一种提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量的方法

专利名称：一种提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高转基因植物种子中α -亚麻酸含量的方法，特别涉一种利用胚乳特异性启动子表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量的方法。
背景技术：
不饱和脂肪酸是人体必需的脂肪酸。不饱和脂肪酸根据双键个数的不同，分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸两种。根据双键的位置及功能又将多不饱和脂肪酸分为 ω-3系列和ω-6系列。α -亚麻酸、EPA、DHA属ω-3系列，亚油酸、γ -亚麻酸和花生四烯酸属ω-6系列。这些长链多不饱和脂肪酸是机体组织生物膜及一些重要器官(如大脑皮层、 神经组织和视网膜等)的组成成分，起到维持细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用，同时也是前列腺素、环前列腺素和白三烯类等具有强烈生理活性的自身调节物的前体。ω-3 脂肪酸脱氢酶(FAD!3)是合成ω-3系列不饱和脂肪酸的限速酶，能催化亚油酸生成α-亚麻酸(图 1) (Virginia Μ. Ursin, 2003. J. Nutr. 133 :4271-4274)，α -亚麻酸可以进一步转化为EPA和DHA。亚油酸也可以进一步转化为Y-亚麻酸，花生四烯酸。人类能够利用吸收的糖和蛋白质来合成饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，体内拥有ω-12、ω-15、ω-18脂肪酸脱氢酶，可通过转化外源性摄入的亚油酸和α-亚麻酸来合成多不饱和脂肪酸，但是，由于人体不存在ω-3、ω-6脂肪酸脱氢酶，所以，亚油酸和α -亚麻酸这两种脂肪酸必须从体外摄取。人类在千万年的进化过程中，这两类不饱和脂肪酸比例始终维持在1 1左右(Eaton et al. ,1998. World Review ofNutrition and Dietetics. 83 :12-23)。而当今社会人工种植和养殖的农畜产品中，ω-3不饱和脂肪酸含量极低，导致人类体内ω-6和ω-3的比例已由正常的 1 1 跃升为 15 1 20 1 (Simopoulos，2001. lipids. 36suppl :s83-89)。 科学研究证明，这种比例严重失调的脂肪酸饮食摄入会直接或间接地诱发多种疾病，如冠心病、心律不齐、动脉硬化、血栓、高血压、过敏、炎症、老年痴呆、抑郁症、视力下降、记忆力衰退、骨质疏松、免疫力下降、自闭症、糖尿病、癌症等(Stark et al. , 2008. Nutr. Rev. 66 326-33 。因此，及时有效补充ω-3不饱和脂肪酸，将人体内ω-6和ω-3的比例调节到合适状态，是科学营养、回归平衡饮食结构的迫切需要。α -亚麻酸是EPA、DHA等ω -3系列多不饱和脂肪酸的合成前体，α -亚麻酸的摄入量直接决定着ω-6和ω-3系列不饱和脂肪酸的比例。为此，联合国卫生组织和世界粮油组织建议，在每日膳食中亚油酸与α-亚麻酸的适当比例为5 1，α-亚麻酸的成人日摄入量为 2. 22 克(Simopoulos, 2001. lipids. 36suppl :s83_89)。α -亚麻酸的现行膳食来源是一些深海鱼类和一些特定的种子植物，如油菜、大豆、胡桃、亚麻、紫苏等。但由于深海鱼类的昂贵价格及日益严重的海水重金属污染、种子植物有限的产量，使得α-亚麻酸的摄入量远远不能满足人们的膳食需要。运用转基因方法在植物种子中合成和积累高含量的α-亚麻酸可以解决这一问题。人类主要的食物来源是粮食作物，其大多属于禾本科植物，例如水稻、小麦、玉米等。水稻是世界上食用人口最多、最重要的粮食作物。虽然ω-3脂肪酸去饱和酶基因在水稻种子胚和胚乳中均有所表达，但表达水平相对一致而且非常低。因此，水稻种子中α-亚麻酸含量仅占约万分之三，亚油酸与α-亚麻酸的比例更高达 25 1 (Shimada, et al. ,2000. Plant Biotechnol. 17 :43-48)。利用转基因方法，提高粮食作物种子中α-亚麻酸含量，是解决膳食中α-亚麻酸缺乏问题，进而提高人们健康的有效途径。Shimada等0000· Plant Biotechnol. 17 :43-48)曾报道利用组成型启动子在水稻中过量表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因可以提高种子中α-亚麻酸含量。然而利用组成型启动子驱动目的基因在植物生长发育的整个时期和植物体所有组织高强度表达会带来潜在的不利影响，如增加转基因植株代谢负担和不必要的浪费等，同时目标器官种子中的 α-亚麻酸含量仍然很低。为了使目的基因在植物体内高效表达，同时又减少对植物的不利影响，组织特异性启动子的研究和应用越来越重视。最近，申请人克隆和鉴定水稻胚乳特异性表达谷蛋白GluC基因启动子，并获得专利授权(专利号ZL200710098626. 