专利名称：一种产β-D-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法
技术领域：
本发明涉及能够生产β -D-半乳糖苷酶的一种新微生物菌株及其培养发酵生产β -D-半乳糖苷酶，并将该酶用于生物制备低聚半乳糖的方法，属于食品生物技术领域。更 具体的说本发明涉及来源于土壤的克鲁维酵母(Kluyveromycessphaeroides)SK 16. 001， 保藏编号为CCTCC NO =M 2010073，它能够产生β-D-半乳糖苷酶，并利用该酶催化乳糖合
ISIK^iLH (galacto-oligosaccharides)。
背景技术：
近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，更是广大食品从业者研发的焦点。 糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量、具有更多功能营养特性 的功能性甜味剂成为关注的热点。低聚半乳糖是由半乳糖基和葡萄糖基构成的聚合度为2 6的寡糖，低聚半乳糖 具有甜度低，水分活度低，对酸、热稳定等理化性质。低聚半乳糖还具有非致龋齿性、非消化 性(具有类似膳食纤维的生理功能)、促进肠道双岐杆菌增殖等功能。因此，低聚半乳糖作为一种功能性食品添加剂广泛应用于乳制品、糖果、罐头等食
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ΡΠ O酶法合成是工业化生产低聚半乳糖的主要途径。β -D-半乳糖苷酶属于水解酶类， 同时具有转移酶类性质。一方面，β-D-半乳糖苷酶可以催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳 糖，另一方面，还可以催化半乳糖基转移至乳糖等受体上的转移反应。酶法合成低聚半乳糖的产率受多种因素影响，酶的来源直接影响酶法合成的低聚 半乳糖的结构和产率。迄今为止，已发现多种微生物可以产生此酶，其中主要集中在米曲霉 (A. Oryzae)、黑曲霉(A. niger)和乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)。本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种高收率生产低聚半乳糖的方法进 行了研究，最终我们筛选到一株能产生β -D-半乳糖苷酶的新微生物，证明了通过此酶与 高浓度的乳糖反应能得到高转化率的低聚半乳糖，并通过浓缩干燥等手段得到低聚半乳糖 的糖浆或粉末。基于上述发现提出了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的微生物，它能够生产高酶活的β -D-半乳糖苷酶。本发明的另一个目的是提供一种该β -D-半乳糖苷酶与高浓度乳糖溶液反应的 方法，以得到高转化率的低聚半乳糖。本发明的再一个目的是提供一种低聚半乳糖提纯与精制的方法，以得到高低聚半 乳糖糖浆或粉末。为了实现上述目的，本发明提供一种来源于土壤的克鲁维酵母(Kluyveromyces sphaeroides)SK 16. 001，其为能够产生β _D_半乳糖苷酶的菌株，并利用该β-D-半乳糖苷酶转化乳糖生成低聚半乳糖。本发明的技术方案一株产β-D-半乳糖苷酶的菌株，其分类命名为克鲁维酵母(Kluyveromyces sphaeroides) SK 16.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 为 CCTCC NO :M 2010073。用所述的微生物克鲁维酵母SK 16. 001，即CCTCC NO =M 2010073菌株发酵生产 β -D-半乳糖苷酶的方法，步骤为⑴种子培养种子培养基酵母膏l-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l_40g/L，pH5. 5-8. 0，去离 子水配制；种子培养条件菌株于28-30°C、100-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养 10-20h来活化该微生物；⑵发酵培养发酵培养基酵母膏l_20g/L，蛋白胨 l-20g/L，乳糖 l_30g/L，pH5. 5-8. 0 ；发酵条件25-30°C、搅拌速度400-700rpm、空气流量0. 5-1. Ovvm的条件下在发酵 培养基中发酵10_48h生产β -D-半乳糖苷酶；(3)发酵后处理发酵液经冷冻离心后收集湿菌体，用pH7. 0的0. lmol/L磷酸盐缓冲液制成菌悬 液，然后菌体细胞破壁提取出β-D-半乳糖苷酶。冷冻离心后，收集的上清液即为粗酶液， 经检测酶活达到2-100U/mL ；所得粗酶液进一步超滤浓缩，或用硫酸铵沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到 β-D-半乳糖苷酶的粗酶粉。用制备的β-D-半乳糖苷酶转化乳糖生产低聚半乳糖的方法，向质量浓度 20% -80%乳糖溶液中添加β-D-半乳糖苷酶催化转化生产低聚半乳糖，转化条件为底物 乳糖浓度范围为20% _80%，酶对底物用量为0. l_30U/g乳糖干基计，ρΗ4. 