专利名称：一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株阪崎肠杆菌新菌株，尤其涉及一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆 菌新菌株。
背景技术：
奶粉为生活中常用的食品，特别是婴幼儿对乳粉的需求量大，乳粉质量不佳直接 影响到婴幼儿身体健康，2003年1月9日，美国美赞臣公司向美国食品及药品管理局(FDA) 报告要求回收在美国生产的一批罐装早产儿特殊配方乳粉，回收原因是在该批产品中检验 出极微量的阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)。此后，“问题乳粉”事件迅速引起世界 广泛关注，污染源阪崎肠杆菌也成为焦点目标。阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)为 肠杆菌科、肠杆菌属，有周鞭毛、能运动的无芽孢G-短小杆菌。阪崎肠杆菌最初以婴儿配方 乳粉作为传播媒介，导致新生儿出现脑膜炎、败血病、小肠结肠炎坏死等症状。致死率可高 达80%。美国食品药品管理局(FDA)于2002年提出在婴幼儿配方乳粉中检测阪崎肠杆菌， 随着对阪崎肠杆菌检测的重视，国家质量监督检验检疫总局要求企业生产的每批次婴幼儿 配方乳粉出厂前都要进行自检，做到对阪崎肠杆菌检测工作日常化。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株。在阪崎肠杆 菌分类上具有较大的价值。本发明是这样来实现的，其特征是命名为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年04月06日，保藏编号CGMCCNo. 3724。提取方法为(1)用预热45°C缓冲蛋白胨水500ml与IOOg乳粉摇勻，36°C 士 1°C培养18_24h ；(2)移取上述培养液IOml加于90ml肠道菌增菌肉汤中36°C 士 1°C培养18_22h ；(3)取肠道菌增菌肉汤培养物一环划线接种伊红美蓝、山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂 平板各1块，36°C 士 1°C培养18-24h ；(4)观察菌落形态，从山梨醇麦康凯平板上挑取不发酵山梨醇的单个菌落接种4 支 TSA 钭面、36 °C 士 1°C 培养 18-24h ；(5)用钭面做触酶、氧化酶、G染色、进一步生化鉴定。本发明的优点是1、卫矛醇阳性，2、苦可仁甙阴性，3、明胶酶阳性，4、乳糖为迟缓 发酵(72h)。
具体实施例方式本发明是这样实现的1、材料与方法
材料菌种来源阪崎肠杆菌标准株ATCC29544、ATCC29004、CMCC45401由中国药品生物 制品检定所提供。0819-041、0814-179、090830、091006、100309、100412 菌株由本中心分离， 0819-041是本发明中阪崎肠杆菌新菌株的代号，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会 普通微生物中心，专利保藏日期为2010年04月06日，保藏编号CGMCC No. 3724。培养基缓冲蛋白胨水(BP)、肠道菌增菌肉汤(EE)、改良月桂基硫酸盐胰蛋 白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)、伊红美蓝(EMB)、麦康凯(MacConKey)、山梨醇麦康凯 (SorbitolMacConKey)，营养琼脂(NutirentAgar)为杭州天和微生物试剂有限公司生产。 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)，显色培养基(Xa-GicA)由北京陆桥公司生产。微量生化管杭州天和微生物试剂有限公司生产，部分为自配。所用培养基经实验 室生物学质控考核，符合微生物生长需要。统计学处理实验数据统计处理采用SPSS11. 5软件进行。2.方法2. 1检测方法基础研究2. 1. 1.两种修复培养基(BP、蒸馏水)比较研究(1)取2_8°C冰箱保存3个月(休眠期)阪崎肠杆菌斜面直接制备菌悬液，从 KT1-IO-9作连续10倍稀释，同时取ICT9-IO-1O. Iml涂布平板各2块，36°C 士 1°C培养18_24h， 菌落计数。(2)取上述菌悬液从KT9-IiT1分别取0. Iml加入A组9ml含10%婴儿配方乳粉 蒸馏水管中；B组9ml含10%婴儿配方乳粉BP培养液中、置36°C 士 1°C 18_24h培养。(3)取上述A、B培养液9ml移入90mlEE增菌肉汤中，于36°C 士 1°C培养18_24h， 划线接种 EMB、MacConKey、SorbitoIMacConKey、VRBGA, Xa-GicA 琼脂平板、36°C 士 1°C培养 18-24h观察结果并记录(试验重复3次)。2. 1. 1.两种肠道增菌培养基(mLST-Vm、EE)的比较研究(1)取18_24h培养的阪崎肠杆菌新鲜斜面制备菌悬液。用无菌生理盐水从10-1-10-9作连续10倍稀释，同时取10-9-10-10. Iml涂布平 板各2块，360C 士 1°C培养18-24h，菌落计数。(2)取上述菌悬液从IiT9-IO-1分别取0. Iml加入9ml mLST-Vm肉汤与9mlEE肉汤 管中、置36°C 士 1°C培养18-24h，观察结果并记录(试验重复3次)。2. 1. 3阪崎肠杆菌在5种分离培养基上生物学特征及生长情况比较(1)取18_24h培养的阪崎肠杆菌新鲜斜面制备菌悬液。(2)用无菌生理盐水从KT1-IO-9作连续10倍稀释，取10-4、10_5、10-6分别取0. Iml 涂布 NutirentAgar, EMB, MacConKey、SorbitoIMacConKey、VRBGA, Xa-GicA 琼脂平板， 于36 °C 士 1°C培养18-24h进行比较(试验重复3次)。2. 2检测方法应用2. 2. 1样品检测分离鉴定共分4个步骤(1)样品修复培养(前增菌)无菌称取IOOg乳粉加入500ml预热45°C BP中，混 勻，经 36°C 士 1°C培养 18-24h。(2)样品肠道增菌培养移取IOml加入90mlEE肉汤中，于36°C 士 1°C培养18_24h。菌株号
