专利名称：一种无需提取动物组织dna的直接pcr方法
技术领域：
本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及利用特定的组织裂解液对动物组织包括耳组织、血液或毛发进行快速消化，然后直接用少量的该消化液作为模板，实现PCR扩
背景技术：
基因组DNA的制备对完成PCR扩增是必不可少的，在动物遗传育种中，PCR扩增是进行基因多态性分析、微卫星分析、基因克隆和测序等研究工作的基础。目前，经常用于DNA 提取的动物组织包括耳组织、血液及毛。通常，动物组织样品DNA的提取采用的是传统的酚_氯仿抽提法，但该方法存在步骤繁琐、耗时、耗试剂及安全性差等缺点。如果用该方法大量提取动物组织样品时，上述的缺点将更加突出。一些在此基础改进的方法已有报道，同时也有很多商业化的DNA提取试剂盒，但这些改进的方法及商业试剂盒存在一个共性提取过程仍需要组织样品的裂解、DNA的乙醇或异丙醇沉淀和70%乙醇清洗DNA这三步，因此在提取大量动物组织样品的DNA时，也同样表现出耗时及费用高的缺点。此外，有报道用整个果蝇的胚胎、幼虫及成虫直接作为模板进行PCR扩增。但用整个动物组织如耳组织、毛囊直接作为模板进行PCR扩增是行不通的。
发明内容
本发明的目的是提供一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，此方法可以同时处理大量动物组织样品，实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作，快速简化操作步骤，节省成本。本发明提供一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，其中PCR扩增所用的模板为动物组织经组织裂解液消化后的消化液。所述PCR反应按如下步骤进行将动物组织与组织裂解液混合，37 55 °C温育25 30min，优选为55 °C温育 30min，95°C变性 5min，取 2μ 1 作模板；PCR 反应体系终浓度为 250μΜ 的 dNTP，10mMTris-Cl，pH8. 3，50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 2ρΜ上游引物，2ρΜ下游引物，2 μ 1组织消化液，IU Taq DNA聚合酶，用ddH20补足至 20μ 1 ；PCR 反应条件94°C预变性 4min，94°C变性 30s，61°C复性 30s，72°C延伸 20 40s， 40个循环，然后72°C延伸7min，最后16°C保温。所述的动物组织选自耳组织、血液或毛发，所述的毛发带有毛囊。所述组织裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl组成。所述Tris-Cl的浓度为IOmM IOOmM,优选10mM，pH8. 0 ；所述的EDTA浓度为1 4mM，优选为2mM，pH8. 0，所述的蛋白酶K的浓度为100ug/ml 200ug/ml，优选为200 μ g/ ml ；所述的NaCl的浓度为O 0. 8M，优选为0. 2M。
本发明提供的无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，和目前存在的方法和试剂盒相比，该方法简单、快速和节约成本。使用该方法，仅需一步处理动物组织样品，然后直接取2 μ 1处理液为模板完成PCR扩增。此外，该方法特别适用于小组织样品如一根动物毛， 因为用目前存在的方法和试剂盒，至少需要5 6根动物毛才能完成DNA的提取。该方法从样品处理到PCR扩增都在PCR仪上完成，在动物中可以实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作如基因分型、微卫星分析、亲子鉴定及基因的克隆和测序。
图1所示为不同裂解液处理猪耳组织后直接PCR法扩增的产物。图中，1、2、3、4分别表示用裂解液1、裂解液2、裂解液3、裂解液4处理猪耳组织后直接PCR法扩增的产物。5 表示没有经任何裂解液处理，直接用耳组织作模板PCR扩增的产物。图2所示为裂解液中不同EDTA浓度对PCR扩增效率的影响。图3所示为裂解液中不同EDTA浓度的PCR电泳图。图4所示为裂解液中不同NaCl浓度对PCR扩增效率的影响。图5所示为马毛、鸡血、及猪耳组织经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增结果。图中1、3和5表示马毛、鸡血及猪耳组织经优化组织裂解液处理后直接PCR扩增的结果；2、4和6表示用传统酚-氯仿抽提法从马毛、鸡血及猪耳组织提取的DNA为模板PCR扩增的结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1配置四种不同的组织裂解液裂解液1 :10mM Tris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶 K ；裂解液2: IOmM Tris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶K，0. 