专利名称：一种良种奶山羊多基因聚合的选育方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种良种奶山羊多基因聚合的选育方法， 该方法应用PCR-SSCP和DNA测序技术检测被检个体催乳素受体(PRLR)基因和促黄体素 beta亚基(LHi3)基因的单链DNA碱基突变多态性，通过分析高产奶山羊个体(Fl代)多态性与产羔数的关系确定适宜的分子标记，分析高产奶山羊个体(Fl)的不同基因型组合与产羔数之间的关系，并上溯亲代(F0代)，跟踪子代(F2代)，检测母羊个体的基因型组合与产羔数的关系，研究不同基因型在多胎性状形成中的贡献率，然后挑选高产个体的基因型组合，分析高产个体基因型组合形成的选配方式，再应用这些选配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
背景技术：
多胎性状的选育是奶山羊育种的重要目标之一，多胎性状是由微效多基因决定的数 量性状，遗传力很低(约为0. 23左右)，常规育种手段在较短时期内难以取得明显进展， 这在很大程度上限制了我国奶山羊养殖业的发展。随着动物基因组学的发展，大量的DNA 分子标记已被开发和应用，动物基因组图谱绘制逐步完善，越来越多的具有重要经济意义的功能基因相继被挖掘出来，与山羊繁殖性状紧密相关的研究也取得很大进展。基因聚合 (Genepyramiding)是通过基因工程手段，将分散在不同品种或品系中的优良基因通过杂交、回交、复合杂交等手段聚合到同一个品种中。畜禽的大部分经济性状具有加性效应，基因表达呈累加作用，即集中到一个品种中的同效基因越多表达越充分。目前，国内外关于羊分子育种的研究主要集中在羊的分子标记检测及其与性状的相关性方面，对于基因聚合育种技术大多数仍然仅停留于概念上，对其理论的研究相对滞后。
单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphisms, SNP)就是指基因组 DNA 序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNPs可以是两个或多个等位基因的多态，因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失、插入/缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换 (以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)以及颠换(嘌呤与嘧啶互换) 所引起。具有颠换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG(核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后)二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点， 其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区 SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在编码区内的变异率仅占有周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种一种是同义cSNPs， 即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的 “含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响，尤其对于编码区突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能的发挥。基因序列上碱基的插入/缺失突变，同样将导致所编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列改变，以致影响到蛋白的生物学功能， 从而造成对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。
由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs 可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见， 故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现 SNPs 即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法， 但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是， PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时， 检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一股的分子实验室来说可实施性不强。
催乳素(prolactin，PRL)是一种垂体前叶肽类激素，已报导的催乳素的作用有 300多种，可将它们分为六大类1)繁殖和泌乳；2)生长和发育；3)内分泌和代谢，4)脑和行为；5)免疫调节；6)电解质平衡。这些作用由催乳素受体(prolactinrec印tor，PRLR) 调节。催乳素受体已在包括脑、子宫、胚盘、卵巢在内的各种组织中检测到。以前认为不含 PRLR的器官，例如嗅神经上皮、胎儿肾上腺皮层、胃、肠及支气管粘膜、肾管上皮、脉络膜丛、 甲状腺、肝胰上皮也有PRLR0RNA的表达。催乳素受体属于细胞因子受体家族成员，这一家族成员还包括一些白细胞介质、颗细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子(LIF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素、肥胖因子等。尽管这些成员在遗传上明显无关，但它们在细胞外域都含有高度保守的氨基酸序列。鉴于催乳素受体的多种作用，国内外对催乳素受体的研究日益深入。
