专利名称：腐乳促熟剂和一种快速生产腐乳的方法
技术领域：
本发明涉及食品生产领域。特别是，它涉及生产腐乳(也称为豆腐乳等)的新方法。尤其是，它是一种以大豆及其制品为原料，在较短的时间内使用腐乳促熟剂生产腐乳的方法。
背景技术：
腐乳，又称豆腐乳、酱豆腐等，是利用微生物发酵的方法改变植物蛋白风味的大豆制品。腐乳气味鲜美、风味独特、质地细腻、营养丰富，它是中国传统的调味品之一。只在台湾，1982年总产量约为12，000吨，即每人每年660克(沈德中，海外腐乳的生产和研究，中国调味品，1989 (7)，2-4页)。因此，对腐乳的需求量很大，特别是在世界各地的中国人的需求。如何在保持其良好的口感的同时高效地生产腐乳是关键要解决的问题之一。使用现有的方法通常需要6-10个月的时间从豆类生产腐乳，这增加了半成品被不受欢迎的微生物污染的风险。传统的制备方法以大豆为原料，通过凝固得到大块的豆腐，然后接种霉菌到豆腐上进行发酵，并形成立方体状的食物。主要的不足之处是发酵时间长，使产品容易腐败变质。我国专利申请CN1357250A公开了一个制作块状腐乳的方法。该方法生产腐乳的特点是，将切成小块的豆腐放入发酵房进行前期发酵，存放4 5天，至豆腐块熟透后有小菌丝，散发香气，将发酵成熟的豆腐块拌入香料，装瓶，密封，后期发酵30 90天成为成品。中国专利申请CNlO 1396099A披露了一种腐乳产品的生产方法，40°C以下接种，前发酵36-48小时；腌3-5天，后发酵在15-30°C，发酵45-60天。因此，无论是用哪种方法来生产腐乳，在制作工艺上都存在一个影响发酵过程效率和最终产品品质的关键问题——发酵周期过长，坯体在发酵期间容易腐败变质。中国专利申请CN101283772A披露一种用发酵法快速制备低盐腐乳的方法，步骤是(1).将从大豆原料中所制备的豆乳，灭菌后冷却至室温；( .接种霉菌进行发酵，发酵时间为M-48小时；(3).再添加酶制剂以促进成熟，于40-55°C发酵培养，时间为5_7天；(4).当腐乳成熟后，经调配并采用适宜的包装和杀菌方式即可得到低盐膏状或块状腐乳成
在本发明的发明人研究了腐乳生产过程，并确定了促熟剂的物质组成。此外，本发明的发明人提供了一种快速生产腐乳的方法。发明概述根据本发明，可以通过使用羧肽酶加速腐乳成熟。本申请提供了用于腐乳的促熟剂。所述促熟剂可以是一种蛋白酶，或一种脂肪酶，或一种蛋白酶(优选一种羧肽酶制剂)和一种脂肪酶的组合。所述促熟剂可以是两个或更多蛋白酶(优选羧肽酶制剂)，两个或更多的脂肪酶，或一种包括两个或更多的蛋白酶和两个或更多脂肪酶的组合。在优选的实施方式中，促熟剂是一种包括蛋白酶(优选一种羧肽酶制剂)和脂肪酶的组合。在最优选的实施方式中，促熟剂是一种包括Accelerzyme CPG和Piccantase A的组合。而且，本申请提供了快速生产腐乳的方法。该方法的特点是加入了一个包括蛋白酶(优选一种羧肽酶制剂)和脂肪酶的组合。本发明提供腐乳的制备方法包括在豆浆中加入至少一种蛋白酶，并且在豆浆凝固成形后接种霉菌。优选地，在豆浆中加入至少一种脂肪酶。优选地，蛋白酶是一种外切蛋白酶，更优选是一种羧肽酶，更加优选是一种Accelerzyme CPG。在另一实施方式中，至少有一个所加入的脂肪酶是微生物来源的。优选的脂肪酶是 Piccantase A0在另一项实施方式中，乳酸菌被用来使豆浆形成豆腐。优选的，乳酸菌是选自如下组的菌禾中Lactococcus lactis ssp cremoris, Lactococcus Iactisssplactis, Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, StreptococcusThermophilus,Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Leuconostoccitrovorum,Streptococcus diacetilactis，或其混合物。优选的乳酸菌选自DELVO - TEC LL50或DELVO - YOG SVV系列。霉菌包括一个单一的腐乳生产菌株或其混合物。腐乳的生产菌株包括雅致放射毛霉、五通桥毛霉、总状毛霉、腐乳毛霉。大豆原料是大豆、大豆粉、豆粕、豆渣和豆饼的单一一种或其混合物。本发明还提供了在制备腐乳中使用蛋白酶(优选一种羧肽酶制剂)，其中至少一个种蛋白酶在霉菌接种前被加到豆浆中。优选的蛋白酶是AccelerzymeCPG 。