0-8. 0，转化反应 温度为30-50°C，转化反应时间3-36h，转化率可达30%以上，得到含有低聚半乳糖的酶反 应液，进一步加工处理用于制备低聚半乳糖糖浆或低聚半乳糖粉末。低聚半乳糖糖浆的制备方法，步骤为(1)脱色在含有低聚半乳糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量0.2% -2.0%的 活性炭，在50-8(TC下温育10-60min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为20% _70%，即得低聚半乳糖糖浆。低聚半乳糖糖粉末的制备方法，步骤为(1)脱色同以上所述脱色步骤；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为20% -40%的浓缩液；(3)喷雾干燥将麦芽糊精与低聚半乳糖浓缩液以固形物含量干基计，按照质量比1 1-1 5的比例混合，控制进风温度170-180°C、出风温度70-80°C，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的低 聚半乳糖粉末。低聚半乳糖含量测定方法样品预处理将酶反应液稀释至总固形物含量为10%，经0.45 μ m超滤膜过滤。 滤液上HPLC分析。HPLC条件=Agilent 1200系列，配有Shodex RI-101示差折光检测器 和Agilent数模转换器。色谱柱NH2P-504. 6mm i. d. X 250mm氨基柱；流动相乙腈/水 65/35 (V/V)，流速lmL/min ；温度35°C ；进样量10yL。低聚半乳糖含量为转移二糖与三 糖的数量之和。本发明的有益效果本发明涉及一株从土壤中筛选而来的克鲁维酵母 (Kluyveromyces sphaeroides) SK 16. 001，保藏编号为 CCTCC NO :M 2010073，以此酵母菌 为发酵菌株，以乳糖为碳源、酵母膏和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产β-D-半 乳糖苷酶，发酵后经检测，在发酵液中酶活达到2-100U/mL。将β-D-半乳糖苷酶添加到 20% -80%乳糖溶液中催化合成低聚半乳糖，转化3-36h，转化率达30%以上。本发明方法 生产的低聚半乳糖产品安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性甜味剂。
生物材料样品保藏一株用于微生物转化发酵生产β -D-半乳糖苷酶的菌株，其 分类命名为克鲁维酵母(Kluyveromyces sphaeroides) SK 16. 001，已保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2010073，保藏日期为2010年4月2日。
图1实施例2中低聚半乳糖的高效液相色谱图。
具体实施例方式以下是克鲁维酵母SK16. 001进行发酵生产β -D-半乳糖苷酶及酶法转化生产低 聚半乳糖的实施例，但本发明并不限于所列出的几个实例。实施例1微生物发酵产酶用SK 16. 001进行培养发酵，按说明书所述的发酵条件，通过对不同发酵时间产 酶的检测，发现发酵15h后酶活已经趋于平稳，故确定发酵时间为15h左右。发酵时间对产 β -D-半乳糖苷酶的影响如表1所示。酶活力定义为ImL酶液Imin催化邻硝基酚β -D-半 乳糖苷(ONPG)水解生成Iymol邻硝基酚(ONP)为一个酶活力单位。表1发酵时间对产β -D-半乳糖苷酶的影响
~时间(h)Γ~6 Γ~912 ~~15 ~~18 21 24
~0 -D-半乳糖苷酶酶活(U/mL) 0 77 7Γ86 11. 49 ~11. 22 ~10. 60 ~11. 41 ~11. 02实施例2酶法转化乳糖生成低聚半乳糖向质量浓度40%乳糖溶液中添加β -D-半乳糖苷酶催化转化，转化条件为底物 乳糖质量浓度为40%，酶对底物用量为10U/g乳糖干基计，pH7. 0，转化反应温度为40°C，转化反应时间20h，得到含有30%低聚半乳糖的酶反应液。实施例3酶法转化乳糖生成低聚半乳糖向质量浓度80%乳糖溶液中添加β -D-半乳糖苷酶催化转化，转化条件为底物 乳糖质量浓度为80%，酶对底物用量为30U/g乳糖干基计，pH7. 0，转化反应温度为50°C，转 化反应时间36h，得到含有32%低聚半乳糖的酶反应液。实施例4低聚半乳糖糖浆的制备(1)脱色在含有低聚半乳糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量0.2% -2.0%的 活性炭，在80°C下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为20% _70%，即得低聚半乳糖糖浆。实施例5低聚半乳糖粉末的制备(1)脱色同实施例4所述脱色步骤；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为20% -40%的浓缩液；(3)喷雾干燥将麦芽糊精与低聚半乳糖浓缩液以固形物含量干基计，按照质量比1 1-1 5 的比例混合，控制进风温度170-180°C、出风温度70-80°C，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的低 聚半乳糖粉末。