促性腺激素(LH)对于维持雄性和雌性动物的繁殖能力来说具有很重要的作用， 哺乳动物排卵主要靠LH的作用。有很多的学者都在对促性腺激素更深的探索，并且这些研究都进入了分子生物学的领域。譬如说，对以LH合成为基础的分子机制的全面理解需要α 和LHi3启动子调控区域的研究。对亚基基因来说，明显是多顺式元件指导细胞特异表达， 同时对性类固醇和GnRH作出反应。这些研究包括来自3个物种的。亚基启动子，它们利用了短暂表达和转基因模型。并且在对促黄体素的生理功能做一些更广泛的研究时发现促性腺激素有一个明显的特性是它以不连续的脉冲形式释放，在排卵前的最后阶段形成一个 LH峰促使卵泡成熟和排卵。马玉林和张寿等的研究数据表明，排卵前，在LH的作用下产生的孕酮可以触发排卵酶的形成和释放，且在LH的作用下，成熟的卵泡能分泌前列腺素，后者可能使成熟卵泡周围间质平滑肌纤维收缩，促使卵泡破裂及排卵。另外，在自然发情周期中，通常是发情高潮后的几个小时出现LH分泌峰，此后的20-24小时排卵。排卵的推迟暗示LH分泌峰和排卵之间的非协调作用或LH分泌峰不足刺激诱导排卵。同时分泌峰能终止颗粒细胞的生长和成熟，有助于它们分化为黄体颗粒细胞，促使孕酮的分泌有利于妊娠。因此，当绵羊自然发情、进行人工授精的同时给予外源性的LH。可以加速体内LH峰的出现，促使成熟卵泡排卵和排卵后的黄体形成从而达到提高受胎率的目的。因此，促黄体素是一种重要的促性腺激素，对于维持雌性和雄性动物的繁殖能力具有很重要的作用。
为此，以优秀多胎个体为研究起点，通过典型优秀母羊个体基因型的上溯和跟踪， 分析不同基因型和基因型组合在多胎性状形成中的贡献率，探索优良基因的传递规律及其聚合模式，旨在为多胎新品系的建立和分子标记辅助多基因聚合育种的实践提供理论依据和技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种良种奶山羊多基因聚合的选育方法。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种良种奶山羊多基因聚合的选育方法，其特征在于，以连续产2羔及以上的奶山羊基因组DNA为模板，在PCR 条件下，利用4对引物PI、P2、P3和P4，分别扩增催乳素受体基因和促黄体素beta亚基基因，其中所述的引物P1如下上游引物IF 5 ‘ -TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3 ‘； 下游引物IR 5 ‘ -GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3 ‘；所述的引物P2如下上游引物2F 5 ‘ -CTTACCACAACATTGCTGACG-3 ‘；下游引物 2R :5 ‘ -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3 ‘； 所述的引物P3如下上游引物3F :5 ‘ -CTTACCACAACATTGCTGACG-3 ‘；下游引物3R :5 ‘ -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3 ‘；所述的弓丨物P4如下上游弓丨物4F 5' -CTTACCACAACATTGCTGACG-3‘；下游引物 4R:5' -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3‘；引物 Pl扩增催乳素受体基因内含子2，引物P2扩增催乳素受体基因外显子10，用于筛查山羊催乳素受体基因位点的突变；引物P3扩增促黄体素beta亚基基因5'非翻译区，引物P4扩增促黄体素beta亚基基因外显子1，用于筛查山羊促黄体素beta亚基基因位点的突变；根据琼脂糖凝胶电泳对4对引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛查到催乳素受体基因内含子2和外显子10，以及促黄体素beta亚基基因5 ‘非翻译区和外显子1共有4个碱基的突变；再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对这4个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析高产奶山羊个体多态性与产羔数的关系及不同基因型组合与产羔数之间的关系，并上溯亲代，跟踪子代，检测母羊个体的基因型组合与产羔数的关系，分析不同基因型在多胎性状形成中的贡献，挑选高产个体的基因型组合，分析高产个体基因型组合形成的选配方式，应用这些选配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
所述的PCR扩增的条件是12 μ L反应体系包括0. 25U Taq DNA聚合酶，6 μ L的 2XBuffer，0. 4μ L的山羊基因组DNA样品，IOpmol/μ L各引物的上、下游引物各0. 4 μ L和灭菌超纯水4.7 μ L。
PCR反应程序如下1)利用引物Pl的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
2)利用引物P2的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
