专利名称：一种制备l-高苯丙氨酸的方法
技术领域：
本发明属于手性医药中间体制备领域，涉及一种生物催化法不对称制备手性医药中间体的方法，具体涉及一种以2-氧代-4-苯基丁酸及其酯为底物，以高苯丙氨酸脱氢酶为生物催化剂，实现单一光学纯度的L-高苯丙氨酸高效制备的工艺方法。
背景技术：
L-高苯丙氨酸，S卩(S) -2-氨基-4-苯基丁酸，分子式为CltlH13NO2,分子量为 179.22，CAS号为943-73-7。L-高苯丙氨酸是一种非天然的手性α -氨基酸，该类氨基酸及其酯是用来制备血管紧张素(ACE)抑制剂类药物的重要原料。它是目前世界上约20 种抗高血压新药的共同中间体，例如一方面可以直接用于制造如Enalapril (依那普利)、 Benazepril (贝那普利)、Lisinopril (赖诺普利)、Captopril (卡托普利)、！"emocapril、 Cilazapril (西拉普利)等，另一方面可以通过制成双胜肽化合物(NEPA)来制造多种抗高血压药物如Sprirapri 1、Delapril (地拉普利)、Imidapril (咪哒普利)、Quinapril (喹那普利)等。目前，合成普利类药物中间体L-高苯丙氨酸的方法主要为化学方法，包括化学拆分法和化学不对称合成法。前者利用手性拆分试剂对外消旋体进行拆分，但最大收率一般不超过50% (参见Chem. Pharm. Bull. 1989,37 :280-283)；不对称合成法则利用手性催化剂催化直接得到对映异构体，但是存在诸多不足反应过程复杂、反应条件苛刻(-60°C )、 生产成本高、环境污染严重(参见J.Am. Chem. Soc. 1988,110 :1547-1557) 由于生物催化技术具有催化效率高、专一性强、反应条件温和环境污染小等优点， 已逐渐被用于制备L-高苯丙氨酸。例如，利用乙内酰脲酶协同氨甲酰水解酶不对称分解相应的乙内酰脲，得到L-高苯丙氨酸(参见J. Biotechnol. 2008,134 :231-239)，产率接近 100%，但该法在原料合成中需要使用有毒性的物质。另一种较为通用的方法是氨基酸氨基转移酶催化相应的酮酸转氨的方法，例如专利号为200710021346. X的中国发明专利及Lo 等(Biotechnol. Prog. 2005,21 :411-415)使用天冬氨酸转氨酶和美国专利US6146859使用色氨酸转氨酶成功合成L-高苯丙氨酸，获得大于95%的产率和高度立体选择性，但该法原料所用的氨基供体氨基酸增加生产成本，且转氨酶活性通常在高底物浓度时受到抑制。 此外，采用高苯丙氨酸脱氢酶还原氨化2-氧代-4-苯基丁酸的方法亦被用于制备L-高苯丙氨酸，该方法转化率达99. 1 %，ee值大于99. 1 %，但是该方法受到反应底物浓度相对较低QOOmM)、辅酶投入量大(IOmM)导致成本过高、膜反应器操作复杂等因素的制约(参见 J. Org. Chem. 1990,55 :5567-5571 ；Biotechnol. Adv. 2009,27 :286-296)。因此，建立一种高效制备L-高苯丙氨酸的生物催化工艺以提高底物浓度、减少辅酶投入和简化生产流程，对降低生产成本具有广泛的实用价值和重要意义。
发明内容
本发明的目的是建立一种制备L-高苯丙氨酸的方法，在保证高立体选择性、高转化率和高得率的基础上，有效提高底物浓度，减少辅酶投入，简化生产工艺和降低生产成本。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)向反应液中加入底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系；所述反应液为水或pH为7. 0 9. 0的缓冲液；所述底物为2-氧代-4-苯基丁酸或其酯，其结构式为
底物浓度为IOmM 565mM ；更优选200 565mM ；
权利要求
1.一种制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)向反应液中加入底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系；所述反应液为水或pH为7. 0 9. 0的缓冲液；所述底物为2-氧代-4-苯基丁酸或其酯，其结构式为其中R为H或C1^2的烷基，底物浓度为IOmM 680mM;所述甲酸铵和底物摩尔比为1 1 10 1;所述高苯丙氨酸脱氢酶的浓度大于等于5U/mL，高苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比例为0.8 1.0 1 ；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD+浓度大于等于 0. ImM ；(2)步骤(1)所得反应体系在振荡或搅拌条件下，用盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水调节反应体系溶液pH至7. 