0)，该启动子的活性是玉米泛素蛋白启动子ubiqintin-Ι的活性的4. 9倍，而且它主要表达于水稻种子胚乳中心部位(Qu et al.，2008. J Exp Bot. 59 =2417-2424) 0通常人们所食用的稻米是指加工后的精米，是水稻种子的胚乳部分。因此，通过水稻胚乳特异性强启动子过表达ω-3 脂肪酸脱氢酶基因，提高水稻精米中α-亚麻酸的含量，同时降低亚油酸与α-亚麻酸含量的比例，从而得到具有医疗和保健功能的水稻具有重要的实际意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种提高转基因植物种子中α -亚麻酸含量的方法。本发明所提供的提高转基因植物种子中α -亚麻酸含量的方法，是利用胚乳特异性启动子表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量的方法，具体是将胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒导入植物中，筛选得到在植物胚乳中特异性表达所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系；所述胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒包括植物胚乳特异性启动子及其下游连接的ω-3脂肪酸脱氢酶基因。所述方法中，所述胚乳特异性启动子可以包括任何植物胚乳特异性表达启动子， 例如水稻谷蛋白基因启动子、小麦种子贮藏蛋白基因启动子、大麦种子贮藏蛋白基因启动子、玉米醇溶蛋白基因启动子等，但不限于这些启动子。所述水稻谷蛋白基因启动子的序列为自 Genbank Accession Number 为 E似64107 (GI :166343763)的 5'第 1-2231 位核苷酸序列(序列7所示)，所述小麦种子谷蛋白基因启动子的序列为自Genbank Accession Number 为AJ577815 (GI :42734748)的5'第1_965位核苷酸序列，所述大麦种子醇溶蛋白基因启动子的序列为自 Genbank Accession Number 为 X52572 (GI 18923)的 5 ‘第 971-1976 位核苷酸序列，所述玉米醇溶蛋白基因启动子的序列为自Genbank Accession Number为 X63667(GI :22551)的 5'第 752-1449 位核苷酸序列。所述方法中，所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因是不饱和脂肪酸合成途径中催化 16:2(7，10)或 18:2(9，12)转化为 16 3 (7，10，13)或 18:3 (6，9，12)的关键酶的编码基因。 所有ω-3脂肪酸脱氢酶都含有三个高度保守的组氨酸簇，即ΗΧΧΧΗ，ΗΧΧΗΗ，ΗΧΧΗΗ。所述 ω-3脂肪酸脱氢酶基因可以包括微生物、植物、动物来源的任何ω-3脂肪酸脱氢酶基因序列，优选为包括植物来源的任何ω-3脂肪酸脱氢酶基因序列，例如大豆、亚麻、水稻、油菜等。所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因优选为水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因或大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因；所述水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的序列为自Genbank Accession Number为 AK071185(GI :32981208)的5'第223-1380位核苷酸序列；所述大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因的序列为自 Genbank AccessionNumber 为 ΑΥ204710 (GI :27902572)的 5'第 56-1186 位核苷酸序列。所述方法中，所述转基因植物可以包括通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。所述胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒通过含有该表达盒的植物表达载体导入植物中。所述植物表达载体为将所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒插入到 GluC-pGPTV载体的Sma I和Mc I酶切位点之间获得的重组表达载体。所述方法中，所述植物为禾本科植物。所述禾本科植物为水稻、玉米、小麦、高粱、 燕麦、大麦、黑麦等。所述筛选的方法包括通过分子鉴定的方法筛选获得在胚乳中特异性表达所述 ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系的TO代植株，将TO代植株自交，所得到的Tl代遗传分离群体，通过气相色谱分析检测转基因植株Τ2代种子胚乳中的α -亚麻酸含量，筛选出种子胚乳中α-亚麻酸含量高的转基因株系。