3)利用引物P3的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，57°C退火30s， 72°C延伸30s，共进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
4)利用引物P4的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，共进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
所述的催乳素受体基因内含子2在114bp存在C — T的突变，外显子10在319bp 存在C — A的突变；所述的黄体素beta亚基基因的5'非翻译区在153bp存在C — A的突变，外显子1在64bp存在T — C的突变。
所述的基因分型是用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和分析引物PI、P2、P3和P4 的PCR扩增产物，结果如下引物Pl位点纯合型GG在114bp位的碱基是C，杂合型GH在 114bp位的碱基是T\C，杂合型HH在114bp位的碱基是T ；引物P2位点纯合型CC在319bp 位的碱基是C，杂合型⑶在319bp位的碱基是C\A，杂合型DD在3 19bp位的碱基是A ；引物 P3位点纯合型QQ在153bp位的碱基是A，杂合型PQ在153bp位的碱基是C\A，纯合型PP 在153bp位的碱基是CC ；引物P4位点纯合型匪在64bp位的碱基是C，杂合型LM在64bp 位的碱基是T\C，纯合型LL在64bp位的碱基是T。
所述的高产个体的基因性组合为GGCCPPLL (Fl代和F2代)、GGCCPQMM(Fl代)和 GGCDPPLL (Fl 代)和 GGCCQQLL (F0 代)。
所述的不同基因型在多胎性状形成中的贡献率为，CC基因型的聚合效应值比CD 基因型的高14. 12%，匪基因型的聚合效应值比LM基因型的高3. 8%，PP基因型的聚合效应值比QQ基因型的高15. 67%, LL基因型的聚合效应值比LM基因型的高11.48% ；PQ基因型的聚合效应值比QQ基因型的高11.02%，CD基因型的聚合效应值比DD基因型的高 10. 69%与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果提出了与山羊产羔性状相关的功能基因PRLR内含子2和外显子10以及LH β基因5' UTR和外显子1的4个SNPs，这4 个SNPs能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。
对这两个基因的SNPs进行了基因分型和基因频率分析，不但分析了 Fl代不同基因型以及基因型组合与产羔性状之间的关系，且上溯亲代(F0代)，跟踪子代(F2代)，检测母羊个体的基因型组合与产羔数的关系，研究不同基因型在多胎性状形成中的贡献率，挑选高产个体的基因型组合，分析高产个体基因型组合形成的选配方式，应用这些选配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
图1是山羊PRLR基因利用引物Pl进行PCR扩增电泳图，图中，M表示Marker I片段，片段长度从上倒下依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp ；图2是山羊PRLR 基因引物P2进行PCR扩增电泳图，图中，M表示=Marker I片段，片段长度从上倒下依次为:100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp ；图 3 是山羊 LHβ 基因利用引物 Ρ3 进行 PCR 扩增电泳图，图中，M表示Marker I片段，片段长度从上倒下依次为100bp、200bp、300bp、 400bp、500bp、600bp ；图4是山羊LH β基因利用引物P4进行PCR扩增电泳图，图中，M表示 Marker I 片段，片段长度从上倒下依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp ；图 5是山羊PRLR基因利用引物Pl进行PCR扩增产物的SSCP检测电泳图，图中，1，3表示GH基因型；2表示GG基因型；4，5和6表示HH基因型；图6是山羊PRLR基因利用引物P2进行 PCR扩增产物的SSCP检测电泳图，图中，图中，1，6表示⑶基因型；3，4和5表示CC基因型；2表示DD基因型；图7是山羊LHi3基因利用引物P3进行PCR扩增产物的SSCP检测电泳图，图中，1，3和5表示PP基因型；2和4表示PQ基因型；6表示QQ基因型；图8是山羊LH β基因利用引物P4进行PCR扩增产物的SSCP检测电泳图，图中，1，2和4表示LL 基因型；3表示LM基因型；5表示匪基因型。
以下通过对连续产2羔及以上的奶山羊基因组DNA的提取、检测和浓度分析，以及在PCR扩增条件下，利用引物P1、P2、P3和P4扩增的PRLR内含子2和外显子10以及LHi3 基因5' UTR和外显子1扩增产物的聚丙烯凝胶电泳分析实施例来对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式A、利用引物Pl和P2分别对I3RLR内含子2和外显子10以及利用引物P3和P4对 LH^基因5' UTR和外显子1的PCR扩增及其多态性的检测1、山羊血样的采集及处理取山羊血样5mL，加入0. 2 μ L的ACD (柠檬酸2. 4g ；柠檬酸三钠6. 6g ；葡萄糖7. 35g ；定容至 50mL,高压灭菌)抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80°C保存备用。
本实施例采用对连续产2羔及以上的西农萨能奶山羊血样265份，采自陕西省千阳萨能羊种羊场和陕西绿色新世纪生物有限公司。
