专利名称：一种发光细菌生物敏感元件及其制备方法和保存方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水质急性毒性的发光细菌生物敏感元件及其制备方法和保 存方法，属于环境监测领域。
背景技术：
近年来，突发性环境污染事故呈增加趋势，这直接威胁了国家的生态安全和人体 健康，目前控制水体中毒性的方法主要是对特定的有毒化学物质进行单个指标控制，通过 对控制项目检测结果的判定来推断待检样品中是否有毒性。但对水体中可能存在多种对人 体有害或有潜在致病风险的化合物，在事故发生后短时间内利用化学分析确定其组分并判 断是否有害是不现实的。为了加强河水以及饮用水源的保护、工业废水排放等的预警和管 理，国际上纷纷出台相关规定，要求实现水质的连续毒性控制。但是传统的毒性试验都因时 间长、费用高，操作繁琐，不适宜突发环境事件的预警。因此急需一种快速、简便、经济的检 测方法以便给决策者提供参考。在实践应用中，水的毒性效应是一项综合的生物学参数，目 前已使用的对水毒性的测试的生物学方法包括发光细菌法、浮游动物试验、藻类试验和鱼 类试验等。这其中，发光细菌检测法具有快速、简便的特点，同时又有很好的灵敏度的独特 优势。发光作用是发光细菌正常生理状态下所具有的性质，当细胞活性受到毒性物质作 用后，其活性将受到抑制，从而使呼吸速率下降，进而导致发光降低，样品的毒性越强，发光 细菌的光损失越多，以细菌发光法测定样品的生物毒性已经被证明是一种可靠的生物传感 方法。该方法已经被加拿大、德国和美国等国家所接受，并被列入德国国家标准，EPA标准和 国际标准，在我国也已经采用了发光菌进行急性毒性测试的国家标准方法。发光细菌的急 性毒性测试可以在15min内完成，能够满足对水体中毒性变化的快速检测，并且该方法对 1000多种毒性物质的化学品敏感，包括重金属、杀虫剂、农药和工业化学试剂等多种相关物 质。国外从20世纪60年代中期开始研究使用发光细菌检测环境，80年代美国的SDI 公司研制了 Microtox检验技术的相关仪器和试剂，在我国直到90年代中期才颁布发光细 菌毒性检测方法(GT/T15441-1995)。但它们在测量中需要配制一系列的空白液和标准液， 操作过程复杂、耗时、繁琐，只能在实验室里检测，而不能用于现场连续原位自动化检测，极 大地削弱了该方法的应用。所以国内外的研究人员利用发光菌毒性检测在水环境监测上的 优势研制了不同的发光菌传感器用于现场连续原位自动化检测，如TOXcontrol在线毒性 监测采用将低温保存的发光菌菌液复苏后作为检测液，这就难免会额外增加辅助设备，提 高运营成本，还会遇到发光菌发光不稳而出现假阳性得情况。近些年有发展了发光菌固定 化技术，比如美国的oak Ridge国家实验室和Tennessee大学联合研制了基于生物发光的 毒性检测芯片，将琼脂固定的菌膜与电路结合检测；以色列和韩国的研究者则采用光纤探 头的结构，把发光细菌固定于裸光纤顶端，或将发光细菌固定于连接光纤的套管中。国内一 些研究中将发光细菌吸附固定于混合纤维膜上，敏感膜与硅光二极管直接相连从而进行光的检测和光电转换。但是要运用起来面临几个问题发光细菌世代很短，不能保证其长期稳 定的发光；插入凝胶里的光纤探头检测时感光性较差不能使毒性响应的生物发光与环境中 的光之间的相互影响最小化；对于缺少预处理的样品的检测会遇到很大的麻烦；不能重复 利用等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可重复利用的发光细菌生物敏感元件，可 作为生物综合毒性在线连续监测的敏感元件。本发明还要解决的技术问题是提供上述发光细菌生物敏感元件的制备方法。本发明最后要解决的技术问题是提供上述发光细菌生物敏感元件的保存方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种发光细菌生物敏感元件，它由如下方法制备得到将发光细菌菌悬液与海藻 酸钠溶液混合均勻，将混合液逐滴滴入到氯化钙溶液中，固化。上述发光细菌生物敏感元件的制备方法，包括如下步骤(1)将斜面发光细菌菌种接种到ASW培养基中培养15 18小时，培养温度为18 22°C，转速为 180 250r/min ；(2)取步骤(1)制得的菌悬液，进行稀释至光密度为0. 1 0. 6，将稀释液加入已 灭菌的冷却的海藻酸钠溶液中，在18 22°C下混合均勻；(3)将步骤(3)制得的混合液，用注射器逐滴滴入氯化钙溶液中，然后固化4 6 小时，用蒸馏水清洗，即得。步骤(2)中，优选的条件是，菌悬液，进行稀释至光密度为0. 1 0. 2。步骤(2)中，所述的海藻酸钠溶液的浓度为40 80g/L，优选40 50g/L。