专利名称：一种诱导植物衰老与雄性不育相关蛋白TaPaO及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种诱导植物衰老与雄性不育的相关蛋白TaPaO及其编码基因和应用。
背景技术：
现代农业生产中，人们广泛利用杂种优势来改良品种。杂种优势是指两个遗传组 成不同的亲本杂交产生的杂种一代在生活力、生长势、繁殖力、抗逆性、产量和品质上比其 双亲优势的现象。杂种优势利用被认为是今后小麦生产水平大幅度提高的主要途径。在小麦遗传育种中，利用杂种优势的途径主要有三系法和二系法。“三系法”是最 早发现并在相当长时间内成为小麦杂种优势利用的主要途径，以其制种纯度高的优点选育 出了多种不同类型的核质互作雄性不育系。三系即不育系、保持系及恢复系。由于其中的 不育系具有繁殖困难、恢复源窄、恢复源的筛选受到严格的恢复系和保持系的关系限制的 缺点，使得三系法在实际生产中的应用受到限制。上世纪九十年代，有学者报道培育成功了小麦光温敏不育系ES3、ES4和ES5等，并 提出了利用光温敏不育系进行二系杂交小麦的研究。光温敏雄性不育二系法具有明显的优 势一系二用，简化制种程序，恢复源广，降低成本，利用程度高。目前，通过基因工程技术已 经将很多不育相关基因转入到植物中，并获得了部分甚至完全雄性不育的植株。李国胜等 利用基因工程的方法将雄性不育基因的重组载体pTA29-barnase转入农杆菌后转化烟草， 将得到的转基因植株分别在低温(15°C -20°C )和正常温度(23°C -27°C )下进行培养，结 果低温下烟草表现部分不育；将低温下生长的烟草转入正常温度进行培养时，育性恢复正 常(李胜国，1997)。此外，他们还获得了雄性不育转基因油菜(罗玉英，1997)。中国科学 院植物研究所利用转基因技术，采用组织特异性启动子TA29，将编码细胞分裂素合成关键 酶基因_ipt转入烟草，发现转基因植株雄蕊发育异常，部分花丝变异成花瓣，从而造成雄 性部分或完全不育(耿飒，2000)。通过基因工程方法得到雄性败育的转基因植株，对加速 作物杂种优势的利用起到一定的推动作用。叶绿素(Chl)是地球上最重要的光合色素。1913年Willstaer等阐明了 Chl的 基本化学结构；50年后，有机化学家Robert成功地合成了叶绿素a，并因此荣获诺贝尔化 学奖。随后，人们一直对Chl生物合成代谢进行了广泛、深入的研究，其合成途径现已明 确，而有关叶绿素降解代谢方面的研究却比较少。目前，比较明确的Chl降解途径有三步 第一步，叶绿素酶作用下叶绿素脱植基反应；第二步，脱镁螯合酶(MDCase)作用下脱植 基叶绿酸向脱镁叶绿酸a转变；第三步，在脱镁叶绿(甲酯)酸加氧酶(pheophorbide a oxygenase,pheide a oxygenase,PaO)作用下卟啉大环的裂解反应。由于卟啉环裂解与叶 片色素的丧失有关，因此第三步是叶片衰老时叶色黄化的关键步骤。脱镁叶绿(甲酯)酸加氧酶(PaO)是迄今为止发现的参与叶绿素降解代谢的酶中 最重要的关键酶(Hortensteiner S et al. , 1998 ；Curty C et al.，1995)。研究表明，只在衰老叶片中检测到脱镁叶绿酸氧化酶的存在，而未衰老的组织中不存在，推测该氧化酶是在组织衰老时诱导合成的，因此该酶可能是叶片衰老时叶绿素降解途径中的关键酶。目前关于PaO的报道包括从呈现坏死斑点的玉米llsl (lethal leaf-spot 1)突 变体和拟南芥 acdl (accelerated cell death 1)突变体中得到克隆(Gray et al.，1997 ； Yanget al.，2004)；李鹏丽等(2006)从大豆中克隆了玉米Ilsl的同源基因，全长1817bp， 命名为Gmllsl。该基因在自然衰老或人工诱导衰老的叶片组织中表现出明显的衰老上调趋 势，与类受体蛋白激酶的表达有相关性，且在敲除类受体蛋白激酶后的转Gmllsl基因叶片 中表现出与玉米类似的Llsl突变体典型的叶片斑状失绿坏死表型；但是，目前还未有小麦 中PaO的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导植物衰老和雄性不育的相关蛋白TaPaO。本发明的再一目的是提供编码上述诱导植物衰老和雄性不育相关蛋白TaPaO的 编码基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。本发明的另一目的提供上述诱导植物衰老和雄性不育相关蛋白TaPaO的应用。本发明所提供的诱导植物衰老和雄性不育的相关蛋白TaPaO，来源于杂交小麦品 种京麦7号(京审麦2009003)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 MPVLAMPSAS LPLLSPRHRP LLRPSTLPAS RDGSGILRVA APTSVPGEAERAEEPSTSTS60TSFESSGEKF VWRCBWVS LVTOLDPRVP IFFQUML VIWNDFNSGCWVAIDDKPH120R1API5BGRI DETGGLQYSY HM3GSGA CIMWFE GFEARAVRSPRAQVIKFPTL180LSQSIIJW DENGWCKAKA IKFMJW DEPAFSIYTI _IMGYMXMNVa)PSH240JEFAHHmG RFDMKPIPF KMESSGA13Y SGANTGNPRI TAIffiAPCYAIMffiEiAKL300PIVGOTVI WKSMHA PGKffiSIVCS AHNFWW GKAWW^VPRWYEHfTS^V360YDOM輝 KM5ASK ESS\DVNQQY miFIPim DFmFMJKRWD420WYGSPS AL PSMjSOW IDRffi^IIl CSSCMKA FQUMVGAIWPGATSG480IPADVQLRIL LGAGALISAA LAYVFYDRQK HFVFVDYVHA DID523本发明的蛋白由523个氨基酸残基组成，具有保守的RieSke[2Fe-2S]结构域、非 亚铁血红素铁结合域和C-末端的CxxC结构基序。