2、血样基因组DNA的提取、纯化1)将冷冻血样室温解冻，转移500 μ L至1. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混勻，12000r/min离心IOmin (4°C )，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。
(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 μ L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提缓冲液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超纯水500mL，灭菌，调pH至8. 0，4°C保存备用。
(3)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混勻，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加 ι μ L蛋白酶κ混勻继续消化至澄清。
(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 μ L，温和摇动离心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1. 5mL离心管中，重复一次。
(5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1. 5mL离心管中。
(6)加0. 1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30 60min。
(7)4°C，12000r/min离心lOmin，弃去上清液，用70 %的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
(8)4°C,12000r/min离心lOmin，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。
(9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-缓冲液或超纯水，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。
(10) 500μ L的DNA溶液中加入质量浓度10%的SDS，使其终浓度为0. 1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50 μ g/mL。
(11) 5°C保温 IOh 左右。
(12)苯酚、氯仿、异戊醇(25 24 1)混合物和氯仿分别抽提一次，苯酚、氯仿、 异戊醇混合物用量和氯仿等体积。
(13) 12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。
(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。
(15)倒掉液体，用质量浓度70%的乙醇洗涤后晾干，加入60μ L灭菌超纯水溶解， 4°C待检测。
3、DNA池的构建(1) 1 %琼脂糖凝胶电泳检测选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。
(2)0D值测定用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA 含量和OD26tZOD28tl的比值。如OD26tZOD28tl比值小于1. 6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚， 则应进行纯化；若比值大于1. 8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度(μ g/mL) = 50 X OD260值X稀释倍数(3)品种DNA池的构建DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/ μ L，然后从西农萨能奶山羊265个个体、浓度为50ng/ μ L 的DNA的样品中取5 μ L混合构建成DNA池。
4、PCR扩增引物设计聚合酶链式反应引物根据NCBI上GenBank提供的绵羊PRLR 基因的序列设计(登录号:AF042358和AF041257)；引物Pl和引物P2，用引物Pl扩增PRLR 基因内含子2，用引物P2扩增PRLR基因外显子10，筛查山羊PRLR基因Pl和P2位点的突变；根据绵羊LHi3基因序列(GenBank登录号S54695)设计引物P3和P4，扩增促黄体素 beta亚基基因5'非翻译区和外显子1，筛查山羊促黄体素beta亚基基因位点的突变；。
所述的引物Pl 如下上游引物 IF :5 ‘ -TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3 ‘；下游引物IR :5 ‘ -GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3 ‘；所述的引物P2如下上游引物2F 5 ‘ -CTTACCACAACATTGCTGACG-3 ‘；下游引物 2R :5 ‘ -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3 ‘； 所述的引物P3如下上游引物3F :5 ‘ -CTTACCACAACATTGCTGACG-3 ‘；下游引物 3R :5 ‘ -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3 ‘；所述的引物 P4 如下上游引物 4F 5' -CTTACCACAACATTGCTGACG-3‘；下游引物 4R:5' -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3‘。
