专利名称：一种新的β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及一种新的β-1，6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl及其应用。
背景技术：
生物被膜(biofilm)是由细菌和其分泌的胞外基质在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构。一旦形成生物被膜，细菌将具有极强的抗生素耐药性(比浮游细菌高 100-1000倍)和逃避机体免疫系统攻击的能力。牙菌斑生物被膜是牙周病的始动因素，在牙菌斑生物被膜的刺激下，牙周组织细胞分泌的细胞因子在牙槽骨吸收及牙周软组织破坏的过程中发挥着重要作用。然而，目前绝大多数研究集中在浮游细菌对牙周组织细胞毒性的研究，而关于细菌生物被膜与牙周病的研究极少。伴放线放线杆菌是侵袭性牙周炎的主要致病菌，它产生的β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺是其生物被膜的主要成份，在生物被膜形成和致病性方面发挥着重要作用。但目前尚未有能降解β_1，6-Ν-乙酰葡聚糖胺的β-1， 6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶被发现。本发明的发明人从海洋微生物中发现了一种β_1， 6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl，能降解β-1，6-Ν-乙酰葡聚糖胺，并具有抗伴放线放线杆菌生物被膜的作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。本发明的另一目的是提供一种上述酶在抗伴放线放线杆菌生物被膜中的应用。根据本发明的一个技术方案，从海洋微生物中纯化得到一种新的产N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。根据本发明的另一技术方案，使用上述酶对伴放线放线杆菌生物被膜形成进行了抑制，对已形成生物被膜进行了清除。本发明的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl对伴放线放线杆菌生物被膜形成的抑制作用> 50%，对已形成生物被膜的清除率为74.5%。
具体实施例方式实施例1菌株的分离和发酵条件从黄海采集海泥，样品置于无菌塑料瓶，4°C保存，4h以内用如下方法处理lmL海泥，加4mL无菌海水，取其悬浮液稀释接入选择性培养基中富集培养。一周后划线于固体培养基培养，经过连续5代挑取单克隆纯化培养后，挑取单克隆接种到含3毫升液体培养基的试管中，25°C 200r/min培养12小时。将培养液按的比例接入发酵培养基，于25°C 150r/ min培养3d。4°C 12000对min离心IOmin去除菌体，测定上清液的酶活力，选取酶活力最高的菌株。其中菌株QY403产生的酶活力最高，为4.65U/mL。培养基配方为每升含β_1， 6-Ν-乙酰葡聚糖胺 3g、KH2P043g、K2HP04*3H20 7g、(NH4)2SO4 2g、NaCl 30g、MgS04 ·7Η20 llg、FeSO4 ·7Η20 llg，pH 6. 0，IOOkP灭菌15min。固体培养基中添加1. 5%琼脂。酶活力测定方法200μ1底物(1.71g/L 4-硝基苯基-N-乙酰葡聚糖胺)中，加入5 μ 1的酶，40°C保温5 分钟，再加入5 μ 1 IOM的NaOH中止反应，以Omin处底物溶液为空白。迅速测定反应体系在405nm的光吸收值(0D405)。酶活力单位(U)定义为在以上条件下，每分钟产生1 μ mol 的产物的酶量，定义为1个U。 实施例2N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl的分离纯化⑴细菌培养挑QY403单克隆入5ml培养基，25°C 150r/min过夜。转接装有IOOmL培养基的 500mL摇瓶(1%接种量)，25°C 150r/min振荡培养72小时。4°C离心lOOOOrpm，15分钟，收集细菌发酵液上清液。(2)硫酸铵沉淀粗分离发酵液上清中缓慢加入硫酸铵至80%饱和度，4°C静置3h ;40°C 12000g离心 30min,弃去上清液，沉淀溶于20mmol/LpH7. 5磷酸盐缓冲液，对同样的缓冲液4°C透析过夜；40°C 13000g离心30min取上清液，即为粗酶液。(3)离子交换层析粗酶液上样于以20mmol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液平衡的DEAES印harose Fast Flow 柱进行离子交换层析。层析所用缓冲液体系为磷酸盐缓冲液，A液为20mmol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液，B液为含有2.0mol/L NaCl的A液。层析柱体积为14ml (IcmX 20cm)，上样量为3ml，采取NaCl浓度梯度洗脱，流速1. Oml/min，检测收集物的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 NagYl活性，大量收集活性组分。(4)凝胶过滤层析离子交换收集到的活性组分进行凝胶过滤层析，Superdex75HR10/30柱用 20mmol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液平衡，上样量1. 0ml,以平衡液洗脱，流速0. 5ml/min，检测收集物活性，大量收集高活性组分，浓缩备用。以上层析纯化操作均在4°C进行。