至少有一种脂肪酶在霉菌接种前被加到豆浆中。一般情况下，脂肪酶是微生物来源的。优选的脂肪酶是Piccantase A。 本发明还涉及一种根据本发明的方法制备的腐乳。包装方法可以使用基于本领域技术人员的知识的任何类型的包装方法，优选包括玻璃瓶，聚偏二氯乙烯(聚氯乙烯)，或塑料盒。发明详述一方面，本发明是提供一个或多个制造腐乳的酶添加剂。该添加剂可以是单一物质或两个以上的物质组合。该添加剂作为促熟剂的使用。在另一个方面，本发明涉及到蛋白酶在制备腐乳的方法中的用途。这项发明的目的是为了克服现有技术的不足之处，以提供比生产腐乳的传统方法更快捷的熟化生产工艺。此外，该发明不仅提供了一个节省时间的腐乳工业化生产工艺，而且还提高了腐乳的质量。蛋白酶包括内切蛋白酶和外切蛋白酶。许多蛋白酶参与了腐乳的风味的产生。合适风味的产生需要所涉及的蛋白酶的蛋白水解活性之间达到很精妙的平衡。任何不平衡都很容易导致不想要的味道，例如苦味的发展。发展蛋白酶用于加强腐乳的熟化过程因而成为非常精妙和复杂的过程。但是，如果其他原料或步骤已经产生了一些蛋白酶，就只一种单一的蛋白酶会被加入。外切蛋白酶优于内切蛋白酶，因为它们导致有苦味形成的趋势更小。数年来，已有若干种商业蛋白酶制剂被推向市场。在数篇论文中给出了对于可获得的商业产品的综述(Wilkinson，van denBerg& Law， Bulletin of the IDF(2002)371,16-19 ；Kilcawley, Wilkinson &Fox， FoodBiotechnol(2002) 16,29-55 ；Kilcawley, Wilkinson & Fox, EnzymeMicrob. Technol.(2002) 31，310-320)。例子包括从真菌菌种(包括但不限于来自Quest，荷兰的Bioprotease P Conc and Bioprotease A Conc ；来自 Amano 的 Protease M & Protease A禾口 Acid protease A ；来自 Biocatalysts 的 Promod 215,来自 Stern 的 Sternzyme B5026 ；来自Novozymes，丹麦的Flavourzyme MG/A)和细菌菌种(包括但不限于来自Novozymes，丹麦的 Protamex 禾口 Neutrase ；来自 Amano 的 Protease N ；来自 Biocatalysts 的 Promod24P 和 24L ；来自 DSM，荷兰的 Protease B500;来自 RhodiaFoods，法国的 Protease 200L)获得的酶制剂。关于特定蛋白酶的存在和/或这些蛋白酶在特定产物中存在比例方面，这些蛋白酶在组成方面有很大不同。上述Kilcawley，Wilkinson和的论文清楚地表明，大多数商业蛋白酶产品是内切和外切肽酶活性的混合物。若干种产品被开发为只包含外切肽酶活性。对于食品应用而言，它们总是氨肽酶，例子包括DBS50和DBP20 (来自lihodia，法国)，Corolase LAP(来自 Rohm,德国)，Flavourzyme MG/A(来自 Novozymes,丹麦)，Accellerzyme AP和Accelerzyme CPG (来自 DSM，荷兰)，和P印tidase R(来自 Amano，日本)。在本发明中，优选外切蛋白酶。更优选的方案是羧肽酶制剂。最优选的实施方式中，羧肽酶是Accelerzyme CPG。Accelerzyme CPG，是由筛选过的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)的深层培养液纯化的获得的酶。该酶具有释放蛋白质和肽的C-末端氨基酸的广谱活性。其在PCT专利申请文本W02005/074695和WO 2009/080484中公开的内容,作为参考并入本申请。与Accelerzyme CPG具有类似活性的酶或混合酶可以用于本发明。例如，也可以使用 Accelerzyme NP 50000。用于腐乳成熟的蛋白酶制剂添加可以在腐乳接种霉菌前的多个制备阶段进行。优选地，添加蛋白酶到豆浆中。蛋白酶可以在加入凝结剂之前或同时加入。添加到豆浆中促进酶在腐乳中的均勻分布。豆浆形成豆腐后，接种霉菌。根据本发明，可以通过蛋白酶的使用得到加速成熟的腐乳。该蛋白酶应该能够至少释放用于腐乳风味形成的重要氨基酸，如亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸，和蛋氨酸。