组蛋白制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种人工合成改造的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基 因序列及其重组蛋白的制备方法。
背景技术：
海藻糖[α-D-葡萄糖-(l，l)-a-D-葡萄糖苷]是一种广泛存在于低等植物、藻 类、细菌、真菌、酵母和昆虫等的具有多种功能的非还原性二糖。在自然界中，海藻糖既是 一种贮藏性糖类，又是应激代谢的重要产物，具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干 旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。海藻糖还具 有良好的保湿性能，其甜度只有蔗糖的一半，且无还原性醛基，因此海藻糖被广泛应用于食 品和饮料的冷冻和保藏、用作化妆品的保湿剂以及药物的稳定剂等，在生物制品和食品行 业的用途越来越广泛。由于它具有独特的功能，吸引科研人员对其进行了大量的研究。早期 是从生物体内提取海藻糖，但成本太高，无法进行大规模的生产，阻碍了其大规模的应用。 但是后来，科学家Kato从高温菌株Sulfolobus solfataricus KMl中分离到了麦芽寡糖基 海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)两个酶，在这两个酶的作用 下，以淀粉为原料，可分解转化为海藻糖。用此方法生产海藻糖具有成本低，效率高，是最有 竞争力的方法。目前科研人员对两个酶进行了基因克隆和重组表达，但在大肠杆菌表达这 两个酶的效果均不理想，限制了酶法途径在海藻糖合成中的运用。基于此，发明人在分析了 MTHase基因密码子的成分后，以芝田硫化叶菌 (Sulfolobusshibatae)B12 嗜热嗜酸古细菌 MTHase 基因(GeneBank :AF201335)为基础， 优化密码子结构，合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量，得到了一条 基因密码子结构得到优化，A/T含量降低的MTHase基因序列，利用酵母表达系统的优点， 将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZ α Α,筛选出重组载体并将其导入Pichia pastoris细胞进行重组表达。获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株，分泌到表达培 养基上清中的MTHase的酶活大于800mg/L，为工业化用酶法以淀粉为原料生产海藻糖打下基础。
发明内容
鉴于以上所述，本发明的一个目的是通过人工合成改造麦芽寡糖基海藻糖水解酶 基因，使其基因密码子结构得到优化，A/T含量降低，提供一种优化的编码这种酶的多核苷 酸序列。因此，本发明涉及这样一种经人工合成改造的多核苷酸序列，该序列选自SEQ ID NO :4中的序列，其全长为1683bp，编码559个氨基酸残基。本发明还涉及用于人工合成改 造该基因的全部引物序列。本发明的另一个目的是提供含有编码这种麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的重组 表达质粒。本发明的另一个目的是提供含有编码这种麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的基因工程化的宿主细胞。本发明的另一个目的是通过基因工程化宿主细胞，建立这种酶的重组表达制备方 法。本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的重组表达质粒；一种用该重组表达质 粒进行基因工程化的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和重组表达该酶的方法。本发明也涉及包含本发明直接用该人工改造基因经过基因工程方法产生的宿主 细胞，以及经重组技术产生本发明所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法。本发明中，编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的多核苷酸序列可插入到载体中， 以构成含有本发明所述多核苷酸的重组表达质粒。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在 本发明中适用的载体包括但不限于pPICZ α A。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质 粒和载体都可以用于构建重组表达质粒。本发明中，编码的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组表达质粒可转化或转导入宿 主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组表达质粒的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞” 指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，入哺乳动 物细胞。代表性的例子有大肠杆菌、酵母细胞和动物细胞如CHO、COS等。用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组表达质粒转化宿主细胞可用 本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物，如大肠杆菌等，可采用本领域众 所周知的方法和电转化方法进行。当宿主为酵母细胞时，一般采用电转化方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984，224 :1431)，利用本发明的多核苷酸序 列可用来表达或生产重组的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。一般说来有以下步骤(1)得到编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因。(2)用编码本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列，或用含有该序列的重组 表达质粒转化合适的宿主细胞。