专利名称：一种水质急性毒性在线监测的设备及方法
技术领域：
本发明涉及一种水质急性毒性在线监测的设备及方法，尤其涉及一种基于固定化 发光细菌生物敏感元件的水质急性毒性在线监测的设备和方法，属于环境监测领域。
背景技术：
随着工农业的发展和人类活动的加剧，近年来突发性环境污染事故频发，因为缺 少在线预警措施，不仅给当地造成极大的经济损失，还会造成人员伤亡。为了加强河水以及 饮用水源的保护、工业废水排放等的预警和管理，国际上纷纷出台相关规定，要求实现水质 的连续毒性控制。但是传统的毒性试验都因时间长、费用高，操作繁琐，不适宜突发环境事 件的预警。因此急需一种快速、简便、经济的检测方法以便给决策者提供参考。随着环境微生物学的发展，多采用微生物作为指示生物分析水质毒性，其中发 光细菌由于具有较高的灵敏度和操作方便，适于在线分析和应用。国外从20世纪60年 代中期开始研究使用发光细菌检测环境，80年代美国的贝克曼公司研制了 Microtox检 验技术的相关仪器和试剂，在我国直到90年代中期才颁布发光细菌毒性检测方法(GT/ T15441-1995)。但它们在测量中需要配制一系列的空白和标准液，操作过程复杂、耗时、繁 琐，只能在实验室里检测，而不能用于现场连续原位自动化检测，极大地削弱了该方法的应 用。所以国内外的研究人员利用发光菌毒性检测在水环境监测上的优势研制了不同的发光 菌传感器用于现场连续原位自动化检测，比如美国SDI公司研制出Deltatox水质毒性检测 仪、Hach公司的LumistOX300等，他们都采用将低温保存的发光菌菌液复苏后作为检测液， 这就难免会遇到发光菌发光不稳而出现假阳性，所以近些年有发展了发光菌固定化技术， 比如美国的oak Ridge国家实验室和Tennessee大学联合研制了基于生物发光的毒性检测 芯片，将琼脂固定的菌膜与电路结合检测；以色列和韩国的研究者则采用光纤探头的结构， 把发光细菌固定于裸光纤顶端，或将发光细菌固定于连接光纤的套管中。国内一些研究中 将发光细菌吸附固定于混合纤维膜上，敏感膜与硅光二极管直接相连。但是要运用起来面 临几个问题发光细菌世代很短，不能保证其长期稳定的发光；插入凝胶里的光纤探头检 测时感光性较差；不能重复利用等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于固定化发光细菌生物敏感元件的水 质急性毒性在线监测的设备。本发明还要解决的技术问题，是提供上述设备对水质急性毒性在线监测的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—种水质急性毒性在线监测的设备，它包括发光细菌连续培养系统、加样系统、排 液系统、程序控制系统、光电检测系统、数据处理与传输系统和数据显示系统；发光细菌连续培养系统由营养液储备瓶、储液槽、泵、反应试管和软管组成；营养 液储备瓶倒置放置通过软管与储液槽相连通，储液槽通过软管与反应试管相连通，并由泵控制储液槽向反应试管8的营养液流加速度，反应试管置于可开合的暗室内，反应试管内 放有1 10粒发光细菌生物敏感元件；加样系统由样本槽、泵和软管组成，样本槽通过软管与发光细菌连续培养系统中 的反应试管相连通，并由泵控制样本向反应试管的流加速度，插入反应试管中的软管要接 近反应试管的底部；排液系统由废液槽、泵和软管组成，废液槽通过软管与发光细菌连续培养系统中 的反应试管相连通，并由泵控制反应试管中检测完毕后的废液向废液槽的排放速度，插入 反应试管中的软管要接近反应试管的底部；光电检测系统设置在反应试管底部，数据处理与传输系统通过线路与光电检测系 统连接，自动计算相对发光强度，并将数据存储在数据存储卡中，数据结果在数据显示系统 里显示； 发光细菌连续培养系统、加样系统、排液系统、光电检测系统、数据处理与传输系 统和数据显示系统都是由程序控制系统控制实现全自动操作。