1 % SDS ；裂解液3:10mM Tris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶 K，0. OlM NaCl ；裂解液4:10mMTris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶K，0· 1 % SDS， 0.OlM NaCl ；取0. Olg的耳组织，放入一个干净的200 μ 1 PCR管，充分剪碎，然后分别取上述4 种不同的裂解液50 μ 1，先用55°C温育30min，然后再95°C变性5min让蛋白酶K失活，最后直接取2μ1 4种不同的消化液作为模板，以未经任何裂解液处理的耳组织为对照，进行 PCR扩增，扩增猪myhc nb基因片段。PCR 反应体系终浓度为 250 μ M dNTP, IOmMTris-Cl, ρΗ8· 3，50mM KCl，1. 5mM MgCl2, 2pM上游引物，2pM下游引物，2 μ 1组织消化液，IU Taq DNA聚合酶，用ddH20补足至 20 μ 1。PCR 扩增的上游引物为 Pl :5，GGGGATTTGGGTTTTGGTTA 3，；下游弓丨物 Ρ2 5，CAGACGATCTACGGCAGTCA 3，。PCR 扩增条件94°C预变性 4min，94°C变性 30s，61°C 复性 30s，72°C延伸40s，40个循环，然后72°C延伸7min，最后16°C保温。扩增结束后，取5 μ 1扩增产物进行琼脂糖胶分析。结果发现，组织裂解液1和3 处理组在电泳分析时有明显的PCR产物(图1中，1和3泳道)，而组织裂解液2和4 (含有 0. 1 % SDS)处理组，检测不到PCR产物(图1中，2和4泳道)，泳道5也未扩增出PCR产物。 说明耳组织未经任何处理不能直接作为PCR的模板，SDS不适宜作为组织裂解液的成分。实施例2裂解液IOmMTris-Cl ρΗ8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，100 μ g/ml 蛋白酶 K，0. OlM NaCl取0. Olg的耳组织，放入一个干净的200 μ 1 PCR管，充分剪碎，然后取上述的裂解液50 μ 1，先用37°C温育25min，然后再95°C变性5min让蛋白酶K失活，最后直接取2μ 1 消化液作为模板，以未经任何裂解液处理的耳组织为对照，进行PCR扩增，扩增猪myhc IIb 基因片段。PCR反应体系和反应条件同实施例1。扩增结束后，取5 μ 1扩增产物进行琼脂糖胶分析。结果发现，经裂解液消化的耳组织能扩增出700bp左右的片段，而未经消化耳组织不能扩增出条带。实施例3对裂解液1 =IOmM Tris-Cl,pH8. 0, ImM EDTA，ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶K 中的EDTA 浓度进行优化，设置1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM 11个不同浓度。耳组织的处理方式和PCR反应体系和条件同实施例1。每个浓度做三个处理，每个处理做三个重复的PCR扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶检测后发现，6mM浓度以后已经检测不到条带(图2)。前3个浓度的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，纯化产物经NanoDrop 2000 (NanoDropTechnologies, Wilmington, DE, USA)测定。结果表明，2mM EDTA 是最佳浓度(图3)。实施例4在优化后的组织裂解液1 :10mM Tris-Cl pH8. 0，2mM EDTApH8. 0，200ug/ml 蛋白酶 K 的基础上，对 NaCl 的浓度进行了优化。设置 0. 01,0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0. 1,0. 2,0. 4、 0.6,0. 8M 10个浓度。耳组织的处理方式、PCR反应体系和条件同实施例1。每个浓度做三个处理，每个处理做三个重复的PCR扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。所有PCR产物经琼月旨糖凝胶电泳纯化，纯化产物经 NanoDrop2000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)测定。结果表明，0. 2M是组织裂解液中NaCl的最佳浓度(图4)。实施例5取一根有明显毛囊的马毛放入一个干净的PCR管，然后取5μ 1优化的组织裂解液(IOmM Tris-Cl (ρΗ8. 0), 2mM EDTA(pH8. 0)，0. 2MNaCl，200 μ g/ml 蛋白酶 K)完全浸没毛囊，再去除毛囊上部大部的毛组织，55 °C温育30min，95°C变性5min，然后取2μ 1该组织裂解液直接作为模板进行PCR扩增，扩增马线粒体上的D-Ioop区。上游引物Ρ3 5，CTAGCTCCACCATCAAC ACC3，，下游引物 Ρ4 :5，ATGGCCCTGAAGAAAGAACC3，。PCR反应体系同实施例1。