步骤(2)中，所述稀释液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1 1 10，优选 1 1 2。步骤(3)中，所述的氯化钙溶液的浓度为20 30g/L，优选20 23g/L。步骤(3)中，所述混合液与所述氯化钙溶液的体积比为2 3 100。上述发光细菌生物敏感元件的保存方法，将发光细菌生物敏感元件在4°C条件下 保存于储液中，所述储液为含有30 40g/L NaCl和0. 5 lg/L CaCl2的水溶液。有益效果本发明的创新之处在于将发光细菌包埋与凝胶小球中，增大接触的比 表面积，以达到重复利用，稳定发光，连续监测的作用。与现有技术相比，本发明所制得的在 线连续监测水质急性毒性发光细菌生物敏感元件可以实现连续的在线培养，以达到长期的 稳定的发光，体积小比表面积大接触样本充分，避免了光纤探头与敏感元件的接触，感光性 能好，对于只需过滤的操作，免除了过多的预处理步骤，还可以实现7天左右的连续重复使 用，保存起来也比较方便。本发明同时具有实验操作简单、生产成本更加低廉等多种优势， 更适合于工业化生产和实际的环境监测应用。
图1是本发明的发光细菌生物敏感元件外貌图。图2是本发明的发光细菌生物敏感元件的发光情况图。
图3是本发明的发光细菌生物敏感元件的发光强度变化图。图4是本发明的发光细菌生物敏感元件所适用装置的结构示意图。图5是本发明的发光细菌生物敏感元件对硫酸锌的毒性响应图。图6是本发明的发光细菌生物敏感元件对苯酚的毒性响应图。图7是本发明的发光细菌生物敏感元件重现性实验。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。实施例1 将斜面发光细菌菌种接种到ASW液体培养基中培养16小时左右，培养温度为 20°C，转速为200r/min ；取上述菌悬液，进行50倍的稀释，光密度在0. 1左右，将稀释液加 入已灭菌的冷却的40g/L海藻酸钠溶液中，稀释液与海藻酸钠溶液的体积比为1 1，在 20°C充分混勻；将上述混合液用注射器逐滴滴入20g/L氯化钙溶液中，然后固化4小时， 混合液与氯化钙溶液的体积比为2%，用蒸馏水清洗后浸泡于含有30g/L NaCl和0. 5g/L CaCl2的水溶液中，放在4°C储存备用。所制得的敏感元件的外貌如图1所示，发光情况如 图2所示。在不同的时间测量上述制备的发光细菌生物敏感元件的发光强度，其效果如图 3所示。实施例2:将斜面发光细菌菌种接种到ASW液体培养基中培养15小时左右，培养温度为 22°C，转速为250r/min ；取上述菌悬液，进行稀释至光密度为0. 3左右，将稀释液加入已灭 菌的冷却的60g/L海藻酸钠溶液中，稀释液与海藻酸钠溶液的体积比为1 5，在18°C充分 混勻；将上述混合液用注射器逐滴滴入25g/L氯化钙溶液中，然后固化5小时，混合液与氯 化钙溶液的体积比为2%，用蒸馏水清洗后浸泡于含有40g/L NaCl和lg/L CaCl2的水溶液 中，放在4°C储存备用。实施例3 将斜面发光细菌菌种接种到ASW液体培养基中培养18小时左右，培养温度为 18°C，转速为180r/min ；取上述菌悬液，进行稀释至光密度为0. 6左右，将稀释液加入已灭 菌的冷却的80g/L海藻酸钠溶液中，稀释液与海藻酸钠溶液的体积比为1 10，在22°C充 分混勻；将上述混合液用注射器逐滴滴入30g/L氯化钙溶液中，然后固化6小时，混合液与 氯化钙溶液的体积比为3%，用蒸馏水清洗后浸泡于含有35g/L NaCl和0. 5g/LCaCl2的水 溶液中，放在4°C储存备用。实施例4 在线连续监测水质急性毒性设备。如图4所示，在线连续监测水质急性毒性设备包括发光细菌连续培养系统、加样 系统、排液系统、程序控制系统、光电检测系统、数据处理与传输系统和数据显示系统。发光 细菌连续培养系统由营养液储备瓶1、储液槽2、泵7、反应试管8和软管组成；营养液储备 瓶1(营养液储备瓶1内装有发光细菌的营养液)倒置放置通过软管与储液槽2相连通，储 液槽2通过软管与反应试管8相连通，并由泵7控制储液槽2向反应试管8的营养液流加速度，反应试管8置于可开合的暗室内。加样系统由样本槽3、泵6和软管组成，样本槽3通 过软管与发光细菌连续培养系统中的反应试管8相连通，并由泵6控制样本向反应试管8 的流加速度，插入反应试管8中的软管要接近反应试管8的底部。排液系统由废液槽4、泵 5和软管组成，废液槽4通过软管与发光细菌连续培养系统中的反应试管8相连通，并由泵 5控制反应试管8中检测完毕后的废液向废液槽4的排放速度，插入反应试管8中的软管要 接近反应试管8的底部。光电检测系统设置在反应试管8底部。数据处理与传输系统通过 线路与光电检测系统连接，自动计算相对发光强度，并将数据存储在SD卡中，数据结果在 数据显示系统里显示，例如加入试剂、样本、5分钟、10分钟、15分钟的发光强度和相对发光 强度。