自SEQ ID NO. 1的氨基末端第76-188 位氨基酸残基是保守的Rieske结构域。为了使TaPaO蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白 质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
根据本发明所公幵的SEQ ID NO. 1序列，本发明的基因TaPaO可人工合成，也可先 合成其编码基因，再进行生物表达得到。根据本发明的TaPaO编码基因具有如SEQ ID NO. 2或3所示核苷酸序列。TaPaO 的表达会诱导叶片衰老，产生叶片斑状失绿现象，同时可以导致部分植株雄蕊异常。SEQ ID NO. 2 gaaggaacac agaaccaacc ttggaccctt cctccacacg atcccgagga aggaaggaag60gcagacgaaa tgccggtgct ggcgatgccg tccgcctccc tccccctcct ctccccgcgg120caccggccgc tgctgcgccc gtcgaccctc ccggcctccc gtctcggcag cggcatcctc180cgcgtggccg cgccgacgtc ggtccccggc gaggcggagc gggcggagga gccgagcacg240agcacgagca cctcgcctga atcgtccggg gagaagttcg tgtggcggga ccactggtac300ccggtctcgc tcgtggagga cctggacccg cgcgtgccca ccccgttcca gctcctcaac360cgcgacctcg tcatctggaa cgaccccaac tccggcgact gggtcgcgct cgacgaccgc420tgcccgcacc gcctcgcccc gctctcggag gggcggatcg acgagacggg cggcctgcag480tactcctacc acggctggtc cttcgacggc tccggcgcct gcaccaggat cccgcaggcc540gcgcccgagg ggcccgaggc ccgggcggtg cgctcgccca gggcctgcgc caccaagttc600cccacgctcc tctcccaggg gctgctcttc gtctggcctg acgagaatgg ctgggacaag660gccaaggcca ccaagcctcc aatgctgccg aaggagttcg atgacccggc cttctccacc720gtgacgatcc agagggacct cttctatggg tatgacacgt tgatggtgaa cgtctctgat780ccctcacata tagaatttgc tcaccacaag gtcactggac gaagagatag agccaagcct840ttgccattca aaatggaatc gagtggcgca tggggatatt caggggcaaa taccggtaat900cctcgtatca ctgcaacttt cgaggcccct tgctatgcac tgaacaaaat agagattgac960gcaaaattac cgattgtggg agatcagaaa tgggtgatat ggatttgctc cttcaacatt1020ccaatggccc cagggaaaac tcgttctatt gtctgtagtg ctcgaaactt tttccagttt1080acaatgccag gaaaggcatg gtggcagctt gtccctcgat ggtatgaaca ttggacctca1140aatttggtct atgacggcga tatgatcgtg cttcaaggcc aagagaaggt tttcctgtct1200gcatccaagg agtcgtctgc agatgttaat cagcagtaca caaagctcac tttcacaccc1260acacaggccg accgatttgt cttagcattc cgggcatggc tacggaaatt cggcaatagc1320