经过硫酸铵沉淀、离子交换层析以及凝胶过滤层析收集的酶液，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果表明纯化后的样品只有一条带，达到电泳纯水平。根据分子量标准进行计算， N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl分子量大约为40. 2kD。其比活力为2. 37X 104U/mg。实施例3N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl抗伴放线放线杆菌生物被膜作用(1)96孔板伴放线放线杆菌生物被膜的构建从TSA培养平板挑伴放线放线杆菌单菌落到5mL TSB(50ml离心管)，培养过 (12h)，调整细菌OD值至1. 0，稀释至不同倍数；96孔板每孔加入100 μ L稀释菌液，37°C， 5% C02细胞培养箱中静置培养24小时；吸出菌液，用水洗96孔板3次；加入150 yL,l% 结晶紫染色30min ；用水彻底清洗至溶液无色；每孔中加入200 μ L 30%醋酸溶液，用酶标仪(590nm波长)比色。(2)盖玻片上伴放线放线杆菌生物被膜模型的构建从TSA培养平板挑伴放线放线杆菌单菌落到5mL TSB (50ml离心管)，培养过夜 (12h)；调整细菌0D600值至1.0，稀释10倍；六孔板每孔中加入稀释后的菌液2ml，将灭菌盖玻片(24X24mm)轻轻平放入孔底部；37°C，5% C02细胞培养箱中静置培养24小时；小心取出盖玻片，用灭菌水清洗3次；将盖玻片放入含2mlTSB的六孔板中，37°C超声振荡10分钟；将超声振荡后的含菌TSB稀释，取200 μ L涂TSA平板，37°C,5% C02细胞培养箱中静置培养12小时后计数。长有生物被膜的盖玻片用PBS冲洗三次，盖玻片上滴核酸染料 SYT09(0.01Mm)20y 1，避光静置15分钟后，于激光共聚焦显微镜下观察生物被膜形态(激发激光488nm，观察滤色片505nm，20X物镜观察，针孔522 μ m，Z轴步进2 μ m，四次扫描增加信躁比)。(3)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl对伴放线放线杆菌已形成生物被膜的降解作用按照以上构建生物被膜的方法在9 6孔板中造膜，即将OD为1的A. a菌液稀释10 倍，96孔板每孔加入100 μ L稀释菌液，37°C,5% C02细胞培养箱中静置培养24小时。吸出细菌培养液，用灭菌水小心冲洗96孔板三次，吸出灭菌水后每孔加入TSB培养基100 μ L，然后每孔中分别加入含有终浓度为0. 9U/ml、9U/ml、90U/ml、180U/ml以及经加热灭活处理的 90U/ml N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(酶溶于50mM PBS，pH7. 4)NagYl 5μ L的。对照组中仅加入TSB 105 μ L ；37°C，5% 二氧化碳，静置培养4小时后，吸去上清液，加入ddH20清洗三次。 吸净冲洗液，室温下晾干；加入150μ L 结晶紫染色30min ；用ddH20清洗残余的结晶紫； 加入200yL 30%乙酸洗脱结晶紫；洗脱液590nm检测OD值，用结晶紫的量表示剩余的生物被膜的量。结果表明N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl对伴放线放线杆菌生物被膜有明显的降解作用，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的浓度增加，对生物被膜的降解作用亦逐渐增强。90U/ml 的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl作用4小时能够降解生物被膜达74. 5%。(4) N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl对伴放线放线杆菌生物被膜形成的影响(盖玻片)将盖玻片放入6孔板中，每孔中加入PBS 2mL，然后加入含N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl 90U/ml的PBS 100 μ L，4°C，静置24小时后，用PBS冲洗一遍，尽量吸干孔中的液体。按照前述在盖玻片上构建生物被膜的方法造膜，每孔中加入伴放线放线杆菌菌液2ml。 24小时后，取出盖玻片，PBS冲洗三次，盖玻片上滴核酸染料SYT09 (0. OlmM) 20 μ L静置15 分钟后，于倒置相差显微镜下观察生物被膜形态。结果显示，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl对伴放线放线杆菌生物被膜生长的最终抑制效果达到50%左右。
权利要求
1.一种新的β_1，6-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl。
2.如权利要求1所述的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagYl，在抗伴放线放线杆菌生物被膜方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其应用。具体地，本发明涉及一种从海洋微生物中发现的N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1，可以用于抗伴放线放线杆菌生物被膜。
文档编号C12N9/24GK102260658SQ20101018267
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者于文功, 刘忠, 张贵民, 谭玉龙, 赵志全, 韩峰 申请人:中国海洋大学, 鲁南制药集团股份有限公司