5,PCR扩增分别以西农萨能奶山羊群体的DNA池为模版，利用引物Pl和P2在PCR 条件下分别扩增山羊PRLR内含子2和外显子10，以及利用引物P3和P4分别扩增LHi3基因5' UTR和外显子1，PCR扩增条件及程序如下所示PCR扩增的条件是12μ L反应体系， 包括0.25U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，6 μ L 2XBuffer (内含Mg2+、dNTPs 等，北京天根科技有限公司Mix)，0. 4 μ L的山羊基因组DNA样品，IOpmol/μ L的各引物的上、下游引物各0. 4 μ L和灭菌超纯水4. 7 μ L。
PCR反应程序如下⑴引物Pl的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性 30s，68°C退火30s，72°C延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
(2)引物P2的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s， 72°C延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
(3)引物P3的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，57°C退火30s， 72°C延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
(4)引物P的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C 延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
6、PCR产物纯化和测序PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1、 图2、图3和图4所示，可以清楚看到176bp、203bp、231bp和195bp的条带，说明目的基因片段扩增成功；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下(1)首先向吸附柱中加入 500 μ L平衡液BL，12000r/min离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60°C水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(5)向吸附柱中加入70(^1^票洗液，1200017/1^11离心11^11，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(6)向吸附柱中加入50(^1^票洗液，1200017/1^11离心11^11，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50°C温箱数分钟，彻底晾干。
(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心lmin收集DNA溶液。
(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步马聚7 ο 把以上以2个山羊群体DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序，对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰是发生了单核苷酸突变； PRLR基因内含子2 (Pl)在114bp出存在C — T的突变，外显子10 (P2) 319bp存在C — A的突变；LH β基因5' UTR(Ρ3)在153bp处存在C —A的突变，外显子1(Ρ4)在64bp处存在 T — C的突变。
B、利用引物Pl和P2扩增得到的山羊PRLR内含子2和外显子10以及利用引物 P3和P4扩增得到的LHi3基因5' UTR和外显子1的4个SNPs的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析利用引物Pl和P2分别对西农萨能奶山羊265份基因组DNA进行PCR扩增，获得265个包含山羊PRLR内含子2和外显子10的DNA片段；再利用引物P3和P4分别对西农萨能奶山羊265份基因组DNA进行PCR扩增，获得265个包含山羊LH β基因5' UTR和外显子1 的DNA片段，然后利用如下方法对每个山羊的PRLR内含子2和外显子10以及LHi3基因 5' UTR和外显子1进行基因分型，具体方法如下取引物P1、P2、P3和P4的PCR扩增产物各5 μ L，分别与5 μ L的变性缓冲液(95%的甲酰胺、0. 5mol/L的EDTA、0. 025%二甲苯青FF 和0. 025%的溴酚蓝)混合，95°C变性lOmin，然后迅速放入冰水混合物中作用lOmin，最后点样于10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液中，在4°C的条件下，280V电泳lOmin，之后210V 衡压条件下电泳4. 5h。电泳结束后，加入0. 的硝酸银溶液中，于摇床上轻摇lOmin，然后用蒸馏水洗涤凝胶2次，加入显色液(5g的Na0H、0. Ig的Na2CO3,加入0. 5mL甲醛，定容至250mL)，于摇床上轻摇15min，然后用蒸馏水洗涤凝胶2，拍照保存(图5、图6、图7和图 8)。