cagcctgact ggtatggaag ccctagccaa gatgcattac cttctacagt cctttcaaag1380cgagagatgc tagacagata cgagcagcac acgctgaaat gttcctcctg cagaggagcg1440cacaaggcct tccagactct gcagaaggtg ttcatggggg cgacggtggt gtttggcgcg1500acatccggga tccctgcgga tgttcagctc aggatattgc tcggtgccgg tgctctgatc1560agcgccgctc tggcctatgt cttctacgac cgccagaagc atttcgtgtt tgtggactac1620gtgcacgctg acattgattg attagggaga taaaccttag ttatttttgt gaggatctgg1680tgtggcgtgg tgcggagaca tcccacgatc aatcatgcgc ataacctagc caaggagtac1740atatagcttt cagtgggtac ttaccaggct actttgtaag aaagaaaagt cgggatgaaa1800atcgatagat agaccatatc ttttgtctat tagtatcagc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1860SEQ ID NO. 3 atgccggtgc tggcgatgcc gtccgcctcc ctccccctcc tctccccgcg gcaccggccg60ctgctgcgcc cgtcgaccct cccggcctcc cgtctcggca gcggcatcct ccgcgtggcc120gcgccgacgt cggtccccgg cgaggcggag cgggcggagg agccgagcac gagcacgagc180acctcgcctg aatcgtccgg ggagaagttc gtgtggcggg accactggta cccggtctcg240ctcgtggagg acctggaccc gcgcgtgccc accccgttcc agctcctcaa ccgcgacctc300gtcatctgga acgaccccaa ctccggcgac tgggtcgcgc tcgacgaccg ctgcccgcac360cgcctcgccc cgctctcgga ggggcggatc gacgagacgg gcggcctgca gtactcctac420cacggctggt ccttcgacgg ctccggcgcc tgcaccagga tcccgcaggc cgcgcccgag480gggcccgagg cccgggcggt gcgctcgccc agggcctgcg ccaccaagtt ccccacgctc540ctctcccagg ggctgctctt cgtctggcct gacgagaatg gctgggacaa ggccaaggcc600accaagcctc caatgctgcc gaaggagttc gatgacccgg ccttctccac cgtgacgatc660cagagggacc tcttctatgg gtatgacacg ttgatggtga acgtctctga tccctcacat720atagaatttg ctcaccacaa ggtcactgga cgaagagata gagccaagcc tttgccattc780aaaatggaat cgagtggcgc atggggatat tcaggggcaa ataccggtaa tcctcgtatc840actgcaactt tcgaggcccc ttgctatgca ctgaacaaaa tagagattga cgcaaaatta900ccgattgtgg gagatcagaa atgggtgata tggatttgct ccttcaacat tccaatggcc960ccagggaaaa ctcgttctat tgtctgtagt gctcgaaact ttttccagtt tacaatgcca1020ggaaaggcat ggtggcagct tgtccctcga tggtatgaac attggacctc aaatttggtc1080tatgacggcg atatgatcgt gcttcaaggc caagagaagg ttttcctgtc tgcatccaag1140gagtcgtctg cagatgttaa tcagcagtac acaaagctca ctttcacacc cacacaggcc1200gaccgatttg tcttagcatt ccgggcatgg ctacggaaat tcggcaatag ccagcctgac1260tggtatggaa gccctagcca agatgcatta ccttctacag tcctttcaaa gcgagagatg1320ctagacagat acgagcagca cacgctgaaa tgttcctcct gcagaggagc gcacaaggcc1380ttccagactc tgcagaaggt gttcatgggg gcgacggtgg tgtttggcgc gacatccggg1440atccctgcgg atgttcagct caggatattg ctcggtgccg gtgctctgat cagcgccgct1500ctggcctatg tcttctacga ccgccagaag catttcgtgt ttgtggacta cgtgcacgct1560gacattgatt ga1572含有TaPaO基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有TaPaO基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元表达载体系统和可用于植物微弹轰击法的载体等。