所述筛选的方法还包括在所述种子胚乳中α-亚麻酸含量高的转基因株系中筛选获得纯合的转基因株系。本发明的获得种子中高α-亚麻酸含量的稳定遗传的转基因植株的方法，具体可包括以下步骤1)利用RT-PCR方法，分离得到ω-3脂肪酸脱氢酶基因。2)将步骤1)中分离得到的ω-3脂肪酸脱氢酶基因连接于胚乳特异性启动子，构建植物表达载体。3)将步骤2、中构建好的植物表达载体转化植物受体组织，培养得到Ttl代转基因植株。4) PCR, Southern、Northern、Western杂交分析步骤3)中得到的Ttl代转化植株， 筛选得到同时含有胚乳特异性启动子和ω-3脂肪酸脱氢酶基因的Ttl代转化植株。5)培育步骤4)中筛选得到的Ttl代转化植株自交所得到的T1代遗传分离群体， 通过气相色谱分析检测转基因植株T2代种子胚乳中的α -亚麻酸含量，筛选出种子胚乳中 α-亚麻酸含量高的转基因株系。6)从步骤幻获得的种子胚乳中α -亚麻酸含量高的转基因株系中筛选出纯合的种子胚乳中高α-亚麻酸含量的转基因植株。其中，可通过PCR分析目的基因的分离，可通过气相色谱分析检测种子胚乳中的α-亚麻酸含量。本发明创造性地利用胚乳特异性启动子驱动ω-3脂肪酸脱氢酶基因在转基因植物种子胚乳中特异性地表达，可以提高转基因植物种子中α-亚麻酸的含量，并可获得种子中α-亚麻酸含量高并且稳定遗传的转基因植株。按照本发明方法，通过RT-PCR分别从大豆(Glycine max)和水稻(Oryza sativa cv. kitaake)中分离得到ω-3脂肪酸脱氢酶基因(GmFAD3和0sFAD3)，将其连接于水稻谷蛋白基因GluC启动子之后，构建植物表达载体进行遗传转化，获得转基因植株。通过对种子胚乳中α-亚麻酸含量的气相色谱分析检测结果表明，在稳定遗传的T3代转基因水稻中，0sFAD3转基因水稻株系的精米中α -亚麻酸含量最高可达4. 86克/500克，α-亚麻酸与亚油酸的比值高达6. 9 1。每天食用200 克精米就可以达到联合国卫生组织建议的α-亚麻酸成人日摄入量标准。说明本发明方法可利用种子作生物反应器生产人体必须的ω-3多不饱和脂肪酸，得到α-亚麻酸含量提高和亚油酸含量降低的植物种子，培育可稳定遗传的种子中高α-亚麻酸含量的转基因作物。本发明的方法及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。下面结合实施例进一步阐明本发明，而不构成对本发明权力要求范围的限制，在实施例中所用的术语和缩写是本领域技术人员通用的术语和缩写。


图1为哺乳动物和植物中ω-6和ω-3系列脂肪酸代谢途径示意图。图2Α为水稻ω-3脂肪酸脱氢酶结构基因核苷酸序列。图2Β为水稻ω-3脂肪酸脱氢酶结构基因氨基酸序列。图3Α为大豆ω-3脂肪酸脱氢酶结构基因核苷酸序列。图IBB为大豆ω -3脂肪酸脱氢酶结构基因氨基酸序列。图4Α为从水稻cDNA中PCR扩增ω -3脂肪酸脱氢酶的电泳图谱。图4Β为从大豆cDNA中PCR扩增ω -3脂肪酸脱氢酶的电泳图谱。图5为GluC启动子融合水稻ω -3脂肪酸脱氢酶基因载体GluC-0sFAD3-35S-HPT 的结构示意图。图6为GluC启动子融合大豆ω -3脂肪酸脱氢酶基因载体GluC-GmFAD3-35S_HPT 的结构示意图。图7为转GluC: 0sFAD3载体Ttl代水稻植株PCR分析的电泳图谱。图8为转GluC: :GmFAD3载体Ttl代水稻植株PCR分析的电泳图谱。图9A为转GluC: :0sFAD3载体的Ttl代水稻植株以潮霉素基因为探针的Southern 杂交结果。图9B为转GluC: :GmFAD3载体的Ttl代水稻植株以GmFAD3为探针的Southern杂
交结果。图IOA为转GluC: 0sFAD3载体的Ttl代水稻植株以0sFAD3为探针的Northern杂交结果。图IOB为转GluC: :GmFAD3载体的Ttl代水稻植株以GmFAD3为探针的Northern杂交结果。图IlA为转GluC: :0sFAD3载体的Ttl代水稻植株以0sFAD3为抗原的Western杂交结果。图IlB为转GluC: :GmFAD3载体的Ttl代水稻植株以GmFAD3为抗原的Western杂交结果。图12A为转GluC: 0sFAD3载体T1代水稻植株PCR分析的电泳图谱。图12B为转GluC: 0sFAD3载体T2代水稻植株PCR分析的电泳图谱。图13A为转GluC: :GmFAD3载体T1代水稻植株PCR分析的电泳图谱。