C、SNP位点的频率统计分析基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Paa = NAA/N，其中Paa代表某一位点的AA基因型频率；Naa表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量(表1和表2)。
D、山羊PRLR基因和LHi3基因效应的关联分析生产数据西农萨能奶山羊第1、2、 3和4胎的产羔数。
关联分析样本有完整产羔性状记录的西农萨能奶山羊265头。
关联分析模型利用SPSS(13. 0)软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用t分析、ANOVA或多元线性模型分析基因型效应。
在数据处理中，根据影产羔性状的因素不同，考虑到场效应(Farm)、品种效应(Bree d)、种公畜效应(S)、种公畜内母畜间效应(SD)、年龄(Age)、基因型效应(Genotype)及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下yuknmM = μ +Farmi+BreedJ+Sp+SDq+Agek+Genotypem +XJeijkim 其中…」! ^ 个体表型记录；U 总体均值；Farmi 场别效应；Breedj 品种效应；Sp 种公畜效应；SDq 种公畜内母畜间效应；Agek 年龄效应；Genotypem 标记基因型效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，如FarmXBreed，FarmXAge,
FarmXGenotype, BreedXAge, BreedXGenotype, AgeXGenotype, BreedXAgeXGenogype 等；eiAnmM 随机误差；运用SPSS (13. 0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间产羔数进行差异显著性检验。分析结果如表1和表2所示表1 西农萨能奶山羊PRLR基因Pl和P2不同基因型与产羔数的关联分析
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中不同小写字母表示差异显著(P <0.05)，下表同。
表2 西农萨能奶山羊LHi3基因P3和P4不同基因型与产羔数的关联分析
显示，采用引物Pl和P2扩增山羊PRLR基因内含子2和外显子10与西农萨能奶山羊的产羔性状显著相关，特别是GG和CC基因型个体产羔数显著高于其他基因型个体(P < 0. 05)； 同样，采用引物P4和P4扩增LHi3基因5'非翻译区(5‘ UTR)和外显子1与西农萨能奶山羊的产羔性状显著相关，特别是PP和LL基因型个体产羔数显著高于其他基因型个体(P <0.05)；因此，采用引物P1、P2、P3和P4检测SNP位点可用作山羊产羔性状选择的分子标记。
f、PRLR与LHi3基因的不同基因型组合对奶山羊产羔数的影响根据系谱信息，上溯亲代，跟踪子代，运用SPSS(13.0)软件分析，Fl代、亲代(F0代)和子代基因型组合与产羔数的关系如表3、表4和表5所示。
表3 :F1代西农萨能奶山羊基因型组合与产羔数的关系
表4F0代西农萨能奶山羊基因型组合与产羔数的关系
表5F2代西农萨能奶山羊基因型组合与产羔数的关系
表4和表5可知，高产个体的基因性组合为GGCCPPLL(F1代和F2代)、GGCCPQMM(F1代) 和GGCDPPLL(F1代)和GGCCQQLL(FO代)。不同基因型在多胎性状形成中的贡献率为，CC 基因型的聚合效应值比CD基因型的高14. 12%，匪基因型的聚合效应值比LM基因型的高 3. 8%,PP基因型的聚合效应值比QQ基因型的高15. 67%，LL基因型的聚合效应值比LM基因型的高11.48% ；PQ基因型的聚合效应值比QQ基因型的高11.02%，⑶基因型的聚合效应值比DD基因型的高10. 69%，因此，可根据高产个体的基因性组合以及不同基因型在多胎性状形成中的贡献率，分析高产个体基因型组合形成的选配方式，应用这些选配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
权利要求
1.一种良种奶山羊多基因聚合的选育方法，其特征在于，以连续产2羔及以上的奶山 羊基因组DNA为模板，在PCR条件下，利用4对引物PI、P2、P3和P4，分别扩增催乳素受体 基因和促黄体素beta亚基基因，其中所述的引物Pl如下上游引物 IF 5 ‘ -TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3 ‘； 下游引物 1R:5' -GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3 ‘； 所述的引物P2如下上游引物 2F 5 ‘ -CTTACCACAACATTGCTGACG-3 ‘； 下游引物 2R 5 ‘ -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3 ‘； 所述的引物P3如下上游引物 3F 5 ‘ -CTTACCACAACATTGCTGACG-3 ‘； 下游引物 3R 5 ‘ -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3 ‘； 所述的引物P4如下上游引物 4F 5 ‘ -CTTACCACAACATTGCTGACG-3 ‘； 下游引物 4R 5 ‘ -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3 ‘；引物Pl扩增催乳素受体基因内含子2，引物P2扩增催乳素受体基因外显子10，用于筛 