所述植物表达载体还可包含 外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达 的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿 瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类 似功能。使用本发明的基因构建植物重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任 何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子、玉米的泛素 启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，还可使用增强 子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起 始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制 信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来 自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是 抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本发明的另一个目的是提供一种培育雄性不育植株的方法。本发明所提供的培育雄性不育植物的方法，是将上述任一种含有TaPaO基因的重 组表达载体导入植物细胞中，得到部分雄性不育植物，优选所述植物为小麦。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的脱镁叶 绿酸加氧酶TaPaO的编码基因导入植物细胞，可获得带有叶片斑状失绿以及雄性部分不育 的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、 植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细 胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也 可以是双子叶植物，如烟草、小麦、长穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪 草、苜宿等。本发明以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)为实验材料，利用RACE方法 得到了小麦雄性不育相关的脱镁叶绿酸加氧酶(pheophorbide a oxygenase, TaPaO)蛋白 及其编码基因，得到了小麦来源的脱镁叶绿酸加氧酶基因，并将TaPa0基因导入烟草，显著 加速了烟草叶片的衰老，叶绿素测定仪检测结果表明，同一叶龄的空白对照和转基因植株 叶绿素相对值相差较明显，并且转基因植株的育性也降低了，从而通过基因工程的方法验 证其功能。在其他物种中，对于该基因的研究结果多为诱导叶片产生斑状失绿现象，基本没 有侧重于植株育性相关方面的研究。对于TaPaO这个新基因，本发明研究发现它也可以诱 导烟草叶片衰老并产生叶片斑状失绿现象，并且它可以诱导烟草的雄蕊出现不同程度的退 化，导致雄蕊部分甚至完全不育，研究该基因与育性的关系是本发明的一个重要创新点。本发明的诱导衰老与雄性不育相关蛋白及其编码基因对培育光温敏雄性不育小 麦有很大的推进作用，使二系法育种更加实际，对杂种优势的利用和推广十分重要的理论和实际意义。总之，运用基因工程方法构建雄性不育转基因植株，可以简化育种程序，改进育种模式。尤其是对光温敏雄性不育有关基因的研究和利用，可以推进二系法育种，从而加 速杂种优势在小麦遗传育种中的应用。下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1诱导衰老和雄性不育相关蛋白TaPaO编码基因的cDNA克隆，以杂交小麦品种 京麦7号(京审麦2009003)为模板，PCR扩增TaPaO的cDNA片段，1，2，京麦7号的TaPaO 基因片段；M, DL2000 marker (100, 250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)。图2RT-PCR半定量分析TaPaO基因分别在高温(可育环境)与低温(不育环境) 生长环境下的表达特征，该基因的表达在不同育性环境以及不同发育时期的幼穗中存在明 显差异，在不育环境下，四个时期都表达，且随着穗部的发育呈现逐步上调趋势；而在可育 环境下的四个穗部发育时期中表达量很低，其中A1-A4代表安徽不育环境；B1-B4代表北京 可育环境。图3转基因烟草的获得，3A，烟草经农杆菌侵染后的筛选、分化培养；3B，经筛选、 分化后获得的再生植株生根培养；3C，转基因烟草植株的PCR检测，其中1，2，3，4，5，7，8，9， 10，11，12，13，14，15为pBI29A-TaPa0转基因烟草，17为空白对照。图4TaPaO基因导致的烟草衰老现象，A，转基因植株和对照植株叶片颜色的比较； B，转基因植株出现的叶片斑状失绿现象。图5转基因烟草低温下处理，花瓣以及花药的异常发育现象，A，pBI29A-TaPa0转 基因烟草低温培养下出现的全部雄蕊退化成花瓣的异常发育现象，几乎没有产生花粉的能 力；B，pBI29A-TaPa0转基因烟草部分雄蕊退化成花瓣，部分雄蕊不育；C，花丝变异为畸形 花瓣，雄蕊着生于异型花瓣的中部；D，对照植株正常的花瓣及雄蕊。图6转基因植株变异花药与对照植株正常花药在解剖镜下的比较，A，变异花药在 解剖镜下的外形观察，小而且干瘪；B，变异花药纵切照片，花药内部几乎没有花粉粒；C，对 照植株正常花药与变异花药的实物图；D，对照植株正常花药切面图，花粉粒包裹在整个花 药中；E，对照植株正常花药的外形观察，大而且饱满；F，对照植株正常花药用解剖针划开， 花粉粒蹦出来。