(3)在合适的培养基中培养宿主细胞。(4)在合适的诱导条件下诱导麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的表达。(5)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。在步骤⑴中编码本发明的基因克隆通过合成合适的引物，通过PCR人工拼接合 成靶基因。在步骤(2)中，为了构建包括上述编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的重组表达 质粒，所述的基因可结合到适于在目的宿主中进行基因表达的任意载体中。这些载体的实 施例包括但不局限于毕赤酵母作宿主时使用的pPICZaAdnvitrogen公司)。使用由此获 得的重组表达质粒，通过一定的转化方法转化宿主细胞。在本发明中，人工合成的基因经 DNA重组技术，得到重组表达质粒pPICZ a A/MTHase,并通过合适的转化方法转化宿主细胞 Pichia pastorisSMD1168H。在步骤(3)中，任何能够使产生本发明麦芽寡糖基海藻糖水解酶的微生物生长并 产生所述的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的培养基都可以用于生产本发明的麦芽寡糖基海藻 糖水解酶。在本发明中，将培养物在不同条件下培养，其中优选的培养温度为30°C，培养时 间为72h，即可得到最高的表达量。
在步骤(4)中，所用诱导剂为甲醇，诱导浓度为0.5-1%，诱导温度为18-25°C。 在本发明中，诱导剂为甲醇，诱导浓度为0. 5 %。所述基因工程菌诱导表达的培养温度为 25 °C。在步骤(5)中，任何能够使产生本发明麦芽寡糖基海藻糖水解酶的分离纯化技术 均可用于生产本发明的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。在本发明中，通过直接对培养物离心的 方法，在培养基上清液中得到大部分的重组麦芽寡糖基海藻糖水解酶。通过本方法得到的 麦芽寡糖基海藻糖水解酶，按下述方法进行酶活测定。其活性测定方法为将麦芽六糖溶于 50mmol/LpH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制成5. Ommol/L的溶液，取ImL该溶液，加入 MTSase酶制剂50 μ L，75°C反应2h，沸水中煮沸IOmin终止反应。待溶液冷却后，加入10 μ L MTHase表达上清液，75°C反应15min，用HPLC测定糖化液中海藻糖的含量。MTHase的酶活 单位定义为每分钟水解1 μ mol麦芽四糖基海藻糖生成海藻糖所需要的酶量。
图1重组MTHase基因工程菌的构建流程2重组子鉴定结果Ml :1Kb DNA 分子量标准(Invitrogen 公司)；M2 :1Kb DNA分子量标准(MBI公司)；1 :pMD18-T/MTHase 双酶切(EcoRI/XhoI)鉴定；2 =MTHase 基因 PCR 产物双酶切(EcoRI/XhoI)片段；3 :pPICZ α A 载体双酶切(EcoRI/XhoI)片段；4 重组质粒 pPICZ α A/MTHase 双酶切(EcoRI/XhoI)鉴定；5 以Pichia pastoris基因组DNA为模板扩增AOXl基因(副对照)；6 以重组Pichia pastoris基因组DNA为模板扩增AOXl基因；7:以重组Pichia pastoris基因组DNA为模板扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因 片段.图3MTHase表达产物电泳分析1 诱导前；2:24h 诱导;3 :48h 诱导；4:72h 诱导;M 蛋白质分子量标准 图4重组工程菌传代后的稳定率下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通畅按照 常规条件如Sambrook等人所著的分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
具体实施例方式实施例1麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因的人工改造和合成
根据上面的编码氨基酸序列，按照酵母菌密码子偏好性原则设计用于基因拼接的 正、反链DNA引物(如SEQ ID NO 6至SEQ ID NO 47所示)。其中5，端加入XhoI酶切位 点，3’端加入EcoR I酶切位点序列，便于与载体连接。用超纯水配制引物，使引物浓度为dOOpmol/y L，分别取引物1 μ L，混合后100°C 沸水中作用 15 分钟，立即冰浴；加入 5μ L IOX T4DNA ligase Buffer,Τ4 Polynucleotide Kinase 5 μ L，加水至总体积为45 μ L，37°C作用30分钟；65°C 20分钟，冰浴2分钟；加入 5μ L T4 DNALigase，16°C反应 2 小时，65°C 20 分钟。取上述混合反应液IyL作为PCR反应的模板，以SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3 为扩增引物，按下述PCR扩增参数进行PCR扩增94°C预变性5min ；循环30次94°C，30s ； 55°C，30s ;72°C，2min。最终延伸:72°C，10min。实施例2重组表达质粒的构建及阳性克隆的筛选将实施例1最终获得的PCR产物经纯化回收，连接到pMD18-T vector (Takara，大 连宝生物工程公司)，经过序列分析并选择正确的阳性克隆pMDS-T/MTHase，获得的序列是 SEQID NO :4，用XhoI/EcoRI进行双酶切，分离、回收1. 7kb左右的MTHase基因片段，将其 连接到经XhoI/EcoRI双酶切的pPICZ α A酵母表达载体(美国Invitrogen公司)，并筛选 出阳性克隆pPICZa A/MTHase。将阳性克隆载体经BglII单酶切后，转化Pichia pastoris SMD1168H酵母菌，并在高浓度的Zeocin-YPD固体培养基上筛选阳性克隆菌株(Pichia pastorisSMD1168H/pPICZ α A-MTHase)，并对其进行进一步的 PCR 鉴定确认。