专利名称：一种番茄抗黄化曲叶病毒病及根结线虫病的分子标记辅助选择方法
技术领域：
本发明涉及农作物分子标记技术领域，尤其是一种同时检测番茄抗Ty-I及根结 线虫基因的分子标记辅助选择方法。
背景技术：
番茄是一种适应性广、产量高的世界性作物。番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，主要通过烟粉虱传播。近 年来，由于全球气候变暖和烟粉虱的空前扩展，该病害在40多个国家大面积爆发并逐年加 重，已成为世界许多地区番茄生产上的重要限制因素。由于栽培番茄都不具有番茄黄化曲 叶病毒病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)的抗性，所以为获得育种亲本，大 量的研究集中在从野生近缘种中进行筛选。若运用分子标记进行辅助育种可避免复杂的抗 性鉴定步骤，也有利于缩短育种年限。基于此，抗性位点的分子标记研究工作开展也较早。 TYIXD的抗性受控于1个主效基因，命名为Ty-Ι，为部分显性遗传，此外，至少还有2个以上 的修饰基因。Zamir 等(1994)利用来源于 L. esculentum(M82-l_8) XL. Chilense (LA1969) 的BC2S1和BC2S2群体，以及RFLP标记技术，将1个抗番茄黄化曲叶病毒病的主效基因 Ty-I定位在番茄第6号染色体上。其中染色体6上的Ty-I为抗性主要基因，而染色体3 禾口 7 上是修饰基因(Zamir D, Michelson I E, Zakay Y, Navot N, Zeidan M, Sarfatti M, Eshed Y, Harel E, Pleban T, van—Oss H, Kedar N, Rabinowitch H D,Czosnek H. Mapping and introgression of a Tomato yellow leaf curl virus tolerance gene, Ty-1. Theoretical and Applied Genetics，1994，88，141-146)。上述分子遗传的研究证实了在染色体6、3及7上可以找到相应的抗性位点和分子 标记。如Nizio (2008)等筛选的SSR分子标记可作为番茄Ty-I等位基因鉴定的标记(Nizio D AD, Maluf W R, Figueira A D, Nogueira D W, Silva V D, Neto ACG. Fingerprinting of tomato genotypes resistant to begomovirus by a codominant molecular marker linked to Ty-lgene. Pesquisa Agropecuaria Brasileira,2008,43(12) 1699-1705)> 以及 Ana 等(2007)筛选的 CAPS 标记(Ana P C, JoseM B, Mara J D, Fernando N V. Identification of a CAPSmarker tightly linked to the tomato yellow leaf curl disease resistance gene Ty-I in tomato. European Journal of Plant Pathology, 2007，117 (4) :347-356)、Zhang等(2002)筛选到的位于第6条染色体长臂的TG153和CT83 之间的抗 TYLCV 的 QTL(Zhang L P, Khan A, Nino L D, Foolad M R. A molecular linkage map of tomato displaying chromosomal locations of resistance gene analogs based on a Lycopersicon esculentumX L. hirsutum cross, Genome, 2002,45 :133_146)、源于 S. habrochaites的抗性位点的RFLP分子标记定位于第11条染色体的长臂的TG393和TG36 之间，也就是所说的Ty-2位点，以及同样源于S. chilense被定位于第6条染色体长臂上的抗性位点，该抗性位点包含了 Ty-Ι。这些研究为分子标记辅助选择奠定了基础。Perez de Castro 等(2007)研究发现，Ty-I 基因是一个位于“hot-spot” 的抗 性基因。这个“hot-spot”还有番茄根结线虫的抗性基因Mi等(Seah S，Telleen A C， Williamson V Μ. Introgressed and endogenous Mi-I gene clusters in tomato differ by complex rearrangements in flanking sequences and show sequence exchange and diversifying selection among homologues. Theor. App1. Genet. ,2007,114 1289-1302)。