其中，所述发光细菌生物敏感元件为直径为凝胶小球；由如下方法制备得到将 发光细菌菌悬液与海藻酸钠溶液混合均勻，将混合液逐滴滴入到氯化钙溶液中，固化。上述发光细菌生物敏感元件的制备方法，包括如下步骤(1)将斜面发光细菌菌种接种到ASW培养基中培养15 18小时，培养温度为18 22°C，转速为 180 250r/min ；(2)取步骤(1)制得的菌悬液，进行稀释至光密度为0. 1 0. 6，将稀释液加入已 灭菌的冷却的海藻酸钠溶液中，在18 22°C下混合均勻；(3)将步骤(3)制得的混合液，用注射器逐滴滴入氯化钙溶液中，然后固化4 6 小时，用蒸馏水清洗，即得。步骤(2)中，优选的条件是，菌悬液，进行稀释至光密度为0. 1 0. 2。步骤(2)中，所述的海藻酸钠溶液的浓度为40 80g/L，优选40 50g/L。步骤(2)中，所述稀释液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1 1 10，优选 1 1 2。步骤(3)中，所述的氯化钙溶液的浓度为20 30g/L，优选20 23g/L。步骤(3)中，所述混合液与所述氯化钙溶液的体积比为2 3 100。上述发光细菌生物敏感元件的保存方法，将发光细菌生物敏感元件在4°C条件下 保存于储液中，所述储液为含有30 40g/L NaCl和0. 5 lg/L CaCl2的水溶液。其中，所述的光电检测系统使用的可以是任一种光电传感器。利用上述设备进行水质急性毒性在线监测的方法，向反应试管内放入3 5粒发 光细菌生物敏感元件，利用发光细菌连续培养系统向反应试管内加入营养液，再利用加样 系统向反应试管内加入样本，光电检测系统检测发光强度，数据处理与传输系统采集数据 并进行数据处理，检测结束后，由排液系统将反应试管内的废液排入废液槽，发光细菌生物 敏感元件继续保留在反应试管中重复加入发光细菌培养基、加入样本、检测发光强度、采集 数据和排液的操作，连续监测7 10天后，更换新的发光细菌生物敏感元件，继续在线监 测。有益效果本发明的水质急性毒性在线监测装置结构简单，成本低廉，操作方便，非专业人员只需经过简单培训即可操作和维护；本方法能完全实现水质连续自动化急性毒 性监测，而且灵敏度与国标的发光细菌法相当，极大的简化监测步骤。使用本装置和方法为 突发环境事故提供预警及时的采取相应措施，可以极大减少损失。
图1是本发明的水质急性毒性在线监测设备的结构示意图。其中，1是营养液储备 瓶，2是储液槽，3是样本槽，4是废液槽，5是泵，6是泵，7是泵，8是反应试管，9是光电检测 系统，10是数据显示系统，11是发光细菌生物敏感元件。图2是本发明的发光细菌生物敏感元件复苏后的发光强度图。图3是本发明的发光细菌生物敏感元件对蒸馏水连续运行效果图。图4是本发明的发光细菌生物敏感元件对pH的响应图。图5是本发明的发光细菌生物敏感元件对毒性物质的响应图。图6是本发明的发光细菌生物敏感元件重现性实验。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。实施例1 发光细菌生物敏感元件的制备。将斜面发光细菌菌种接种到ASW液体培养基中培养16小时左右，培养温度为 200C，转速为200r/min ；取上述菌悬液，进行50倍的稀释，光密度在0. 1左右，将稀释液加 入已灭菌的冷却的40g/L海藻酸钠溶液中，稀释液与海藻酸钠溶液的体积比为1 1，在 20°C充分混勻；将上述混合液用注射器逐滴滴入20g/L氯化钙溶液中固化4小时，混合液与 氯化钙溶液的体积比为2%，用蒸馏水清洗后浸泡于含有30g/L NaCl和0. 