实施例3培养基及培养表达条件将实施例2 中描述的阳性菌株(Pichia pastoris MD1168H/pPICZ α A-MTHase)接 种于YPD培养基中，30°C培养12-24h，摇床转速为240rpm ；当发酵液浓度达0D_ = 5. 0时， 按体积比1 100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30°C，摇床转速为240rpm，培养 28-35h ；5000g离心5min，收集菌体，用PBS洗涤菌体1_2次，转接到BMM液体培养基中，使 发酵液浓度达OD = 0. 5-1. 0时，诱导培养，诱导温度25°C，摇床转速为180rpm，每隔12h向 培养基中加入5-10mL/L量的0. 5%甲醇，培养72小时；实施例4表达产物的SDS-PAGE分析将在实施例3中获得的培养物经5，OOOrpm离心lOmin，直接取上清液按分子克隆 实验指南(第三版)所述操作步骤进行SDS-PAGE电泳分析。分析结果见附图3。实施例5基因工程菌遗传稳定性研究连续传代将鉴定后的基因工程菌(Pichiapastoris SMD1168H/pPICZ α A-MTHase)进行适 当稀释，涂布在YPD (+)平板上(含1000 μ g/ml Zeocin)，于30°C恒温培养2天，随机挑取 50个单菌落，同一个菌落分别接种于YPD (+)和YPD (-)(不含1000 μ g/ml Zeocin)上，于 30°C恒温培养2天(称为第1代)。将YPD (+)上的菌接种于YPD (+)平板上，YPD (-)上的 菌接种于YPD (-)平板上，于30°C恒温培养2天(称为第2代)。依次进行连续传代50次， 对两个平板上生长的菌落分别进行计数。平板传代稳定性鉴定在传代过程中，每隔一定天数将YPD (_)平板上的菌落接种于YPD (+)平板上(含 1000 μ g/mL Zeocin)，菌落计数，计算该基因工程重组菌种在无选择压力下的遗传稳定率。
发酵条件下稳定性鉴定发酵液稀释IO6倍，分别涂布于YPD(+)和YPD(-)平板，30°C恒温培养2天，以两 种平板菌落数上的比值YPD (+) /YPD (-)间接表示该条件下菌株的稳定率。实施例6麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活性测定将麦芽六糖溶于50mmol/L pH5. 0的磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制成5. Ommol/L的 溶液，取ImL该溶液，加入MTSase酶制剂50 μ L，75°C反应2h，沸水中煮沸IOmin终止反应。 待溶液冷却后，加入10 μ L MTHase表达上清液，75°C反应15min，用HPLC测定糖化液中海藻 糖的含量。MTHase的酶活单位定义为每分钟水解1 μ mol麦芽四糖基海藻糖生成海藻糖所 需要的酶量。测定的MTHase酶活为843mg/L。
权利要求
一种人工合成改造的全长麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因，其碱基序列如SEQID NO4所示。
2.人工合成权利要求1所述全长麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的引物，其序列如SEQ IDNO 6 至 SEQ ID NO 47 所示。
3.含有权利要求1所述基因的表达载体。
4.含有权利要求1所述基因的基因工程菌。
5.含有权利要求1所述基因的细胞系。
6.一种制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，是将权利要求1所述的麦芽寡糖基海藻 糖水解酶基因插入毕赤酵母表达载体，转化宿主菌酵母菌，筛选得到表达麦芽寡糖基海藻 糖水解酶基因的基因工程菌，培养该基因工程菌，得到重组表达的麦芽寡糖基海藻糖水解 酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述毕赤酵母表达载体为PPICZα A。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因插入 到pPICZ α A载体的XhoI和EcoRI的酶切位点间。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主酵母菌为Pichia pastorisSMD1168H。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因工程 菌为 Pichia pastoris SMD 1168H/pPICZ α A-MTHase。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述表达为诱导表达，所用诱导剂为甲 醇，诱导浓度为0.5% (ν/ν) 0
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述基因工程菌的培养温度为30°C，诱 导表达的培养温度为18-25°C。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述基因工程菌诱导表达的培养温度 为 25 0C ο
全文摘要
本发明通过对麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因的遗传密码子进行人工改造，合成酵母偏爱密码子并修改基因遗传密码子中的A/T含量，得到了一条基因密码子结构得到优化，A/T含量降低的MTHase基因序列。然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA，筛选出重组载体并将其导入Pichia pastoris细胞进行重组表达。获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株，其分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800mg/L，为用酶法以淀粉为原料工业化生产海藻糖打下了基础。
文档编号C12N15/63GK101880681SQ20101016133
公开日2010年11月10日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者刘达玉, 唐仁勇, 张佳敏, 李德华, 王卫, 胡海洋, 苟兴华, 郭秀兰 申请人:成都大学