Mi是一个单独的主效基因，对线虫属主要的种类都有抗性(Gilbert J C. Some linkage studies with the Mi gene for resistance to root-knot nematodes. Report of the Tomato Genetics Cooperative，1958，8 :15-17)。自从番茄抗根结线虫基因 Mi 和 Ty-I基因被定位在“hot-spot”，接下来有很多研究证明，这两个基因是紧密连锁的。如圣 卡罗斯大学在番茄育种中发现同时具有Mi和Ty-I位点的番茄种(Mejia et al.，2005，未 发表资料)。据Messeguer等(1991)报道，和Mi基因相关的基因渐渗是在位于TG297和TG231 之间的位点，这个报道基本上与Zamir等(1994)报道的关于Ty-I基因的基因渐渗相同。 Perezde Castro et al. (2007)认为在染色体6上存在一个CAPs标记，该标记利用JBlF 和JBlR引物扩增后的PCR产物用TaqI酶切进行酶切，从而找到了一个与Ty-I紧密连锁的 TY 白勺标i己(Ana Perez de Castro, JoseMiguel Blanca, Maria JoseDiez, Fernando Nuez Vin-als. Identification of a CAPS marker tightly linked to the Tomato yellow leaf curl disease resistance gene Ty-I in tomato. Eur J Plant Pathol. 2007,117 347-356)。但到目前为止缺乏应用该标记进行番茄抗性基因型鉴定的报道。
发明内容
本发明的目的是，针对番茄常规抗病育种后代筛选过程中出现的工作量大、周期 长等条件的限制以及育种效率低、成本高的缺陷，提供一种用于早期同时鉴定番茄抗黄化 曲叶病毒病及根结线虫病害基因型的分子标记方法，从而用于分子标记辅助育种。本发明采用如下技术方案一种番茄抗黄化曲叶病毒病及根结线虫的分子标记辅助选择方法，其特征在于， 包括以下步骤(1)从番茄材料F1和自交分离后代F2单株提取DNA ； (2)对番茄材料F1和 自交分离后代F2进行多重PCR扩增；(3)多重PCR扩增产物的酶切及电泳分析检测；(4)依 据检测结果对育种分离世代材料进行抗性评价。所述的分子标记辅助选择方法，所述步骤⑴提取DNA的方法为将番茄材料F1 和自交分离世代材料F2播种，待幼苗长至3 4真叶时，每植株取1片幼叶，用改进的CTAB 方法提取DNA。所述的分子标记辅助选择方法，所述步骤(2)的具体方法为合成引物，进行PCR 扩增，并用taql酶进行酶切；根据PCR扩增及酶切结果所显示的纯合和杂合带型，与人工 苗期接种鉴定结果进行比较，确定抗Ty-I及根结线虫基因的分子标记；其中检测Ty-I基 因的上下游引物序列分别为 JB-I upper 5' -AAC CAT TAT CCG GTT CAC TC-3'和 JB-1 lower 5' -TTT CCATTC CTT GTT TCT CTG-3 ‘，根结线虫的上下游引物序列分别为Mi upper 5' -TCG GAG CCT TGG TCT GAA TT-3'和Mi lower 5' -GCC AGA GATGAT TCG TGAGA-3'。所述的分子标记辅助选择方法，所述步骤(3)的具体方法为多重PCR反应体系 20 μ 1，1 倍反应缓冲液，2. OmM MgCl2,0. ΙμΜ上下游引物，0. 2mM dNTPs，0. 04U 的 Taq 聚合 酶及20ng的模板DNA补充ddwater至20 μ 1 ；PCR扩增程序为94°C 5分钟，然后94°C 1分 钟，54°C 1分钟，72°C 2分钟，35个循环，72°C延伸10分钟；酶切体系为20 μ 1，其中含7 μ 1 PCR扩增产物，IOU taql,2y 1反应缓冲液；65°C 1. 5h ；PCR扩增及酶切产物用2%的琼脂糖 凝胶电泳进行电泳分离分析，EB染色，然后在Bio-rad的凝胶成像仪上成像。所述的分子标记辅助选择方法，所述步骤(4)的评价方法为若酶切带型中只含 有400bp的特异条带，为感Ty-I纯合基因型材料，若酶切带型中含有500bp和400bp的特 异条带，为抗Ty-I材料；若含有570bp和ISObp的特异条带，为抗根结线虫病纯合基因型 材料；若含有750bp，570bp，ISObp的特异条带，为抗根结线虫病杂合基因型材料；若只产生 750bp的特异性条带，无TaqI酶切位点，为感根结线虫病纯合基因型材料。