5g/L CaCl2的水 溶液中，放在4°C储存备用。将保存的发光细菌敏感元件放在20°C的环境下复苏10分钟(所述复苏为将敏感 元件从4°C取出来放在20°C的环境下的过程)，其发光强度如图2所示。实施例2 水质急性毒性在线监测设备。如图1所示，水质急性毒性在线监测设备包括发光细菌连续培养系统、加样系统、 排液系统、程序控制系统、光电检测系统、数据处理与传输系统和数据显示系统。发光细菌 连续培养系统由营养液储备瓶1、储液槽2、泵7、反应试管8和软管组成；营养液储备瓶1， 倒置放置通过软管与储液槽2相连通，储液槽2通过软管与反应试管8相连通，并由泵7控 制储液槽2向反应试管8的营养液流加速度，反应试管8置于可开合的暗室内。加样系统 由样本槽3、泵6和软管组成，样本槽3通过软管与发光细菌连续培养系统中的反应试管8 相连通，并由泵6控制样本向反应试管8的流加速度，插入反应试管8中的软管要接近反应 试管8的底部。排液系统由废液槽4、泵5和软管组成，废液槽4通过软管与发光细菌连续 培养系统中的反应试管8相连通，并由泵5控制反应试管8中检测完毕后的废液向废液槽4 的排放速度，插入反应试管8中的软管要接近反应试管8的底部。光电检测系统设置在反应 试管8底部。数据处理与传输系统通过线路与光电检测系统连接，自动计算相对发光强度，并将数据存储在SD卡中，数据结果在数据显示系统里显示，例如加入试剂、样本、5分钟、10 分钟、15分钟的发光强度和相对发光强度。发光细菌连续培养系统、加样系统、排液系统、光 电检测系统、数据处理与传输系统和数据显示系统都是由程序控制系统控制实现全自动操 作。营养液储备瓶1内装有营养液，营养液包括如下组分发光细菌的培养基10% (ν/ ν)，CaCl25g/L，NaCl 300g/L，溶剂为水。其中，发光细菌的培养基组分如下(g/mL) :Tryptone 0. 5%, Yeast extract 0. 5%, NaCl 3%, Na2HPO4O. 5%, KH2PO4O. 1%，甘油 0. 3%，溶剂为水。使用时，向反应试管内放入3 5粒用本发明方法制备的发光细菌生物敏感元件，利用发光细菌连续培养系统向反应试管内加入35 μ L营养液，再利用加样系统向反应试管 内加入315 μ L样本，光电检测系统检测发光强度，每5分钟、10分钟和15分钟，数据处理与 传输系统分别采集数据并进行数据处理，检测结束后，由排液系统将反应试管内的废液排 入废液槽，发光细菌生物敏感元件继续保留在反应试管中重复加入发光细菌培养基、加入 样本、检测发光强度、采集数据和排液的操作，连续监测7 10天后，更换新的发光细菌生 物敏感元件，继续在线监测。实施例3 发光细菌生物敏感元件对蒸馏水的连续运行。采用实施例2所描述的水质急性毒性在线监测设备对蒸馏水的连续监测，监测的 效果如图3所示。说明随着测试的进行，菌的生长状况会随之发生变化，造成其抑光率发生 变化，但除个别点外，可以在一定的时间内保持相对的稳定，可以根据所测历史数据计算和 设定动态报警线来消除这种影响，使计算更为准确。实施例4 发光细菌生物敏感元件对ρΗ的响应。采用实施例2所描述的水质急性毒性在线监测设备，进行到100个循环的时候将 样本槽的样本换成不同PH的蒸馏水水样依次进行测试，其效果如图4所示。说明本发明的 生物元件有一个较宽的PH耐受范围，能够抵抗环境中酸碱的影响。实施例5 发光细菌生物敏感元件对毒性物质的响应。采用实施例2所描述的水质急性毒性在线监测设备，进行到100个循环的时候将 样本槽的样本换成不同浓度的硫酸锌水样依次进行测试，其效果如图5所示。说明本发明 能够灵敏的对不同浓度的毒性物质做出响应，并且能很快的恢复随着暴露浓度的提高恢复 时间相应的延长，为后续的测试提供了保障。实施例6 发光细菌生物敏感元件重现性实验。用蒸馏水作为样本进行了 7天的测试，测试的参数为35 μ L营养液，315 μ L样本， 时间间隔为2分钟，反应时间15分钟，连续自动加样排液，测试的效果如图6所示。说明在 连续测试的过程中小球能够连续运行一周的时间而不发生解体，并且发光值也稳定在一个 很好的范围内，随着测试时间的延长，会发生自身的衰减从而使抑光率逐渐上升，但是不影 响测试的进行。