具体实施例方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例1 小麦诱导衰老与光温敏雄性不育相关基因TaPaO的cDNA克隆与半定量 分析取杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的花药，用Trizol法提取花药 的总 RNA。应用 5，RACE 试剂盒(5，RACE System for Rapid Amplification of cDNA EndsKit) (GIBCOBRL, CAT. NO. 18374-058)和 3，RACE 试剂盒(3，RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit) (GIBCOBRL,CAT. NO. 18373-019)获得TaPaO基因。
用Trizol法提取杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)花药的总RNA，用 superscript II (购自invitrogen公司)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaPaO基因 编码区序列设计引物Pl和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR扩 增。引物Pl和P2的序列如下P1 5，-AGGAAGGAAGGAAGGCAGACGAAAT-3，
P2 5 ’ -CCCTAATCAATCAATGTCAGCGTGC-3’对PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1. 6-1. Skb左右的 条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段 与 pGEM-T Easy (购自 Promega公司)连接，参照 Cohen 等的方法(Proc NatlAcad Sci,69 2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据pGEM_T Easy载体上的氨卞青霉 素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和 SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaPaO基因的开 放阅读框(ORF)为SEQ ID No. 3，即SEQ ID No. 2的自5'末端第70至1641位脱氧核糖核 苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白质。将含序列SEQ ID No. 3所示TaPaO基因 的重组载体命名为pBI29A-TaTaPa0，其cDNA克隆结果如图1所示。TaPaO基因的序列在Genabnk上进行比对，BLAST分析表明，在氨基酸水平上小麦 TaPaO与水稻PaO、拟南芥中同功能基因AtAcd(accelerated cell death 1)以及玉米(Zea mays) Llsl 一致性分别为88%、81%和93%。序列分析发现小麦TaPaO与其他同源基因的 编码产物一样都包含有典型的Rieske [2Fe-2S]结构域(Cys-Xl-His-X16-17-Cis-X2_His) 和非亚铁血红素铁结合域(Glu-X3-4-Asp-X2-HiS-X4-5-HiS)，另外在N末端还具有高度保 守的CxxC基序(F/Y/W-X2-His-X3-Cys-X2-Cys)。而在小麦中未发现同源蛋白基因，证明 TaPaO基因是一个新的基因。用Trizol法提取杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)自交后代花药的总 RNA,反转录成cDNA用做半定量RT-PCR分析。利用小麦中稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)的特异引物WAC-F 5‘ -GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3‘WAC-R 5 ‘ -GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3‘作为内参确定半定量RT-PCR分析的cDNA模板用量。根据调整好的内参标准，对小 麦两个不同生态育性环境下各四个穗部发育时期的cDNA的量进行调整，调整到扩增产物 亮度基本一致后，进行特异引的半定量RT-PCR扩增(图2)。结果表明，该基因的表达在不 同育性环境以及不同发育时期的幼穗中存在明显差异，在不育环境下，四个时期都表达，且 随着穗部的发育呈现逐步上调趋势；而在可育环境下的四个穗部发育时期中表达量很低。 三次重复结果基本一致。