所述的分子标记 辅助选择方法，所述的分离世代材料为高度分离的杂交后代群体或者高度分离的回交后代 群体。所述的分子标记辅助选择方法，所述的CTAB法提取的DNA为，配制CTAB缓冲液 (1)取少量的植株叶片于1. 5ml Eppendorf管中，放液氮中速冻15秒，加入100 μ 1 CTAB 缓冲液和少量石英砂，研磨成勻浆；(2)加入500 μ 1 CTAB缓冲液，65°C保温35-40min, 中间摇晃混勻；(3)加入等体积的24 1的氯仿异戊醇(ν/ν)，轻轻颠倒混勻5min， 4°C 15000rpm离心lOmin，将上清转到新管中，加入2/3体积的异丙醇；(4)室温下放置 5min,4°C 1500rpm，离心lOmin，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2_3次；弃上清，进行真空 干燥，向每个样品中加入50 μ 1灭菌双蒸水和适量的RnaSe，37°C消化lh，保存于-20°C备 用。本发明的有益效果是(1)本发明采用多重PCR的扩增方法，可以在同一反应体系中同时扩增Ty-I基 因及Mi基因，这样大大简化了实验操作和实验花费，适合于对大量样本材料进行鉴定和分 析，大大缩短时间和减少工作量。(2)本发明可以在实验室对抗番茄黄化曲叶病毒病及根结线虫病害抗性基因型进 行准确、快速的检测和分析，在常规育种中起到非常重要的辅助作用，减少了人工接种鉴定 的环节和步骤以及等待的时间，不受环境条件的影响，也不受植株生长状况的影响。在本发明公开了关于Ty-I和Mi基因的多重PCR分子标记方法，并通过进行TaqI 酶切判断材料的抗病基因型情况，以实现用一个反应体系能对两个抗病性状进行同时筛选 鉴定的目标。这个方法将为同时筛选番茄抗黄化曲叶病毒病及根结线虫病害在育种上的应 用奠定了基础。这将为进行不同效应基因的聚合育种奠定基础。
图1利用多重CAPs标记技术对7个番茄杂种一代的电泳检测；注:M :marker ；图2利用多重CAPs标记技术对番茄杂种一代E13的部分自交F2分离世代材料的 电泳检测；注:M :marker ；1 23 :E13的F2I 23 ；
图3利用多重CAPs标记技术对杂种一代AlO的部分自交F2分离世代材料的电泳 检测；注:M :marker ；1 19 杂种一代AlO的F2I 19。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例利用多重CAPs标记技术对7个番茄杂种一代、E13及AlO的部分自交F2 分离世代材料的电泳检测本实例的具体实施步骤是1、材料和方法B08、109、314、198、288为番茄杂交一代。其中B08、109、314、198为感番茄黄化曲
叶病毒病品种，288为抗番茄黄化曲叶病毒病品种。E13:番茄优良杂种一代，引自荷兰，该 品系红果，耐贮运，抗番茄黄化曲叶病毒病。A10:番茄优良杂种一代，引自韩国。该品种红 果，耐贮运，感番茄黄化曲叶病毒病。分别对E13和AlO套袋自交，获得高度分离的F2后代 群体，或者为E13和AlO高度分离的回交后代群体。2、利用CAPs分子标记辅助选择方法，从上述育种分离世代材料中检测其抗感基 因型。(1)从上述番茄材料中提取DNA。将杂种一代材料、E13及AlO的部分自交F2分离世 代材料播种于育苗床，待幼苗长出3 4片真叶时，每个植株分别取一片幼叶，用CTAB的方 法提取DNA。然后移栽到秋季发病严重的地块进行抗病性鉴定。CTAB的提取方法如下(1) 取少量的植株叶片于1. 5ml Eppendorf管中，放液氮中速冻15秒，加入100 μ ICTAB缓冲液 和少量石英砂，研磨成勻浆。⑵加入500 μ 1 CTAB缓冲液，65°C保温35-40min，中间摇晃混 勻。(3)加入等体积的24 1的氯仿异戊醇(v/v)，轻轻颠倒混勻5min，4°C 15000rpm离 心lOmin，将上清转到新管中，加入2/3体积的异丙醇。(4)室温下放置5min，4°C 1500rpm, 离心lOmin，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2_3次。弃上清，进行真空干燥，向每个样品中 加入50 μ 1灭菌双蒸水和适量的RnaSe，37°C消化lh，保存于_20°C备用。(2)对番茄材料进行多重PCR扩增；根据已经发表的文献资料(Ana Perez de Castro, JoseMiguel Blanca, Maria JoseDiez,Fernando Nuez Vin-als. Identification of a CAPS marker tightly linked to the Tomato yellow leaf curl disease resistance gene Ty-I in tomato. Eur J Plant Pathol. 2007，117 :347_356)，合成引物后进行PCR扩增。