发光细菌连续培养系统、加样系统、排液系统、光电检测系统、数据处理与传输系统和 数据显示系统都是由程序控制系统控制实现全自动操作。使用时，向反应试管内放入3 5粒用本发明方法制备的发光细菌生物敏感元件 11，加入少量营养液、再加入样本，5分钟、10分钟和15分钟分别采集数据，检测结束后，将 反应试管内的废液排入废液槽。发光细菌生物敏感元件继续保留在试管中重复检测，一般 连续监测7 10天后，更换新的发光细菌生物敏感元件。实施例5 在线连续监测水质急性毒性发光细菌生物敏感元件对毒性物质的响应。采用实施例1制备的发光细菌生物敏感元件进行如下实验。重金属污染物以硫酸锌为典型代表，如附图5所示的是0. 5mg/L、1. 25mg/L、 2. 5mg/L、3. 75mg/L、5mg/L、8. 75mg/L、12. 5mg/L的硫酸锌毒性检测以及相对发光强度曲 线，在未加入水样时，各曲线变化不大，当加入水样后各曲线明显下降，这表明发光细菌凝 胶小球的发光强度与毒物浓度呈良好的线性关系，由抑制曲线计算出苯酚的半数抑光率为 4. 75mg/L。同样有机污染物以苯酚为例，其效果如图6所示，得出其半数抑光率为160mg/L。实施例6 发光细菌生物敏感元件的重现性实验用蒸馏水作为样本进行了 7天的测试，测试的参数为35 y L营养液，315uL样本， 时间间隔为2分钟，反应时间15分钟，连续自动加样排液，测试的效果如图7所示。说明在 连续测试的过程中小球能够连续运行一周的时间而不发生解体，并且发光值也稳定在一个 很好的范围内，随着测试时间的延长，会发生自身的衰减从而使抑光率逐渐上升，但是不影 响测试的进行。
权利要求
一种发光细菌生物敏感元件，其特征在于它由如下方法制备得到将发光细菌菌悬液与海藻酸钠溶液混合均匀，将混合液逐滴滴入到氯化钙溶液中，固化。
2.权利要求1所述的发光细菌生物敏感元件的制备方法，其特征在于它包括如下步骤(1)将斜面发光细菌菌种接种到ASW培养基中培养15 18小时，培养温度为18 22°C，转速为 180 250r/min ；(2)取步骤(1)制得的菌悬液，进行稀释至光密度为0.1 0. 6，将稀释液加入已灭菌 的冷却的海藻酸钠溶液中，在18 22°C下混合均勻；(3)将步骤(3)制得的混合液，用注射器逐滴滴入氯化钙溶液中，然后固化4 6小时， 用蒸馏水清洗，即得。
3.根据权利要求2所述的发光细菌生物敏感元件的制备方法，其特征在于步骤(2)中， 菌悬液，进行稀释至光密度为0. 1 0. 2。
4.根据权利要求2所述的发光细菌生物敏感元件的制备方法，其特征在于步骤(2)中， 所述的海藻酸钠溶液的浓度为40 80g/L。
5.根据权利要求2或4所述的发光细菌生物敏感元件的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述稀释液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1 1 10。
6.根据权利要求2所述的发光细菌生物敏感元件的制备方法，其特征在于步骤(3)中， 所述的氯化钙溶液的浓度为20 30g/L。
7.根据权利要求2或6所述的发光细菌生物敏感元件的制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述混合液与所述氯化钙溶液的体积比为2 3 100。
8.权利要求1所述的发光细菌生物敏感元件的保存方法，其特征在于将发光细菌生物 敏感元件在4°C条件下保存于储液中，所述储液为含有30 40g/L NaCl和0. 5 IgAXaCl2 的水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种发光细菌生物敏感元件，它由如下方法制备得到将发光细菌菌悬液与海藻酸钠溶液混合均匀，将混合液逐滴滴入到氯化钙溶液中，固化。本发明还公开了上述发光细菌生物敏感元件的具体制备方法和保存方法。本发明将发光细菌包埋与凝胶小球中，增大接触的比表面积，以达到重复利用，稳定发光，连续监测的作用。本发明所制得的在线连续监测水质急性毒性发光细菌生物敏感元件可以实现连续的在线培养，以达到长期的稳定的发光，体积小比表面积大接触样本充分，避免了光纤探头与敏感元件的接触，感光性能好，对于只需过滤的操作，免除了过多的预处理步骤，还可以实现15天左右的连续重复使用，保存起来也比较方便。
文档编号C12R1/01GK101892215SQ201010200078
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者孙旭, 曹妮妮, 杨柳燕, 肖 琳 申请人:南京大学;深圳市朗石生物仪器有限公司