蛋白酶的添加量是占基质(如豆浆)0. 001重量％到1重量％的活性水平，优选是占基质0.05- 0.5重量％或更优选占基质0.01-0. 1重量％。用于腐乳成熟的羧肽酶制剂添加可以在腐乳接种霉菌前的多个制备阶段进行。优选地，添加羧肽酶到豆浆中。羧肽酶可以在加入凝结剂之前或同时加入。添加到豆浆中促进其在豆乳中的均勻分布。可选择地，可以在稍后阶段添加酶，但这种方式引入了酶在腐乳中非均勻分布的风险。在优选的实施方式中，羧肽酶制剂是不含内切肽活性的，并能至少释放用于腐乳风味形成的重要氨基酸，如亮氨酸，苯丙氨酸，缬氨酸和蛋氨酸。当制剂中内切蛋白酶活性(PU)与羧肽酶活性(CPG)比小于0. 01，优选小于0. 001和最优选小于0. 0005时，则该羧肽酶制剂被定义为不含内切蛋白酶活性。羧肽酶优选是广谱的羧肽酶，其能够从肽或蛋白质释放出多数的天然氨基酸。广谱羧肽酶被定义为能释放出数量上为至少80%的天然氨基酸的酶，该数量可通过W02005/074695实施例3中描述的方法检测。 在该发明的一个优选实施方式中，至少90 %羧肽酶制剂的羧肽酶活性是由单种酶导致的，其中羧肽酶活性通过W02005/074695的实施例1中描述的方法测定。在另一项优选的实施方式中，羧肽酶被组合使用。在该发明的一个优选实施方式中，羧肽酶活性来自Aspergillus niger的经纯化的羧肽酶CPD I (PEPG)。在第三个方面，本发明是关于脂肪酶在腐乳生产中的用途。在一些实施方式中，脂肪酶的使用是有益的，如以小牛或小羊胃制备的凝乳酶糊，或Palatase A750L(Novo)、Palatase M200L(Novo)> PalataseMlOOO(Novo)、或 PiccantaseA (DSM)，也可以是动物来源的来自于DSM的Piccantase (K，KL, L&C)或者Lipomod 187，Lipomod 338(BiOCatalyStS)。这些脂肪酶的使用可能对腐乳的风味带来有益的影响。用于腐乳成熟的脂肪酶的添加可以在腐乳接种霉菌前的多个制备阶段进行。优选地，添加脂肪酶到豆浆中。脂肪酶可以在加入凝结剂之前或同时加入。添加到豆浆中促进脂肪酶在腐乳中的均勻分布。豆浆形成豆腐后，接种霉菌。至少有一种脂肪酶是加入到豆浆中。优选是，该脂肪酶是微生物来源的。更优选的脂肪是Piccantase A。Piccantase A是一种来自于真菌Miizomucor miehei的脂肪酶制剂。类似的酶或酶制剂也可使用。特别是，可以使用如下的脂肪酶Piccantase R800 ；Piccantase AN ；Piccantase K ；Piccantase L ；Piccantase KL ；Piccantase L-5X ；andPiccantase C—3X。所有上述脂肪酶可以从荷兰的DSM购得。脂肪酶的添加量是占基质(如豆浆)0. 001重量％到1重量％的活性水平，优选是占基质0. 05- 0. 5重量％或更优选占基质0. 01-0. 1重量％。至少一种乳酸菌是作为混凝剂使用，使得豆浆形成豆腐。通常的菌种实例是选
Lactococcus lactis sspcremoris, Lactococcuslactis ssp lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, Streptococcuslactis, Streptococcus cremoris, Leuconostoc citrovorum, Streptococcus
diacetilactis，或其混合物。在优选的实施方式中，乳酸菌选自DELVO - TEC LL50或 DELVO - YOG SVV 系列。其中，DELVO- TEC LL50 系列是 Lactococcus
lactis ssp cremoris,禾口 Lactococcus lactis ssplactis 的混合菌株系列。DELVO - YOG SVV 系列是 Lactobacillusdelbrueckii ssp bulgaricus 和Streptococcus Thermophilus 的混合菌株系列。在腐乳生产中使用的霉菌是单一菌种或其混合物，选自雅致放射毛霉、五通桥毛霉、总状毛霉、腐乳毛霉。大豆原料可以是单一产品或其混合物，选自大豆、大豆粉、豆粕、豆渣、豆饼。由本发明的方法制备的腐乳，可以采用包括玻璃瓶、PVDC(PVC)塑料盒，或塑料盒的方式包装。在一个优选的的实施方式中，根据本发明快速生产腐乳的方法的具体步骤如下(1)煮浆灭菌后自然冷却至室温；(2)依次添加蛋白酶，脂肪酶，乳酸菌，并于30°C下保温10至15小时；(3)当豆乳形成质地细滑坚韧的凝乳时，切割成长1. 5cm,宽1. 5cm,厚1. 5cm的小块；(4)接种霉菌，于发酵48小时；(5)于45_50°C恒温发酵6_10小时后灭酶；并且(6)将腐乳浸入辅料中，成熟后进行包装，即可得块状腐乳成品。在一个具体实施方式