权利要求
一株产β-D-半乳糖苷酶的菌株，其分类命名为克鲁维酵母(Kluyveromycessphaeroides)SK16.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM 2010073。
2.用权利要求1所述的CCTCCNO :M 2010073菌株发酵生产3-D-半乳糖苷酶的方法， 其特征在于步骤为(1)种子培养种子培养基酵母膏l-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH5. 5-8. 0，去离子水 配制；种子培养条件菌株于28-30°C、100-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养 10-20h活化该菌株；(2)发酵培养发酵培养基酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-20g/L，乳糖l-30g/L，pH5. 5-8. 0 ；发酵条件25-30°C、搅拌速度400-700rpm、空气流量0. 5-1. Ovvm的条件下在发酵培养 基中发酵10_48h生产3 -D-半乳糖苷酶；(3)发酵后处理发酵液经冷冻离心后收集湿菌体，用PH7. 0的0. lmol/L磷酸盐缓冲液制成菌悬液，然 后菌体细胞破壁提取出3 -D-半乳糖苷酶；冷冻离心后，收集的上清液即为粗酶液，经检测 酶活达到2-100U/mL ；所得粗酶液进一步超滤浓缩，或用硫酸铵沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到3 -D-半 乳糖苷酶的粗酶粉。
3.用权利要求2所述方法制备的3-D-半乳糖苷酶转化乳糖生产低聚半乳糖的方法， 其特征在于向底物乳糖溶液中添加3 -D-半乳糖苷酶进行催化转化生产低聚半乳糖，转化条件 为乳糖溶液的乳糖质量浓度为20% -80%，酶对底物用量为0. l-30U/g乳糖干基计， PH4. 0-8.0，转化反应温度为30-50°C，转化反应时间3_36h，转化率达30%以上，得到含有 低聚半乳糖的酶反应液，进一步加工处理用来制备低聚半乳糖糖浆或低聚半乳糖粉末。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于低聚半乳糖糖浆的制备方法，步骤为(1)脱色在含有低聚半乳糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量0.2% -2.0%的活性 炭，在50-80°C下温育10-60min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为20% _70%，即得低聚半乳糖糖浆。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于低聚半乳糖粉末的制备方法，步骤为(1)脱色同权利要求4所述脱色步骤；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为20% -40%的浓缩液；(3)喷雾干燥将麦芽糊精与低聚半乳糖浓缩液以固形物含量干基计，按照质量比1 1-1 5的比例混合，控制进风温度170-180°C、出风温度70-80°C，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的低聚半 乳糖粉末。
全文摘要
一种产β-D-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株从土壤中筛选而来的克鲁维酵母(Kluyveromycessphaeroides)SK 16.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 2010073，以此酵母菌为发酵菌株，以乳糖为碳源、酵母膏和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产β-D-半乳糖苷酶，发酵后经检测，在发酵液中酶活达到2-100U/mL。将β-D-半乳糖苷酶添加到20％-80％乳糖溶液中转化乳糖生产低聚半乳糖，转化3-36h，转化率达30％以上。本发明方法生产的低聚半乳糖产品安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性甜味剂。
文档编号C12P19/14GK101831389SQ20101016076
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月19日 优先权日2010年4月19日
发明者剧淑君, 张涛, 江波, 缪铭 申请人:江南大学