图13B为转GluC: :GmFAD3载体T2代水稻植株PCR分析的电泳图谱。图14A为非转基因水稻种子气相色谱分析结果。图14B为T2代0sFAD3转基因水稻种子气相色谱分析结果。图15为1\、T2, T3代转基因植株和非转基因植株中α -亚麻酸含量的气相色谱分析结果。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、利用胚乳特异性启动子表达水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量一、水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的获得从GenBank中查找水稻ω-3脂肪酸脱氢酶核苷酸序列(GenBank号为ΑΚ071185)， 设计引物扩增水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因(OsFAD； )。为便于载体构建，在每对引物上依次添加两个酶切位点(下划线所示)。水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因扩增引物正向引物为F2 :5' -AACCCGGGATGGTTAAAG ACACAAAG-3 ‘ (SmaI)(序列 1)，反向引物为 R2 5 ‘ -AAGAGCTCTCAGTCTCGTTGCGAGTGGA-3 ‘( Sac I)(序列 2)。用IYizol试剂盒(购自hvitrogen公司)，从开花后12天的水稻Kitaake (Oryza sativaL. cv. Kitaake, Qu and Takaiwa, Plant Biotech J 2004，2 :113-125，中国科学院植物研究所已经保存)叶片中提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书(购自Promega公司)， 以2 μ g总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA。以水稻cDNA为模板，以F2和R2为引物， 进行PCR扩增水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因序列。反应体系为25 μ 1 :cDNA 1，正向引物 (IOpM) 1 μ 1，反向引物(IOpM) 1 μ l，dNTP 混合物(IOmM) 1 μ 1，ExTaqDNA 聚合酶 IOXbuffer 2. 5 μ 1，水 18. 3 μ 1，ExTaqDNA 聚合酶(5U/μ 1) 0. 2 μ 1。反应程序为94°C预变性 5min，然后 94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，36 个循环，最后 72°C，lOmin。PCR扩增得到约1. 2kb的目的条带(图4A，图4A中，第1泳道为分子量标准，第2 泳道为水稻的ω-3脂肪酸脱氢酶基因)。回收扩增产物，直接连接到PMD18-T载体(购自 TaKaRa公司)上，进行测序，结果表明，扩增得到的水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因序列大小为1158bp，如图2所示，该扩增序列与自Genbank Accession Number为AK071185的5'端第223-1380位核苷酸序列完全一致，编码的氨基酸序列为自Genbank Accession Number 为BAG92361的氨基端第1-385位氨基酸残基(图2A，图2B)。其中，图2B中方框标示的是 ω-3脂肪酸脱氢酶三个保守的组氨酸簇。将测序检测表明含有水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因片段的重组载体命名为PMD-0SFAD3。二、ω-3脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体构建与遗传转化UGluC启动子融合水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体构建用Sma I禾Π Sac I双酶切pMD_0sFAD3质粒和GluC-pGPTV双元表达载体(Qu etal.，2008. J Exp Bot. 59 =2417-2424)，回收含有水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的1158bp 的酶切片段，将回收得到的片段插入到GluC-pGPTV载体。GluC-pGPTV中含有GluC启动子，该GluC启动子的核苷酸序列为自Genbank Accession Number为E似64107 (GI 166343763)的5'端第1-2331位核苷酸序列(序列7所示)，GluC启动子为植物胚乳中特异性表达启动子；中国科学院植物研究所已经保存GluC-pGPTV载体)的SmaI和Mc I 酶识别位点之间。将得到的含有水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因0sFAD3植物表达载体命名为 pGPTV-GluC-0sFAD3 (图 5)，pGPTV-GluC_0sFAD3 中，GluC 启动子的下游与水稻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因连接，GluC启动子启动水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达。2、转 pGPTV-GluC-0sFAD3 和 pGPTV-GluC_GmFAD3 植物表达载体水稻的获得。用冻融法将pGPTV-GluC-0sFAD3 导入农杆菌 EHA105(Hood et al.，Transgenic Res. 1993. 