中，促熟剂，即AccelerzymeCPG和Piccantase A用于制造方块状腐乳，该方法包括以下步骤(1)研磨大豆形成豆浆，通过煮沸豆浆灭菌，将消毒豆浆降温至室温；(2)将AccelerzymeCPG，Piccantase Α,乳酸菌LL50或SVV添加到消毒后冷却的豆浆中，并于30°C下保温10至15小时；(3)当豆乳形成质地细滑坚韧的凝乳时，切成1. 5厘米X 1. 5厘米X 1. 5厘米的小块；(4)接种霉菌到小块上，于28°C发酵48小时；(5)在45-50°C水解6-10小时，然后使酶失活；及(6)将腐乳块渗入佐剂，并在成熟后用适当的包装方式包装，可形成块状腐乳成品。在应用促熟剂，例如Accelerzyme CPG和Piccantase A，快速生产块状腐乳的方法中，其原料可以采用大豆、大豆粉、豆粕、豆渣和豆饼等豆制品及其混合物。 所采用的发酵剂包括LL50系列，SVV系列。所采用的霉菌包括传统腐乳生产菌种的单一菌种或其混合物，包括雅致放射毛霉、五通桥毛霉、总状毛霉、腐乳毛霉等。所采用的包装方式包括玻璃瓶、PVDC (PVC)塑料盒等。本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种腐乳促熟剂。腐乳促熟剂可用于制作腐乳，包括在传统腐乳的制造方法中的应用。促熟剂的使用缩短了腐乳的生产周期，利于腐乳的现代化工业生产，而且还赋予块状腐乳较好的品质。本发明的优点和积极效果是1.本发明采用促熟剂，例如，蛋白酶和脂肪酶，促进腐乳成熟，从而缩短了生产周期。2.本发明提供了在制作腐乳的方法中使用促熟剂，例如蛋白酶和脂肪酶，的工艺，以及用促熟剂制造腐乳的方法。这种贡献改善了块状腐乳的品质，为快速成熟块状腐乳的现代化工业生产奠定了基础。下面的举例说明提供了一个对本发明更清晰的理解，但不被解释为对本发明的精神和范围的基础原则的限制。在此提供的例子只是为了说明的目的，而不是限制本发明的保护范围。
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现在提供典型的例子具体描述本发明。实施例实施例1 (1)取干大豆原料10. 0kg，加入25kg水，浸泡10小时，将水和豆子倒入磨浆机中，再加入60. Okg水到磨浆机中，并用湿磨法将大豆磨制成乳状，将所得豆浆加热至沸腾灭菌，然后冷却到室温；(2)依次添加0. 01 %的Accelerzyme CPG(从荷兰DSM公司购得)、0· 02 %的Piccantase A(从荷兰 DSM 公司购得)、0. 01 % LL50-A(菌种 Lactococcus lactis sspcremoris和/或Lactococcus lactis ssp Iactis的组合物，从荷兰DSM公司购得)和0. 02% CaCl2到消毒并冷却的豆浆中，将得到的混合物于30°C下保温12小时；(3)当豆乳形成质地细滑坚韧的凝乳时，切割成长1. 5cm,宽1. 5cm,厚1. 5cm的小块；(4)在切好的小豆腐块上接种腐乳生产菌种雅致放射毛霉，发酵48小时；(5)于50°C恒温发酵8小时后灭酶；(6)将腐乳浸入含有4%的食盐、3%的黄酒、0. 01%的香料粉的悬浊液中，成熟后装入塑料桶即可得块状腐乳成品。实施例2 (1)将IOkg全豆粉原料加入IOOkg水溶解完全，煮沸3分钟，形成豆乳，自然冷却
至室温；(2)依次添加 0. 05 % 的 Accelerzyme CPG (DSM) ,0. 02 % 的 Piccantase A(DSM) ,0.01%,DELVO-YOG SVV-21 (DSM)，及 0. Ol%的 CaCl2，将混合物于 30°C下保温8小时；(3)当豆乳形成质地细滑坚韧的凝乳时，切割成长1. 5cm,宽1. 5cm,厚1. 5cm的小块；(4)接种腐乳生产菌种雅致放射毛霉到切好的豆腐小块上，发酵48小时；(5)于50°C恒温发酵8小时后灭酶；(6)将腐乳浸入含有4%的食盐、3%的黄酒、0. 01%的香料粉的悬浊液中，成熟后装入塑料桶即可得块状腐乳成品。实施例3 (1)将20kg豆粕原料加入150kg水充分溶解，煮沸5分钟，过80目筛子所得豆乳，
