专利名称：枯草芽孢杆菌菌株yb-81、菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害生物防治领域，具体地说涉及一种能够防治多种植物病害的 枯草芽孢杆菌，以及利用该菌株生产的微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(FAO)统计每年因植物遭受病害 造成的减产平均损失为总产量的10% 15%。随着人们对无污染、无公害绿色食品呼声日 益提高，生物防治已经成为植物病害防治的研究热点，它在生产方式、食品安全、营养健康、 生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。近年来，人们逐渐认识到革兰氏阳性菌在生物防治中的重要作用。特别是芽孢杆 菌(Bacillus spp.)，种类繁多，资源丰富，芽孢的形成使得它们的适应性和抗逆能力强，易 于工业化生产和贮藏，其中的一些菌株可以产生杆菌肽、大环脂、环脂和类噬菌体颗粒等十 几种抗菌物质，应用于生产潜力大。同时，芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌，可以形成细胞壁 不含内毒素，除个别种外绝大多数对人畜无毒，因此具有很强的环境适应性和环境友好性。随着人类对生态环境的进一步重视以及农业可持续性发展的需要，生物防治技术 势必将进一步发展，特别是现代生物技术的应用必然会开拓生防科技的新领域。微生物农 药的研究和应用在新世纪之初迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战，产业发展前景十 分广阔。因此，微生物农药在未来的10 20年里将迅速发展，在保护环境、保证人类健康， 在促进农业可持续发展进程中发挥愈来愈重要的作用。
发明内容
本发明旨在为多种植物病害提供一种可用于生物防治的具有高效、广谱杀菌活性 的枯草芽孢杆菌菌株，以及利用这种枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂及其制备方法，还提 供了这种枯草芽孢杆菌在植物病害防治上的用途。技术方案一种枯草芽孢杆菌菌株YB-81 (Bacillus subtilts YB-81)，保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3195。一种微生物菌剂，其活性成分是所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81 CGMCCNo.3195及胞 外代谢物。上述的微生物菌剂为液态。一种所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤(1)菌株培养与制备将枯草芽孢杆菌YB-81 CGMCC No. 3195接种到TSA试管斜 面培养基上，28 35°C下培养24 36小时获得菌种；(2)种子液制备将步骤(1)制备的试管菌种接入TSB培养液内，在28 32°C下 震荡12 16小时制成种子液；(3)发酵培养基制备分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加入水配制成重量百分比为葡萄糖1. 2%、玉米粉1. 8%、黄豆饼3%、磷酸氢二钾0. 2%的培养基；(4)液体发酵生产对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按体积分5%的接种 量接种于步骤(3)配好的培养基，控制发酵设备旋转，在27 34°C下发酵培养36 48小 时，随后收集发酵液即得菌剂。上述制备方法中步骤(1)中所述的TSA平板培养基组成成分及重量百分比为胰 蛋白胨1. 7%，大豆蛋白胨0. 3%, NaClO. 5%, KH2PO4O. 25%，葡萄糖0. 25%，琼脂1. 5%，其 余为水。上述制备方法中步骤(2)中所述的TSB液体培养基组成成分及重量百分比为胰 蛋白胨1. 7%，大豆蛋白胨0.3%，NaClO. 5%，KH2PO4O. 25%，葡萄糖0.25%，其余为水。步骤(4)中的发酵设备的转速为180rpm。步骤(4)中发酵设备内液体PH为8. O。步骤⑷中的发酵培养温度为28 30°C。步骤⑷中发酵培养时间最好为40小时。所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81的用途，用于抑制番茄灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、小 麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、苹果褐斑病菌、山药炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、 辣椒枯萎病菌、芝麻枯萎病菌、黄瓜疫病菌、棉花红腐病菌。所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81防治黄瓜灰霉病上的用途。所述微生物菌剂在防治黄瓜灰霉病上的用途。所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81在防治小麦白粉病上的用途。所述微生物菌剂在防治小麦白粉病上的用途。本发明菌剂的使用方法上述微生物菌剂用水稀释后通过常规的灌根、浸种、喷雾 等方法施用。可单独使用，也可以与对本生防菌株无副作用的其它杀菌剂、植物调节剂混合 使用。一般在作物播种期或病害始发期施用，方法是播种前，采用发酵制剂与种子拌种；或 在病害始发期，通过灌根施入作物根际或通过叶面喷雾，花蕾和果实表面喷雾施用。本发明的有益效果本发明的YB-81菌株及其菌剂抑菌谱广、抑菌效果好，对番茄灰霉病菌、小麦纹枯 病菌、小麦全蚀病菌、苹果褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌和辣椒枯萎病菌等有较强的抑制作用； 该菌剂可用于番茄灰霉病、小麦白粉病的防治，高效无毒、使用简单、不造成环境污染。通过 实验，对黄瓜灰霉病菌的抑菌率达到92. 4%，对小麦全蚀病菌和小麦纹枯病菌的抑菌率分 别达到90. 2%和89. 6%。它对12种病原真菌的抑菌带在5. 5mm 14mm之间，表现出较为 广谱的抑菌效果。
四
图 1 是 YB-81 16SrDNA 基因 PCR 扩增图；图2是YB-81菌株16SrDNA序列系统发育树。