2 :208_218，中国科学院植物研究所已经保存)中，然后通过农杆菌介导法转化水稻Kitaake胚性愈伤组织。利用潮霉素筛选方法(按照文献Hiei et al. 1994. Plant J. 6 :271-282所述方法进行)，获得M株TO代转基因植株。利用PCR方法对上述筛选得到的转pGPTV-GluC_0sFAD3水稻进行PCR 分子检测。用于检测转pGPTV-GluC-0sFAD3植物表达载体再生植株的引物为 正向引物为F4 :5 ‘ -TGTGAATTTAGTGTAGTTTG-3 ‘(序列3)，反向引物为R4 5 ‘ -TCAGTCTCGTTGCGAGTGGA-3 ‘(序列 4)。PCR 反应体系为 25 μ 1 :cDNA 1 μ 1，正向引物 (IOpM) 1 μ 1，反向引物(IOpM)I μ 1，dNTP 混合物(IOmM) 1 μ 1, rTaqDNA 聚合酶 IOXbuffer 2. 5μ 1，水 18. 3 μ 1，rTaqDNA 聚合酶(5U/μ 1) 0. 2 μ 1。反应程序为94°C预变性 5min，然后 94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C 1. 5min, 36 个循环，最后 72°C，IOmin0 PCR 扩增得到 1. 6kb 的目的条带即为检测阳性。结果表明得到22株PCR检测阳性的转pGPTV-GluC-0sFAD3水稻 TO代植株(图7)。图7中M为分子量标准，第2 M泳道分别为转PGPTV-GluC-0sFAD3 水稻表达载体的再生植株。PCR检测阳性的TO代转PGPTV-GluC-0sFAD3水稻所结的种子和由该种子长成的植株为Tl代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。三、转基因水稻植株的分子检测1、PCR检测阳性的Ttl代转pGPTV-GluC-0sFAD3水稻植株的Southern杂交检测
用CTAB法提取PCR鉴定呈阳性的Ttl代转PGPTV-GluC-0sFAD3水稻植株叶片的基因组DNA，约40 μ g DNA加入50单位EcoR I充分酶切后，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分离后， 用0. 4N的NaOH将DNA转移到带正电核的尼龙膜(购自Amershampharmacia公司)上。转移后的膜在含有7% (g/ml) SDS的0. 5M磷酸钠缓冲液中65°C预杂交5小时，用〔α」2P〕dCTP 随机引物法进行探针标记(购自中国福瑞公司)。用于转水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因植株的杂交探针序列为5' -AACTGCAGGAATTCGCAAGGAATCGGTCAATACA-3'(序列幻；5' -AA GGTACCGTCGACTTCTACACAGCCATCGGTC-3 ‘(序列 6)。65 °C 杂交 20 小时后，在含有 0. 1 % SDS 的2XSSC中于65°C洗膜两次，每次15分钟，再在0. 1% SDS的1 XSSC中于65°C洗膜一次， 15分钟。压X光片M 48小时后，放射性自显影，以非转基因水稻Kitaake为对照。结果如图9A所示。Southern杂交结果显示，各个转基因株系中都能检测出杂交条带，并且在不同的株系中，杂交条带的数目和出现的位置不完全相同，这表明水稻的ω-3脂肪酸脱氢酶基因已经成功整合到水稻基因组中，并且各个转基因株系间是相互独立的转化个体。图 9Α中，第1泳道为非转基因植株对照，2 11泳道为Ttl代转水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因植株。 2、PCR检测阳性的Ttl代转pGPTV-GluC_0sFAD3水稻的种子的Northern杂交检测
用Trizol试剂盒提取PCR检测阳性的Ttl代转pGPTV-GluC_0SFAD3水稻植株开花后12天的水稻种子的总RNA，约20 μ g总RNA经1. 2%琼脂糖凝胶电泳分离后，用20 X SSC 将RNA转移到带正电核的尼龙膜(购自Amersham pharmacia公司)上。用〔α -32P) dCTP 随机引物法进行探针标记(购自中国福瑞公司)。用于转水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因植株的杂交探针序列为5‘ -AACTGCAGGAATTCGCAAGGAATCGGTCAATACA-3‘ ；5' -AAGGTACCGTCG ACTTCTACACAGCCATCGGTC-3 ‘。65 °C 杂交 20 小时后，在含有 0. 1 % SDS 的 2 X SSC 中于 65 °C 洗膜两次，每次15分钟，再在0. 1 % SDS的IXSSC中于65°C洗膜一次，15分钟。压X光片M 48小时后，放射性自显影，以非转基因水稻Kitaake为对照。结果如图IOA所示。 Northern杂交结果显示，在转PGPTV-GluC-0sFAD3水稻种子中，与非转基因对照植株相比， 该基因在转录水平呈现不同程度的提高。