0 9. 0，于15 50°C下，反应制备 L-高苯丙氨酸，反应完成后过滤分离L-高苯丙氨酸和滤液，得到L-高苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤⑴中，底物浓度为200mM 565mM。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤O)中，在保持反应进行的同时，补加底物；补加底物的方式选自一次性加入底物或底物高浓度储液、分批加入底物或底物高浓度储液、连续加入底物或底物高浓度储液中的一种；并且保持反应体系中的底物浓度小于等于680mM;其中，所述底物高浓度储液的配制方法选自以下两种中的任意一种 [a]将甲酸铵和底物按照摩尔比为1 1 10 1溶于pH值为7.0 9.0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7. 0 9. 0，配制得到底物和甲酸铵的混合溶液，并且底物浓度小于等于850mM ； [b]将底物和助溶剂混合溶于pH值为7. 0 9. 0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7. 0 9. 0，配制得到的底物储液浓度小于或等于2191mM。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)之后还包括以下步骤(3)循环利用滤液，向滤液中补加底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶；用盐酸、硫酸、醋酸、甲酸、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水调节反应体系溶液PH至7. 0 9. 0，振荡或搅拌条件下，于15 50°C下，反应制备L-高苯丙氨酸，重复该步骤直至转化率低于90% ；其中，高苯丙氨酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中高苯丙氨酸脱氢酶用量的一半，甲酸脱氢酶补加的量为步骤(1)中甲酸脱氢酶用量的一半；补加后，底物浓度为IOmM 680mM; 所述甲酸铵和底物摩尔比为1 1 10 1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤C3)中，向滤液中补加底物时，补加的方式选自一次性加入底物或底物高浓度储液、分批加入底物或底物高浓度储液、连续加入底物或底物高浓度储液中的一种；其中，所述底物高浓度储液的配制方法选自以下两种中的任意一种[a]将甲酸铵和底物按照摩尔比为1 1 10 1溶于pH值为7.0 .9. 0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7. 0 9. 0，配制得到底物和甲酸铵的混合溶液，并且底物浓度小于等于850mM ;[b]将底物和助溶剂混合溶于pH值为 7. 0 9. 0的缓冲液，室温或稍微加热溶解，使用碱溶液维持溶液pH至7. 0 9. 0，配制得到的底物储液浓度小于或等于2191mM。
6.根据权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于，所述助溶剂选自十二烷基硫酸钠、吐温-80、吐温-60、司盘-80、司盘-60、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚、甲苯、二氧六环、石油醚、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷和正庚烷中的一种或一种以上的混合物。
全文摘要
本发明公开了一种以高苯丙氨酸脱氢酶为生物催化剂制备单一光学纯L-高苯丙氨酸的工艺方法，具体包括以下步骤在反应液中加入底物、甲酸铵、高苯丙氨酸脱氢酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡或搅动反应后从反应体系中过滤直接得到L-高苯丙氨酸产物，滤液循环用于下一轮反应，反应温度为15～40℃。本发明利用高苯丙氨酸脱氢酶，配合辅酶循环再生体系，采用简单过滤循环工艺制备L-高苯丙氨酸，底物浓度达到560mM，所需的辅酶NAD+浓度较低，并且可循环多次使用而达到忽略辅酶成本的水平，得率超过95％，具有重要应用价值。
文档编号C12P13/04GK102373246SQ20101026029
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者吴旭日, 张洁琳, 陈依军 申请人:陈依军