自然冷却至室温；(2)在豆菜中依次添力卩 0.05 % 的 Accelerzyme CPG (DSM)，0.03 % 的 Piccantase A (DSM)，o.oi % 的 DELVO-YOG SVV-2 (菌种
Lactobacillusdelbrueckii ssp bulgaricus，，从 DSM 公司购得)和 0. 02% CaCl2,将得到的混合物于30°C下保温9小时；(3)当豆乳形成质地细滑坚韧的凝乳时，切割成长1. 5cm,宽1. 5cm,厚1. 5cm的小块；(4)接种腐乳生产菌种雅致放射毛霉到切好的豆腐小块上，发酵48小时；
(5)于45 °C恒温发酵10小时后灭酶；(6)将腐乳浸入含有4%的食盐、3%的黄酒、0. 01%的香料粉的悬浊液中，成熟后装入玻璃瓶即可得块状腐乳成品。
权利要求
1.一种腐乳的制备方法，其特征在于至少使用了一种羧肽酶制剂。
2.如权利要求1的方法，其中，羧肽酶被添加到豆浆中。
3.如权利要求1或2的方法，其中羧肽酶制剂中内切蛋白酶活性与羧肽酶活性比小于0. 01，优选小于0. 001，和最优选小于0. 0005。
4.如前述任一项权利要求的方法，其中添加了至少一种脂肪酶。
5.如前述任一项权利要求的方法，其中可以在添加羧肽酶制剂之前、同时或之后，加入脂肪酶。
6.权利要求4的方法，其中脂肪酶是微生物来源的。
7.如6方法的权利要求，其中的脂肪酶是来自于真菌lihizomucormiehei的脂肪酶制剂。
8.如权利要求1-7中的任意一项所述的方法，其中还包括使用乳酸菌。
9.如权利要求8的方法，其中乳酸菌选自Lactococcuslactis sspcremoris,Lactococcus lactis ssp lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus,Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Leuconostoc citrovorum,Streptococcus diacetilactis所组成的组，或其混合物。
10.如权利要求8的方法，其中乳酸菌选自Lactococcuslactis sspcremoris,禾口Lactococcus lactis ssp lactis 的混合菌株系列或 Lactobacillusdelbrueckii sspbulgaricus 禾口 Streptococcus Thermophilus 的混合菌株系列。
11.如权利要求1的方法，其中霉菌包括单一的腐乳生产用霉菌菌株或其混合物，腐乳生产用霉菌菌株选自雅致放射毛霉、五通桥毛霉、总状毛霉、腐乳毛霉或其混合物。
12.如权利要求1的方法，其中大豆原料选自大豆、大豆粉、豆粕、豆渣、豆饼或其混合物。
13.羧肽酶制剂在制备腐乳中的用途。
14.如权利要求13的用途，其中羧肽酶制剂中内切蛋白酶活性与羧肽酶活性比小于0. 01，优选小于0. 001，和最优选小于0. 0005。
15.如权利要求13或14的用途，其中使用至少一种脂肪酶。
16.如权利要求15的用途，其中可以在添加羧肽酶制剂之前、同时或之后，加入脂肪酶。
17.如权利要求15的用途，其中脂肪酶是微生物来源的。
18.如权利要求17的用途，其中的脂肪酶是来自于真菌lihizomucormiehei的脂肪酶制剂。
19.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法制备的腐乳。
全文摘要
本发明涉及一种制备腐乳的方法，其特征在于，在霉菌接种前将至少一种蛋白酶加入到豆浆中。它还涉及到蛋白酶在制备腐乳的方法中的应用。该方法克服了现有技术的缺点，提供了与腐乳的传统生产方法相比更快捷的后熟生产工艺。
文档编号A23L1/221GK102370112SQ201010261248
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者汪建明, 赵少华 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司