查山羊催乳素受体基因位点的突变；引物P3扩增促黄体素beta亚基基因5'非翻译区，引物P4扩增促黄体素beta亚基基 因外显子1，用于筛查山羊促黄体素beta亚基基因位点的突变；根据琼脂糖凝胶电泳对4对引物扩增产物进行大小判定，然后采用DNA测序技术筛查 到催乳素受体基因内含子2和外显子10，以及促黄体素beta亚基基因5'非翻译区和外显 子1共有4个碱基的突变；再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对这4个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析 高产奶山羊个体多态性与产羔数的关系及不同基因型组合与产羔数之间的关系，并上溯亲 代，跟踪子代，检测母羊个体的基因型组合与产羔数的关系，分析不同基因型在多胎性状形 成中的贡献，挑选高产个体的基因型组合，分析高产个体基因型组合形成的选配方式，应用 这些选配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良种核心群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增的条件是(12 μ L反应体系包括0. 25U Taq DNA聚合酶，6 μ L 2 XBuffer，0. 4 μ L的山羊基因组 DNA样品，IOpmol/ μ L的各引物的上、下游引物各0. 4 μ L和灭菌超纯水4. 7 μ L ； PCR反应程序如下1)利用引物P1的PCR反应程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，68 V退火30s，72 °C 延伸30s，共进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；2)利用引物P2的PCR反应程序为95°C预变性5min，94 V变性30s，58 V退火30s，72 °C 延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；3)利用引物P3的PCR反应程序为95°C预变性5min，94 V变性30s，57 °C退火30s，72 °C 延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；4)利用引物P4的PCR反应程序为95°C预变性5min，94 V变性30s，60 V退火30s，72 °C 延伸30s，如此进行35个循环，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的催乳素受体基因内含子2在114bp存 在C — T的突变，外显子10在319bp存在C — A的突变；所述的黄体素beta亚基基因的 5'非翻译区在153bp存在C — A的突变，外显子1在64bp存在T — C的突变。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因分型是用10%聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测和分析引物PI、P2、P3和P4的PCR扩增产物，结果如下引物Pl位点纯合型GG在114bp位的碱基是C，杂合型GH在114bp位的碱基是T\C， 杂合型HH在114bp位的碱基是T ；引物P2位点纯合型CC在319bp位的碱基是C，杂合型⑶在319bp位的碱基是C\A， 杂合型DD在319bp位的碱基是A ；引物P3位点纯合型QQ在153bp位的碱基是A，杂合型PQ在153bp位的碱基是C\A， 纯合型PP在153bp位的碱基是CC ；引物P4位点纯合型匪在64bp位的碱基是C，杂合型LM在64bp位的碱基是T\C，纯 合型LL在64bp位的碱基是T。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高产个体的基因性组合为F1代和 F2 代GGCCPPLL ；Fl 代GGCCPQMM 和 GGCDPPLL ； FO 代GGCCQQLL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的不同基因型在多胎性状形成中的贡 献率为CC基因型的聚合效应值比⑶基因型的高14. 12% ； 匪基因型的聚合效应值比LM基因型的高3. 8% ； PP基因型的聚合效应值比QQ基因型的高15. 67% ； LL基因型的聚合效应值比LM基因型的高11.48% ； PQ基因型的聚合效应值比QQ基因型的高11.02%， ⑶基因型的聚合效应值比DD基因型的高10. 69%。
全文摘要
本发明公开了一种良种奶山羊多基因聚合的选育方法，以连续产2羔及以上的奶山羊基因组DNA为模板，利用4对引物分别扩增催乳素受体基因内含子2和外显子10，以及促黄体素beta亚基基因5′非翻译区(5′UTR)和外显子1，以琼脂糖凝胶电泳对各扩增产物进行大小判定，采用DNA测序技术筛查4对引物扩增产物的位点突变，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对催乳素受体基因和促黄体素beta亚基基因的4个位点的SNPs进行基因分型和基因频率分析，分析高产奶山羊个体(F1代)多态性与产羔数的关系及不同基因型组合与产羔数之间的关系，并上溯亲代(F0代)，跟踪子代(F2代)，检测母羊个体的基因型组合与产羔数的关系，分析不同基因型在多胎性状形成中的贡献。
文档编号C12Q1/68GK101845506SQ20101019948
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者曹斌云, 安小鹏, 李广, 侯金星, 王建刚, 宋宇轩, 杨明明, 朱广琴, 王韵斐, 崔易虹, 陈秋菊 申请人:西北农林科技大学