这表明在转基因植株种子胚乳中，GluC启动子可以有效、特异地驱动水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转录起始。图IOA中，第1泳道为非转基因植株对照，2 11泳道为Ttl代转水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因植株。3、转基因水稻Ttl代种子的Wfestern杂交检测从转PGPTV-GluC-0sFAD3水稻的成熟种子中提取总蛋白，种子充分研磨后，加入抽提缓冲液0.05M Tris-Hcl, 10 % glycerol, IOmM PMSF，ρΗ7· 0，在 13000Xg 离心 10 分钟，收集上清，加入上样缓冲液(12. 5mM Tris, pH6. 8,20% glycerol, 2% (g/ml)SDS, 0. 001 % (g/ml)bromophenol blue, 2 % (V/V) 0. 3M 2-ME)，于沸水中加热 2 分钟。经过 12% (g/ml) SDS-PAGE胶电泳后，用半干法将蛋白转移到PVDF膜上(购自Millipore公司)。膜依次进行封闭、漂洗、一抗、漂洗、二抗、漂洗、ECL超敏发光液反应(购自Amersham Biosciences公司)、压片、显影、定影、扫描，以非转基因水稻Kitaake为对照。结果如图 IlA所示。Western杂交结果显示，与非转基因植株对照相比，转基因株系中水稻的ω-3脂肪酸脱氢酶基因的蛋白表达水平有不同程度的增加。图IlA中，第1泳道为非转基因植株对照，2 11泳道为Ttl代转水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因植株。4、转基因水稻纯合株系的鉴定将分子检测呈阳性的只含一个拷贝的Ttl代转基因株系通过自交得到T1代，T1代转基因株系通过自交得到T2代，通过PCR方法检测与筛选，最终获得α -亚麻酸含量提高的水稻纯合株系。理论上，T1代转基因株系中纯合株系所占比例为1/4，杂合株系所占比例为 2/4。与T1代相对应的T2代中不发生分离的株系为纯合株系，而与T1代相对应的T2代中只要有分离的株系，该T1代株系为杂合株系。在纯和株系的自交后代中，目的基因所控制的性状，不会发生分离。植株之间性状整齐一致，可以稳定的遗传和表达。用于检测转PGPTV-GluC-0sFAD3植物表达载体株系的引物为正向引物为F4 5 ‘ -TGTGAATTTAGTGTAGTTTG-3 ‘，反向引物为 R4 5 ‘ -TCAGTCTCGTTGCGAGTGGA-3 ‘。PCR 反应体系为25 μ 1 =CDNA 1 μ 1，正向引物(IOpM) 1 μ 1，反向引物(IOpM)I μ 1，dNTP混合物(IOmM) 1 μ 1，daqDNA 聚合酶 IOXbuffer 2. 5 μ 1，水 18. 3 μ 1，daqDNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 2μ Io 反应程序为94°C预变性 5min，然后 94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 1. 5min, 36个循环，最后72°C，10min。PCR扩增得到1. 61Λ的目的条带即为检测阳性。结果表明 得到20株PCR检测阳性的转pGPTV-GluC-0sFAD3水稻T1代植株(图12A)。图12A中M为分子量标准，第2 23泳道分别为转PGPTV-GluC-0sFAD3水稻表达载体的植株。选取T1 代植株中鉴定呈阳性的植株自交得到1~2代植株，通过PCR筛选得到不分离的纯合株系(图12B)。图12B中M为分子量标准，第2 M泳道分别为转PGPTV-GluC-0sFAD3水稻表达载体的T2植株。四、转基因水稻种子的气相色谱分析1、T2代转pGPTV-GluC_0sFAD3水稻种子α -亚麻酸的气相色谱分析 将转pGPTV-GluC-0sFAD3水稻T2代成熟种子研磨成细粉，装入事先装有 10 μ 1(6 μ g) 17:0脂肪酸内标的带塞玻璃试管中，在试管中加入1.5ml硫酸甲醇溶液(5% 硫酸+95%甲醇)充氮气后密封。将试管放在85°C水浴1小时，冷却后加入1.5ml正戊烷和Iml水终止甲基化反应，振荡后2500rpm离心10分钟，收集上清液，氮气吹干后加入 20 μ 1重蒸的正己烷，取1 μ 1样品进行气相色谱分析。气相色谱仪器型号为惠普HP6890GC， 色谱柱为HPINN0WAX，柱长30m，内径0. 25mm,涂层厚度0. 25 μ m,柱箱温度设置为梯度升温 (170 210°C，5°C /min)，以非转基因水稻Kitaake为对照。在10个过表达水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系中，每500克稻米中 α-亚麻酸的含量最低值为1. 13 士 0. ^g，最高值为4. 87 士 0. 16g，平均值为3. 13 士 0. 15g。 与非转基因对照植株相比，α -亚麻酸的含量分别提高了 5. 5 5倍，平均值为15. 5倍 (表1)。表1中，对照为非转基植株，1 10为转GluC: :0sFAD3载体的水稻植株。对一个T2代过表达水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因转基因株系进行气相色谱分析， 结果显示，与非转基因对照植株相比，α-亚麻酸的峰值呈现近8倍的跃迁(图14)。其中，图14Α为非转基因植株，图14Β为转GluC: :0sFAD3载体的水稻植株，红色箭头指示的是 α-亚麻酸相应的出峰位置。表1 Τ2代转GluC::0sFAD3载体基因和非转基因稻米中α-亚麻酸含量的气相色