实施例2 用TaPaO基因培育雄性不育转基因植物1、重组表达载体的构建PBI29A-TaPa0双子叶植物重组表达载体的构建以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的总RNA反转录得到的cDNA为模板， 用含有SacI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SacI和SpeI双酶切PCR产 物，回收，将酶切产物正向插入载体PBI121的CaMV 29A启动子之后的SacI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体pBI29A-TaPaO。引物序列如下TaPaO[SacI] :5， -TCCGAGCTCTCAATCAATGTCAGCGTGCAC-3，TaPaO[SpeI] :5， -CGGACTAGT ATG CCG GTG CTG GCG ATG-3，2、转基因烟草的获得和鉴定1)转基因烟草的获得将上述构建的重组表达载体pBI29A-TaPa0用冻融法转化根癌农杆菌C38C1，再用 叶盘法将整合有pBI29A-TaPa0的根癌农杆菌C38C1转化烟草W38，用含100mg/L卡那霉素的 MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选10-15天，得到阳性转基因植株(如图3A、3B)。将筛选 得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。P3 :5’ -TCCGAGCTCTCAATCAATGTCAGCGTGCAC-3，P4 :5’ -CGGACTAGT ATG CCG GTG CTG GCG ATG-3’对pBI29A-TaPa0转基因烟草进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得 1. 6kb左右条带，如图3C所示，结果获得转pBI29A-TaPa0烟草22株。同时将pBI121空载体导入烟草W38，方法同上，作为对照，获得11个株系的转空载 体烟草(筛选获得的转基因烟草用Ttl代表示)。2)转TaPaO基因植株衰老与雄性不育鉴定将Ttl代转pBI29A-TaPa0基因烟草植株及Ttl代转空载体对照植株的3周苗龄的根 系分别移入含有营养土的花盆中分别进行高低和温处理，一部分在23°C -27°C (正常温度) 下生长，一部分在15°C-20°C (低温)下生长，观察表型并拍照。在开花期结合花药的生长 情况，做花粉萌发实验，观察花粉的育性。结果表明PBI29A-TaPa0转基因植株在正常温度条件下能正常生长，初期叶片颜色深绿，与对照植株基本没有差别，到开花期时底部几层叶片全部枯黄，还有部分植株叶片 出现了斑状失绿现象；而空白对照植株叶片从初期到开花期都是正常生长，叶片颜色深绿。 TaPaO基因诱导转基因烟草衰老鉴定结果证明TaPaO基因可以在植物生长后期可能诱导植 株衰老。图4显示了 pBI29A-TaPa0转基因植株和空白对照植株在正常温度下生长的差异 情况。在低温条件下，pBI29A-TaPa0转基因植株与空白对照植株在开花期表现出明显的 不同，主要表现在花药的生长发育和萌发上。转基因植株部分花药形态异常，雄蕊退化，花 丝演变成不完全的花瓣，花药着生在异常花瓣的中部，这种畸形的花药开裂后为黑褐色，极 少有花粉散出。而低温条件培养的空白对照植株，花药发育正常，且花粉较多(如图5、6所 示)°
权利要求
一种诱导植物衰老和雄性不育的相关蛋白TaPaO，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种诱导植物衰老和雄性不育的相关基因TaPaO，其特征在于，编码权利要求1所述 的植物诱导衰老和雄性不育的相关蛋白TaPaO。
3.如权利要求2所述的植物诱导衰老和雄性不育相关基因TaPaO，其特征在于，其碱基 序列如SEQ ID NO. 2或3所示。
4.包含权利要求2或3所述植物诱导衰老与雄性不育相关基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体通过将权利要求2或3 所述基因经插入载体PBI121而得。
6.包含权利要求2或3所述植物诱导衰老与雄性不育相关基因的转基因细胞系。
7.一种培育雄性不育植株的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2或3所述植 物诱导衰老与雄性不育相关基因导入植物细胞中，获得雄性不育或部分不育植株的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物为小麦。
9.权利要求1所述植物诱导衰老与雄性不育相关蛋白TaPaO在小麦杂交育种中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种诱导植物衰老与雄性不育相关蛋白TaPaO及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。本发明的诱导衰老与雄性不育相关蛋白及其编码基因对研究光温敏雄性不育小麦的不育机理有一定的作用，对于研究及开辟小麦杂种优势利用新途径提供十分重要的理论和实际意义。
文档编号C12N5/10GK101845087SQ20101018669
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者单福华, 唐忠辉, 唐益苗, 张凤廷, 张立平, 王灵云, 苑少华, 赵昌平, 郑岑, 高世庆 申请人:北京市农林科学院