多重PCR反应体系20 μ 1，1 倍反应缓冲液，2. OmM MgCl2,0. 1 μ M上下游引物，0. 2mM dNTPs，0. 04U的Taq聚合酶及20ng 的模板DNA补充ddwater至20 μ 1。PCR扩增程序为94°C 5分钟，然后94°C 1分钟，54°C 1分 钟，720C 2分钟，35个循环，72°C延伸10分钟。检测Ty-I基因位点的上下游引物序列分别为 JB-Iupper 5' -AAC CAT TAT CCG GTT CAC TC-3'禾口 JB-1 lower 5' -TTT CCA TTC CTT GTT TCTCTG-3'所示，检测根结线虫抗性位点的上下游引物序列分别如Mi upper 5' -TCG GAGCCT TGG TCT GAA TT—3'禾口 Mi lower 5' -GCC AGA GAT GAT TCG TGA GA—3'。所述的番茄材料为番茄杂交一代FpE13及AlO的部分自交F2分离世代材料，或者 为E13和AlO高度分离的回交后代群体。(3) DNA的多重PCR扩增产物酶切及电泳分析检测；
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将多重PCR扩增结果用taql酶进行酶切。根据PCR扩增及酶切结果所显示的纯 合和杂合带型及人工苗期接种鉴定结果，确定抗Ty-I及Mi基因的分子标记。酶切体系为 20μ 1，其中含7μ 1 PCR扩增产物，IOU taql，21反应缓冲液。65°C 1. 5h。PCR扩增及酶切 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行电泳分离分析，EB染色，然后在Bio-rad的凝胶成像仪上 成像。(4)依据检测结果对材料进行抗性评价。依据酶切结果的带型对育种分离世代材料抗感基因型进行评价。若酶切带型中 只含有400bp的特异条带，为感番茄黄化曲叶病毒病纯合基因型材料，若酶切带型中含有 500bp和400bp的特异条带，为抗番茄黄化曲叶病毒病材料；若含有570bp和ISObp的特异 条带，为抗根结线虫病纯合基因型材料；若含有750bp，570bp，ISObp的特异条带，为抗根结 线虫病杂合基因型材料；若只产生750bp的特异性条带，无TaqI酶切位点，为感根结线虫病 纯合基因型材料。3、结果分析如附图1所示，杂交一代的肌8、109、314、198、六10只产生约40(^ 的特异条带， 为感番茄黄化曲叶病毒病的基因纯合型材料；E13和288产生500bp和400bp的特异条带， 为抗番茄黄化曲叶病毒病的材料。对Mi的抗性来说，图1的酶切结果显示E13和198产 生570bp和180bp的特异条带，为抗根结线虫病纯合基因型材料；288和AlO产生750bp， 570bp，180bp的特异条带，为抗根结线虫病杂合基因型材料；B08、109和314只产生750bp 的特异性条带，无TaqI酶切位点，为感根结线虫病纯合基因型材料。JB-I标记可以用来检测番茄植株的Ty-I基因的抗感基因型。如附图2所示， JB-IPCR产物的酶切结果显示，2，3，4，7,8,9,10，11，12，13，15，16，18,23个单株的酶切结 果产生了约400bp和500bp的特异条带；6，14，20，21，22酶切产生了约400bp的特异条带 (图2)。此结果表明，JB-IPCR产物酶切结果只产生约400bp的特异条带的材料即第6，14， 20，21，22单株属于感番茄黄化曲叶病毒病纯合基因型材料，而JB-IPCR产物酶切结果产生 400bp和500bp的特异条带的材料即第2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，15，16，18，23单株属于 抗番茄黄化曲叶病毒病材料。从E13的F2代Mi的酶切结果来看，E13共23个材料，全部产生570bp和180bp的 特异条带，为含Mi的抗病纯合基因型材料(图2)。在AlO的F2代群体中，PCR产物酶切结果只产生约400bp的特异条带的材料属于 感病纯合基因型材料，后代单株在该位点没有产生分离(图3)。AlO 共 19 个材料，其中 1,4,5,6,7,8,9,10，11，13，16，19 单株产生 750bp，570bp， 180bp的特异条带的单株为含Mi的抗病杂合基因型材料；3，15，17，18产生570bp和180bp 的特异条带的植株为含Mi的抗病纯合基因型材料；2，12，14单株无Taq I酶切位点，只产 生750bp的特异条带，为不含Mi的感病纯合基因型材料(图3)。经反复验证，结果可靠。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
一种番茄抗黄化曲叶病毒病及根结线虫的分子标记辅助选择方法，其特征在于，包括以下步骤(1)从番茄材料F1和自交分离后代F2单株提取DNA；(2)对番茄材料F1和自交分离后代F2进行多重PCR扩增；(3)多重PCR扩增产物的酶切及电泳分析检测；(4)依据检测结果对育种分离世代材料进行抗性评价。