谱分析结
\_____________
脂肪酸含量/500克
16:018:018:118:218:318:3/18:22.24 ±0.080.20 ±0.023.32 ±0.094.0S±0.080.1S+0.010.044 ±0.0032.08+0.100.22+0.032.06+0.090.74±0.154.87+0.166.85±1.782.26 ±0.130.24 ±0.032.11 土 0.141.14±0.174.24±0.163.78+0.672.28±0.’Ι30.27 ±0.022.06+0.121.13+0.274.07+0.183.09 土 0.682.01 ±0.290.21 土 0.022.26±0.261. ；9±0.243.83 ±0.222.30 ±0.422.03 ±0.27023 ±0.032.63 土 0.311.85±0.193.27 ±0.221.79+0.292.03+0.240.27±0.032.73 ±0.262.08 土 0.312.90 ±0.311.43 土 0.342.04 ±0.110.24+0.052.95 ±0.062.11+0.092.66 ±0.061.26 土 0.082.19+0.160.20 ±0.022J8±0.1S2.20±0.172.43+G.181.12 土 0.162.21 ±0.070.22 土 0.023.13 土 0.122.50±0.191.94 ±0.230.78 士 0.152.06 土 0.100.22士0.023.38 士 0.023.21 ±0.221.13 ±0260J6±0.1G 对转GluC: :0sFAD3载体的水稻植株T2代转基因水稻种子中亚麻酸与亚油酸的比值进行统计学分析，结果显示，在非转基因对照植株中，α-亚麻酸与亚油酸含量的比值为 0. 044士0. 003 ；在10个过表达0sFAD3基因的转基因株系中，α -亚麻酸与亚油酸含量的比值的最低值为0. 36士0. 10，最高值为6. 85士 1. 78，平均值为2.观士0. 38。与非转基因对照植株相比，二者的比值提高了 8. 2 155. 7倍，平均值为51. 8倍(表1)。表1中，对照为非转基植株，1 10为转GluC: :0sFAD3载体的水稻植株；2、1\、T2、T3代转基因水稻种子α -亚麻酸的气相色谱分析选取α -亚麻酸含量最高的转GluC: 0sFAD3载体的水稻株系，将转GluC: :0sFAD3 载体的水稻植株1\、T2、T3代各10粒种子经过步骤1中所述步骤处理后上样，结果显示在 T1, T2, T3代过表达大豆和水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系中，每500克稻米的 α -亚麻酸含量依次为4. 79克、4. 90克、4. 92克(图15)，这表明在GluC启动子驱动下，过表达水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因可以稳定遗传到T3代。图13中，1为非转基因植株对照， 2为转GluC: :GmFAD3载体的水稻植株，3为转GluC: :0sFAD3载体的水稻植株。3、T3代转基因水稻精米中α -亚麻酸的气相色谱分析选取转GluC: :0sFAD3载体的水稻植株α -亚麻酸含量最高的前7个株系，每个株系选一粒种子，将一粒成熟转基因水稻种子切成两半，其中一半用精米机(KettElectrical Laboratory, Tokyo, Japan)研磨30秒钟，一半精米和相对应的另一半糙米经过步骤1中的处理后进行α-亚麻酸的气相色谱分析。在7个过表达水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系中，每500克稻米中 α-亚麻酸的含量最低值为1.46 士 0. 10g，最高值为4. 86 士 0. 17g，平均值为3. 25 士 0. 20g。 与相应的糙米相比，α-亚麻酸的含量分别提高了 1.1倍(表2)。表2中，Cl C7为转 GluC: :0sFAD3载体的水稻糙米；Pl P7为转GluC: :0sFAD3载体的水稻精米。表2. T3代转GluC: :0sFAD3载体的水稻糙米和精米中α -亚麻酸含量的气相色谱分析结果
权利要求