ATCC29544++ — —-+ --+-+++++十++ -++ATCC29004++ ---+ --+-++++++++ 一++CMCC45401++ ---+ ---+-++++++++ 一++(3)样品分呙培养取EE增菌肉汤培养物1环，分别划线接种EMB、MacConKey, SorbitolMacConKey 琼脂平板各 1 块，置 36°C 士 1°C培养 18_24h。(4)菌株生化鉴定挑取单个可疑菌落接种TSA钭面，生化鉴定。2. 2. 3 0819-041菌株急性毒性试验用灭菌营养肉汤制备菌悬液，培养6h，菌液浓度为104_105/ml。接种昆明小鼠体重 17g-19g。每组3只，实验组腹腔注射菌悬液0. 5ml，同时设对照组注射灭菌营养肉汤0. 5ml。 观察小白鼠中毒症状，如有死亡进行解剖观察(江西省职业病防治研究院为CNAS认可实验室)。2. 2. 4 0819-041菌株感染动物组织病理学切片检测取死亡小鼠组织以10%甲醛固定后，再经石蜡包埋，切片后用苏木素-伊红染色， 镜检病理变化(江西省职业病防治研究院为CNAS认可实验室)。2. 2. 5三种方法检测阪崎肠杆菌的应用比较应用本研究方法与SN/T1632. 1-2005行业标准、GB/T4789. 40-2008国家标准，对 2008年市场抽检的39件婴幼儿配方乳粉，2009年市场抽检的23件婴幼儿配方乳粉，2010 年1月_5月市场抽检17件婴幼儿配方乳粉，同时检测进行比较，以评价本研究方法的准确性。3.结果3. 1应用研究结果3. 1. 1阪崎肠杆菌在自选的3种肠道分离培养基上生物学特性我们分离的阪崎肠杆菌在EMB琼脂平板上呈紫红色粘液状，菌落较大，相邻菌落 之间易于融合。在MacConKey琼脂平板上大小2_3mm，呈淡粉色。在SorbitolMacConKey琼 脂平板上不发酵山梨醇，形成中等大小、圆形突起、边缘整齐的淡黄色菌落。3. 1. 2阪崎肠杆菌形态与染色革兰氏染色镜检为G-无芽孢短小杆菌，呈球杆状 或成对排列，有时亦可呈短链状。3. 1. 3阪崎肠杆菌生化特性菌株触酶阳性、氧化酶阴性、动力阳性、葡萄糖代谢 类型(0/F)为发酵型(F)，IMViC:靛基质-MR-VP+柠檬酸盐+，在TSA钭面上产黄色色素。 进一步进行生化鉴定见表(4)表(6)菌株传统生化鉴定结果
硝酸盐还i 苦可仁i 明胶1 肌_ffi_ 蔗 立
乳 立 比露1
蜜二上 棉子1 鼠李1 阿拉伯I 卫矛i 氰化钾 .脲 R 硫化氢
ι
!ON PG
ι
|山梨胄 赖氨酸 鸟氨酸 精氨酸
权利要求
一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，其特征是命名为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年04月06日，保藏编号CGMCC No.3724。
2.根据权利要求1所述的一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，其特征是提取 方法为(1)用预热45°C缓冲蛋白胨水500ml与IOOg乳粉摇勻，36°C士 1°C培养18_24h ；(2)移取上述培养液IOml加于90ml肠道菌增菌肉汤中36°C士 1°C培养18_22h ；(3)取肠道菌增菌肉汤培养物一环划线接种伊红美蓝、山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板 各 1 块，36°C 士 1°C培养 18-24h ；(4)观察菌落形态，从山梨醇麦康凯平板上挑取不发酵山梨醇的单个菌落接种4支TSA 钭面、36°C 士 1°C 培养 18-24h ；(5)用钭面做触酶、氧化酶、G染色、进一步生化鉴定。
全文摘要
一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，阪崎肠杆菌菌株现已在中国微生物菌种保藏中心已专利保藏。保藏日期为2010年04月06日，保藏编号CGMCC No.3724。本发明点是半乳糖醇(卫矛醇)阳性、苦可仁甙阴性、明胶酶阳性、乳糖为迟缓发酵等4种生物特性的阪崎肠杆菌种。该菌株经小鼠急性毒性试验表明，具有较强的毒力和侵袭力，菌株经中国药品生物制品检定所依据《伯杰细菌鉴定手册》第9版对其进行鉴定，确认阪崎肠杆菌。0819-041生物型菌株经中国医学科学院医学信息研究所查新“未检索到半乳糖醇(卫矛醇)阳性；②苦可仁甙阴性；③明胶酶阳性；④乳糖为迟缓发酵等4种生物特性的阪崎肠杆菌种。”为国际上首次发现该生物型阪崎肠杆菌。
文档编号C12N1/20GK101935629SQ20101020767
公开日2011年1月5日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者卢兆芸, 陈海婴, 高建新 申请人:南昌市疾病预防控制中心