2.根据权利要求1所述的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤(1)提取DNA 的方法为将番茄材料F1和自交分离世代材料F2播种，待幼苗长至3 4真叶时，每植株取 1片幼叶，用改进的CTAB方法提取DNA。
3.根据权利要求1所述的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体方 法为合成引物，进行PCR扩增，并用taql酶进行酶切；根据PCR扩增及酶切结果所显示的 纯合和杂合带型，与人工苗期接种鉴定结果进行比较，确定抗Ty-I及根结线虫基因的分子 标记；其中检测Ty-I基因的上下游引物序列分别为JB-I upper 5' -AACCAT TAT CCG GTT CAC TC-3'禾Π JB-I lower 5' -TTT CCA TTC CTT GTT TCT CTG-3‘，根结线虫的上下游 引物序列分别为 Mi upper 5' -TCG GAG CCT TGG TCT GAA TT-3'和 Mi lower 5' -GCC AGA GAT GAT TCG TGA GA-3'。
4.根据权利要求1所述的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体 方法为多重PCR反应体系20 μ 1，1倍反应缓冲液，2. OmM MgCl2,0. 1 μ M上下游引物，0. 2mM dNTPs，0. 04U的Taq聚合酶及20ng的模板DNA补充ddwater至20 μ 1 ;PCR扩增程序为 940C 5分钟，然后940C 1分钟，54°C 1分钟，72°C 2分钟，35个循环，72°C延伸10分钟；酶切 体系为20 μ 1，其中含7 μ 1 PCR扩增产物，IOU taql，2 μ 1反应缓冲液；65°C 1. 5h ；PCR扩增 及酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行电泳分离分析，EB染色，然后在Bio-rad的凝胶成 像仪上成像。
5.根据权利要求1所述的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述步骤(4)的评价方 法为若酶切带型中只含有400bp的特异条带，为感Ty-I纯合基因型材料，若酶切带型中含 有500bp和400bp的特异条带，为抗Ty-I材料；若含有570bp和ISObp的特异条带，为抗根 结线虫病纯合基因型材料；若含有750bp，570bp，ISObp的特异条带，为抗根结线虫病杂合 基因型材料；若只产生750bp的特异性条带，无TaqI酶切位点，为感根结线虫病纯合基因型 材料。
6.根据权利要求1所述的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述的分离世代材料 为高度分离的杂交后代群体或者高度分离的回交后代群体。
7.根据权利要求2所述的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述的CTAB法提取的 DNA为，配制CTAB缓冲液(1)取少量的植株叶片于1. 5ml Eppendorf管中，放液氮中速冻 15秒，加入100 μ 1 CTAB缓冲液和少量石英砂，研磨成勻浆；⑵加入500 μ ICTAB缓冲液， 65°C保温35-40min，中间摇晃混勻；(3)加入等体积的24 1的氯仿异戊醇(ν/ν)，轻轻 颠倒混勻5min，4°C 15000rpm离心lOmin，将上清转到新管中，加入2/3体积的异丙醇；(4) 室温下放置5min，4°C 1500rpm，离心lOmin，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2-3次；弃上 清，进行真空干燥，向每个样品中加入50 μ 1灭菌双蒸水和适量的RnaSe，37°C消化lh，保存 于-20°C备用。
全文摘要
本发明公开了一种番茄抗黄化曲叶病毒病及根结线虫病的分子标记辅助选择方法，其特征在于，包括以下步骤(1)从番茄材料F1和自交分离后代F2单株提取DNA；(2)对番茄材料F1和自交分离后代F2进行多重PCR扩增；(3)依据检测结果对育种分离世代材料进行抗性评价。多重PCR的扩增方法，可以在同一反应体系中同时扩增Ty-1基因及Mi基因，这样大大简化了实验操作和实验花费，适合于对大量样本材料进行鉴定和分析，大大缩短时间和减少工作量。
文档编号C12Q1/68GK101948918SQ201010273248
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者孟焕文, 崔鸿文, 房玉林, 杜俊娜, 程智慧, 陈书霞 申请人:西北农林科技大学