1.一种提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量的方法，是将胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒导入目的植物中，筛选得到在植物胚乳中特异性表达所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系；所述胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒包括植物胚乳特异性启动子及其下游连接的ω-3脂肪酸脱氢酶基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述胚乳特异性启动子为水稻谷蛋白基因启动子、小麦种子贮藏蛋白基因启动子、大麦种子贮藏蛋白基因启动子或玉米醇溶蛋白基因启动子；所述水稻谷蛋白基因启动子的序列为自Genbank AccessionNumber为 EU264107的5'第1-2331位核苷酸序列，所述小麦种子贮藏蛋白基因启动子的序列为自 Genbank Accession Number为AJ577815的5'第1-965位核苷酸序列，所述大麦种子C藏蛋白基因启动子的序列为自Genbank Accession Number为X52572的5‘第971-1976位核苷酸序列，所述玉米醇溶蛋白基因启动子的序列为自GenbankAccession Number为)(63667 的5'第752-1449位核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因为来源于植物的ω-3脂肪酸脱氢酶的编码基因，优选为来源于大豆、亚麻、水稻、或油菜的ω-3脂肪酸脱氢酶的编码基因。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因为水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因或大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因；所述水稻ω-3脂肪酸脱氢酶基因的序列为自Genbank Accession Number为AK071185的5'第223-1380位核苷酸序列；所述大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因的序列为自GenbankAccession Number为ΑΥ204710 的5 ‘第56-1186位核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于所述胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒通过含有该表达盒的植物表达载体导入植物中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为将所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒插入到GluC-pGPTV载体的Sma I和Mc I酶切位点之间获得的重组表达载体。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于所述筛选的方法包括通过分子鉴定的方法筛选获得在胚乳中特异性表达所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因株系的Ttl代植株，将Ttl代植株自交，所得到的T1代遗传分离群体，通过气相色谱分析检测转基因植株T2R种子胚乳中的α-亚麻酸含量，筛选出种子胚乳中α-亚麻酸含量高于所述目的植物的转基因株系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述筛选的方法还包括在所述种子胚乳中α-亚麻酸含量高于所述目的植物的转基因株系中筛选获得纯合的转基因株系。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述分子鉴定的方法包括PCR鉴定和/或 Southern杂交鉴定和/或Northern杂交鉴定和/或^festern杂交鉴定。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或胚乳型双子叶植物，优选为禾本科植物，最优选为水稻、玉米、小麦、高粱、燕麦、大麦或黑麦。
全文摘要
本发明公开了一种提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量的方法。该方法，是将胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒导入植物中，筛选得到在胚乳中特异性表达所述ω-3脂肪酸脱氢酶基因的转基因植物；所述胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒包括植物胚乳特异性启动子及其下游连接的ω-3脂肪酸脱氢酶基因。本发明可改良种子品质，适用于α-亚麻酸大规模生产和培育可稳定遗传的种子中高α-亚麻酸含量的转基因作物。
文档编号C12N15/82GK102277375SQ20101019978
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者刘华梁, 曲乐庆 申请人:中国科学院植物研究所