五具体实施例方式实施例一YB-81菌株的分离筛选供试病原真菌小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporium)，番爺灰霉病菌(Botrytis cirerea)，梨黑星病菌(Venturianashicola), 小麦全烛病菌(Gaeumannomyces grami)，黄瓜疫病菌(Phytophthoramelonis)，苹果褐 斑病菌(Marssonina coronaria)，芝麻枯萎病菌(Fusariumoxysporum)，小麦全烛病菌 (Gaeumannomyces raminis)，山药炭疽病菌(Colletotrid umgloeosporiodes)，小麦纹枯 病菌(Rhizocto-nia cerealis)，棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)。细菌培养基NA培养基牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15g，水1L， ρΗ6· 8 7. 0，121 °C 高压灭菌 30min。LB液体培养基蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，水1L，pH7. 0，121°C高压灭菌 30mino土壤中芽孢杆菌的分离与纯化将采来的土样阴干、研磨后，称取5g，放入150ml 盛有45ml生理盐水的三角瓶中，摇动3-5min，在80°C水浴中加热lOmin，杀灭不产芽孢的 细菌和其他菌类。采用土壤稀释分离法，吸取ImL的稀释液加入到含有9mL水的试管中，振 荡混勻，制得10_2 土壤稀释液；按照上述方法分别制取10_3、10_4、10_5 土壤稀释液。分别取 10_3、10_4、10_5 土壤稀释液0. 05mL涂布于肉汁胨培养基平板上。倒置在28°C的恒温培养箱 中培养48h。挑取单菌落，镜检，采用划线分离的方法纯化，将已纯化的菌株保存于NA培养 基斜面备用。拮抗菌的初步筛选对分离纯化到的芽孢杆菌，以供试病原真菌为靶标，采用平板 对峙培养法，用皿内琼胶平板直接测定。具体方法为将保存的菌株活化，在PDA平板中心 先接种病原菌，1 2天后在四周接种待测的芽孢杆菌菌株，28°C培养一定时间，观察其抑 菌效果，并测量抑菌带大小，选择拮抗性好的菌株进入复筛。拮抗菌株复筛(1)无菌发酵滤液制备将拮抗菌株接种LB培养液中，30°C摇床恒温培养24h，收 集发酵液，用滤纸过滤后在4200r/min下离心lOmin，取上清液，经0. 22 μ m滤膜过滤去菌体 即得无菌发酵滤液。(2)生长速率法测定颉颃性取发酵滤液2ml于灭菌培养皿中，然后将热的PDA培 养基18ml注入皿中与其混合均勻，待平板冷凝后，中央接种靶标病原菌，分别以加入无菌 水和不接菌的LB培养液的PDA平板为对照，28°C恒温培养3_5d后测量菌落直径，计算抑制率。菌落直径(mm)=相垂直的两直径平均值-菌饼直径
抑制率)二誦落直径一处理菌落紐测 对照菌落直径一菌饼直径本实施例通过初步筛选得到18个芽孢杆菌菌株，进一步复筛获得8个抑菌效果较 好的菌株，对这些效果较好的拮抗菌株以黄瓜灰霉病菌等为指示菌进一步做拮抗试验，筛 选出对其具有很好防治效果的YB-81菌株。表1为YB-81菌株对各病原菌的抑菌效果。表1YB-81菌株对各病原菌的抑菌效果(％ )
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌菌株YB-81 (Bacillus subtilts YB-81)，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3195。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，活性成分是权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81 CGMCC No. 3195及胞外代谢物。
3.—种权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)菌株培养与制备将枯草芽孢杆菌YB-81CGMCC No. 3195接种到TSA试管斜面培 养基上，28 35°C下培养24 36小时获得菌种；(2)种子液制备将步骤(1)制备的试管菌种接入TSB培养液内，在28 32°C下震荡 12 16小时制成种子液；(3)发酵培养基制备分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加入水配制成重 量百分比为葡萄糖1. 2%、玉米粉1. 8%、黄豆饼3%、磷酸氢二钾0. 2%的培养基；(4)液体发酵生产对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按体积分5%的接种量接 种于步骤(3)配好的培养基，控制发酵设备旋转，在27 34°C下发酵培养36 48小时，随 后收集发酵液即得菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的发酵设备的转速为 180rpmo
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中发酵设备内液体PH为8. 0。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的发酵培养温度为28 30 "C。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中发酵培养时间为40小时。
8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81的用途，其特征在于，用于抑制番茄灰霉病 菌、黄瓜灰霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、苹果褐斑病菌、山药炭疽 病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、芝麻枯萎病菌、黄瓜疫病菌、棉花红腐病菌。
9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81或权利要求2所述微生物菌剂在防治黄瓜 灰霉病上的用途。
10.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81或权利要求2所述微生物菌剂在防治小 麦白粉病上的用途。
全文摘要
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株YB-81、菌剂及其制备方法和应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3195。所述微生物菌剂利用枯草芽孢杆菌YB-81菌株发酵液制备而成。本发明的YB-81菌株及其菌剂抑菌谱广、抑菌效果好，对番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、苹果褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌和辣椒枯萎病菌等有较强的抑制作用；该菌剂可用于番茄灰霉病、小麦白粉病的防治，高效无毒、使用简单、不造成环境污染。
文档编号C12R1/125GK101993836SQ201010199739
公开日2011年3月30日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者全鑫, 刘明源, 孙虎, 杨丽荣, 武超, 薛保国 申请人:河南省农业科学院