PCR 扩增条件941预变性41^11，941变性308，601复性308，721延伸308，40个循环，然后72°C延伸7min，最后16°C保温。结果表明，马毛经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增的效果(图5中第1泳道)同用酚-氯仿抽提法提取马毛的DNA为模板的PCR扩增的效果一致(图5中第2泳道)。实施例6取2 μ 1鸡血放入一个干净的200 μ 1 PCR管，然后用48 μ 1优化的组织裂解液 (IOmM Tris-Cl, pH8. 0,2mM EDTA, ρΗ8·0，0·2Μ NaCl，200 μ g/ml 蛋白酶 K)与之充分混勻，55°C温育30min，95°C变性5min，然后取2μ 1该组织裂解液直接作为模板进行PCR扩增，扩增鸡cyt3A80基因片段。上游引物P5:5' TGCCTGGTTGCTTATGTC 3'，下游引物P6: 5' GCTAACTGGGAATTGCTG 3'。PCR的反应体系同实施例1PCR 扩增条件941预变性％^11，941变性308，611复性308，721延伸208，40个循环，然后72 °C延伸7分钟，最后16 °C保温。结果表明，鸡血经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增的效果(图5中第3泳道)同用酚-氯仿抽提法提取鸡血的DNA为模板的PCR扩增的效果一致(图5中第4泳道)。实施例7取0. Olg的耳组织，放入一个干净的200 μ 1 PCR管，充分剪碎，然后取50 μ 1优化的组织裂解液(IOmM Tris-Cl,pH8. 0,2mM EDTA，pH8. 0,0. 2M NaCl,200y g/ml 蛋白酶K)与之混勻，55°C温育30min，95°C变性5min，然后取2 μ 1该组织裂解液直接作为模板进行PCR 扩增，扩增猪myhc IIb基因片段。上游引物Pl :5，GGGGATTTGGGTTTTGGTTA 3，，下游引物 P2 5' CAGACGATCTACGGCAGTCA 3’。PCR反应体系同实施例1PCR 扩增条件941预变性％^11，941变性308，611复性308，721延伸408，40个循环，然后72 °C延伸7分钟，最后16 °C保温。结果表明，猪耳组织经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增的效果(图5中第 5泳道)同用酚-氯仿抽提法提取猪耳组织DNA为模板的PCR扩增的效果一致(图5中第 6泳道)。序列说明SEQ ID NO. 1 6 分别是引物 PI、P2、P3、P4、P5 和 P6。
权利要求
1.一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，其特征在于，以动物组织消化液为模板直接进行PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述动物组织消化液按如下步骤获得将动物组织与组织裂解液混合，37 55°C温育25 30min，95°C变性5min。
3.根据权利要求2所述的PCR方法，其特征在于，所述动物组织消化液按如下步骤获得动物组织与组织裂解液混合，55°C温育30min，95°C变性5min。
4.根据权利要求1、2或3所述的PCR方法，其特征在于，所述组织裂解液由Tris-Cl、 EDTA,蛋白酶K和NaCl组成。
5.根据权利要求4所述的PCR方法，其特征在于，所述Tris-Cl的浓度为10 lOOmM， pH8. 0，所述的EDTA浓度为1 4mM，pH8. 0，所述的蛋白酶K的浓度为100 200 μ g/ml，所述的NaCl的浓度为0 0. 8M。
6.根据权利要求5所述的PCR方法，其特征在于，所述的Tris-Cl的浓度为10mM，所述的EDTA浓度为2mM，所述的蛋白酶K的浓度为200 μ g/ml，所述的NaCl浓度为0. 2M。
7.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述的动物组织选自耳组织、血液或毛发。
8.根据权利要求7所述的PCR方法，其特征在于，所述的毛发带有毛囊。
9.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述的PCR的反应体系如下终浓度为 250 μ M dNTP, IOmMTris-Cl,pH8. 3,50mM KCl，1. 5mMMgCl2，2pM 上游引物，2pM 下游引物，2 μ 1组织消化液，IU Taq DNA聚合酶，用ddH20补足至20 μ 1。
10.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR的反应条件如下94°C预变性％iin，94°C变性30s，61°C复性30s，72°C延伸20 40s，40个循环，然后 72°C延伸7min，最后16°C保温。
全文摘要
本发明涉及一种无需提取动物组织DNA的直接PCR的方法，该方法通过将动物组织用组织裂解液进行消化，以消化液为模板直接进行PCR扩增。所用组织裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl组成。与目前常用的方法相比，该方法可以同时处理大量动物组织样品，实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作，快速简化操作步骤，节省成本。
文档编号C12Q1/68GK102344919SQ201010245529
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者吴常信, 徐海岳, 李红伟, 赵春江 申请人:中国农业大学