权利要求
一种水质急性毒性在线监测的设备，其特征在于它包括发光细菌连续培养系统、加样系统、排液系统、程序控制系统、光电检测系统、数据处理与传输系统和数据显示系统；发光细菌连续培养系统由营养液储备瓶(1)、储液槽(2)、泵(7)、反应试管(8)和软管组成；营养液储备瓶(1)倒置放置通过软管与储液槽(2)相连通，储液槽(2)通过软管与反应试管(8)相连通，并由泵(7)控制储液槽(2)向反应试管(8)的营养液流加速度，反应试管(8)置于可开合的暗室内，反应试管(8)内放有1～10粒发光细菌生物敏感元件(11)；加样系统由样本槽(3)、泵(6)和软管组成，样本槽(3)通过软管与发光细菌连续培养系统中的反应试管(8)相连通，并由泵(6)控制样本向反应试管(8)的流加速度，插入反应试管(8)中的软管要接近反应试管(8)的底部；排液系统由废液槽(4)、泵(5)和软管组成，废液槽(4)通过软管与发光细菌连续培养系统中的反应试管(8)相连通，并由泵(5)控制反应试管(8)中检测完毕后的废液向废液槽(4)的排放速度，插入反应试管(8)中的软管要接近反应试管(8)的底部；光电检测系统(9)设置在反应试管(8)底部，数据处理与传输系统通过线路与光电检测系统(3)连接，自动计算相对发光强度，并将数据存储在数据存储卡中，数据结果在数据显示系统(10)里显示；发光细菌连续培养系统、加样系统、排液系统、光电检测系统、数据处理与传输系统和数据显示系统都是由程序控制系统控制实现全自动操作。
2.根据权利要求1所述的水质急性毒性在线监测的设备，其特征在于所述发光细菌生 物敏感元件(11)为凝胶小球；由如下方法制备得到将发光细菌菌悬液与海藻酸钠溶液混 合均勻，将混合液逐滴滴入到氯化钙溶液中，固化。
3.利用权利要求1所述的设备进行水质急性毒性在线监测的方法，其特征在于向反应 试管内放入1 10粒发光细菌生物敏感元件，利用发光细菌连续培养系统向反应试管内加 入营养液，再利用加样系统向反应试管内加入样本，光电检测系统检测发光强度，数据处理 与传输系统采集数据并进行数据处理，检测结束后，由排液系统将反应试管内的废液排入 废液槽，发光细菌生物敏感元件继续保留在反应试管中重复加入发光细菌培养基、加入样 本、检测发光强度、采集数据和排液的操作，连续监测7 10天后，更换新的发光细菌生物 敏感元件，继续在线监测。
全文摘要
本发明公开了一种水质急性毒性在线监测的设备，它包括发光细菌连续培养系统、加样系统、排液系统、光电检测系统、数据显示系统，且能实现全自动操作。本发明还公开了利用上述设备进行水质急性毒性在线监测的方法。本发明的水质急性毒性在线监测设备结构简单，成本低廉，操作方便，非专业人员只需经过简单培训即可操作和维护；本方法能完全实现水质连续自动化急性毒性监测，而且灵敏度与国标的发光细菌法相当，极大的简化监测步骤。使用本设备和方法为突发环境事故提供预警及时的采取相应措施，可以极大减少损失。
文档编号C12Q1/02GK101871927SQ201010200079
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者孙旭, 曹妮妮, 杨柳燕, 肖 琳, 赵背生 申请人:南京大学;深圳市朗石生物仪器有限公司