一种获得山羊mef2c基因新转录剪切体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种获得山羊基因新转录剪 切体的方法。
【背景技术】
[0002] 量F光基因D参与调控细胞增殖和肌肉分化的重要 调节因子，属于转录调节因子MADS-Box家族成员之一(该家族成员还包括：MCMI、AGAM0US、 DEFICIENS和SRF)。MEF2C基因是MEF2基因家族中，在骨骼肌中表达最早的基因，在细胞分 化过程必不可少，控制着肌细胞分化过程中的基因转录。MEF2转录因子的结构主要分为N 端和C端，其N端在不同物种中几乎相同，都含有一个MADS-box结构域和与其直接相邻的 MEF2结构域。
[0003] MADS-box是含有57个氨基酸的DNA结合区域，具有高度保守性，拥有一些不变的 残基，能与富含A/TDNA序列结合，并介导MADS-box因子的二聚化；MEF2结构域由MADS-box 临近的29个氨基酸组成，是MEF2因子所特有的结构域，其主要功能是有助于提高DNA结合 的亲和力和蛋白质的二聚化，同时也为MEF2与其它辅因子间相互作用提供场所。MEF2的 C末端是一个转录活性区，含有磷酸化位点，是多种激酶的靶点，与启动基因表达有关，是其 活性调节及发挥功能的主要区域，由Pre-mRNA选择性拼接形成不同的剪接体。由于该转录 活性区域由选择性拼接产生，因此，无论从它的基因结构或其蛋白质的形式都决定了MEF2C 功能上的复杂性。
[0004] 目前，NCBI记载的人MEF2C剪接体有6种，在猪发现2种剪接体，鸭2种剪接体。 目前在山羊上还未见有关MEF2C基因不同转录剪切体的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供山羊基因的新转录剪切体、其扩增引物及扩增方 法。
[0006] 本发明所述的山羊撒F光基因，有三种转录剪切体撒Fi^-AS1，撒FI-AS2和 撒Fi^-AS3,其核苷酸序列分别如SED ID N0. 1，SED ID N0. 2和SED ID N0. 3所示。
[0007] 本发明提供了用于扩增山羊基因的一组扩增引物： 正向引物MEF2C-F的核苷酸序列如SED ID N0. 4所示； 反向引物MEF2C-R的核苷酸序列如SED ID NO. 5所示。
[0008] 本发明还提供了一种扩增山羊撒FI基因，包括三种转录剪切体撒Fi^-AS1， MFi^-AS2和MFi^-AS3的方法，步骤如下： 步骤1 :提取山羊肌肉组织的总RNA ; 步骤2 :从近缘物种人，小鼠，牛和绵羊基因序列中分析保守序列，以此作为参考 来设计所述引物； 步骤3:以步骤1所得总RNA为模板，PCR扩增获得山羊基因的片段。
[0009] 对所得序列用NCBI网站进行blastn在线分析，与量序列一致性最高的序列 都是在哺乳动物中的同源序列，可以确定所得序列为山羊基因。
[0010] 利用ClustalxV2. 0软件对山羊撒F光基因（包括三种转录剪切体撒Fi^-ASl， 麗Fi^-AS2和麗FJ?C-AS3)的核苷酸序列进行比对分析并使用MEGA5. 2软件构建NJ树。
[0011] 本发明以山羊肌肉组织为材料，利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)，对山羊 基因进行了研究，首次从山羊肌肉组织中克隆得到了 基因三种转录剪切体 (iffiTHS1，和)，并对其同源性和进化地位进行了分析，对研究 山羊基因不同转录剪切体在肌肉生长发育过程中发挥的生物学功能具有重要意 义。
【附图说明】
[0012] 序列表SEQIDN0:1是本发明克隆的山羊#你况'基因的转录剪切体1序列片 段。
[0013] 序列表SEQIDN0 :2是本发明克隆的山羊#你况'基因的转录剪切体2序列片 段。
[0014] 序列表SEQIDN0 :3是本发明克隆的山羊#你况'基因的转录剪切体3序列片 段。
[0015] 图1:山羊MFI基因不同转录剪切体PCR产物电泳检测图。
[0016] 图2:山羊基因不同转录剪切的示意图。
[0017] 图3:近缘哺乳动物基因编码区序列的NJ系统进化树。 具体实施方案
[0018] 以下结合附图，通过实施例对本发明进一步详细说明。
[0019] 本发明中山羊采自四川省南江黄羊育种场，RNA提取纯化等试剂购自Invitrogen 公司，PCR试剂购自宝生物(大连）有限公司（Takara)。
[0020] 总RNA提取：取100mg山羊肌肉组织在研钵中加液氮研磨，用Trizol法提取总 RNA，Trizol试剂购自Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。
[0021] 山羊量基因序列的克隆，包括三个转录剪切体量72C-AS1，量72C-AS2和 MEF2C-KS3： 通过比对已公开的近缘哺乳动物(人、小鼠、牛和绵羊）的基因序列得到保守区， 在保守区序列设计引物扩增山羊基因。
[0022] 山羊量基因的克隆： 使用正向外引物MEF2C-F与反向外引物MEF2C-R进行PCR扩增，获得山羊撒基因 的目的片段； MEF2C-F:5' -TTACGAGGATTATGGATGAACG-3' MEF2C-R:5'-GGGGTGGTGGTACGGTCT-3' 扩增反应体系如下：
【主权项】
1. 作为山羊MEF2C基因的转录剪切体，它们的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1，SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 所述。
2. 根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于：其中SEQ ID NO :1片段完全缺失第 四外显子序列；；SEQ ID NO :2片段完全缺失第三外显子序列；SEQ ID NO :3完全缺失第三 和第四外显子序列。
3. 检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物的DNA序列如下所示： MEF2C-F :5'- TTACGAGGATTATGGATGAACG-3' MEF2C-R:5'-GGGGTGGTGGTACGGTCT-3'。
4. 制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤： 利用NCBI数据库信息，比对人、小鼠、牛和猪MEF2C基因得到保守区，在保守区设计引 物扩增山羊基因，提取山羊肌肉组织RNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序， 获得如序列表SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所述的核苷酸序列。
【专利摘要】本发明属于家畜基因工程技术领域，公开了一种获得山羊MEF2C基因三种转录剪切体的方法。首先从南江黄羊肌肉组织中分离出核糖核酸；设计特定的引物，利用PCR扩增出cDNA片段。经过克隆和测序分析证实了在山羊MEF2C基因转录过程中存在3种剪切形式，包含外显子的缺失。这一发现为研究山羊MEF2C基因的表达及功能究奠定了重要基础。
【IPC分类】C12N15-10, C12N15-12, C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104593375
【申请号】CN201310529631
【发明人】沈并兵, 占思远, 李利, 张红平, 王林杰, 仲涛
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2013年11月1日