专利名称：银杏叶片完整叶绿体的提取方法
技术领域：
本发明涉及木本植物银杏叶片的完整叶绿体提取及分离技术，属于生物化学技 术领域。
背景技术：
縣、GinkgobilobaL.),是现有种子植物中最古老的孑遗植物，也是起源于中 国的特有珍贵树种，为我国二级保护植物，在学术界一向称银杏为“活化石”。我国 是银杏的故乡，现有资源占世界银杏资源70%以上。银杏叶片的药用价值近年来一直 受到国内外的高度重视，从银杏叶片中提取的活性物质具有软化血管、防止动脉硬化、 清除血液脂肪垃圾、抑制血小板凝聚、防止脑血栓形成的良好作用，并具有防止中老年 痴呆、视网膜距离改变，增强免疫力，延缓衰老等强大功能w。银杏集食用、药用、保 健、化妆、用材、绿化、观赏于一体，是一种重要的经济树种。由于银杏具有许多原始 特性，正吸引科学家们从不同方面对其进行研究。目前国内外的研究方向主要分为系统 进化和叶片的药用价值。而叶绿体是植物通过光合作用还原和同化二氧化碳、形成碳水 化合物的场所，同时也是植物次生物质代谢的场所，是植物叶片细胞中重要的细胞器。 而植物的叶绿体DNA是相对保守的序列，采用叶绿体DNA作为研究对象相对于细胞 DNA对于进化和分类结果更为准确。目前发现在银杏叶绿体当中含有与其次生代谢物合 成有关的酶类，因此对其叶绿体进行研究将有助于我们揭示其次生代谢物的合成机理， 并进一步从分子水平对其叶绿体进行遗传改良以提高其次生代谢物的产量提供基础。目前植物叶绿体提取的方法多是离心的方法，但是不同材料所需要的离心条件 和提取介质则各不相同[2_5]，因此，目前植物叶绿体提取的方法还没有一个普遍通用的方 法。也就是一类材料要研制一种特定的提取方法，这个研制的周期至少在3个月或者更 长，而且目前提取植物叶绿体的成功报道也多是草本植物，而木本植物的并不多，特别 对于有较高次生代谢物质含量的木本植物，在叶绿体提取过程中次生代谢物质的外溢也 对叶绿体的完整性有较大的影响，因此，作为含有较多的次生代谢物质药用木本植物， 如银杏叶绿体的提取一直是一个技术难点，目前还没有关于其完整叶绿体提取方法的报 道。该技术瓶颈一方面严重限制了进一步揭示其叶绿体的生理生化和分子生物学的基 础研究的发展，而且也阻碍了未来很多中国特有药用木本植物活性物质开发的产业化进 程。参考文献张富捐.银杏叶活性成分的提取与研究进展.许昌师专学报,2002,21(5) :18-22叶济宇，赵海英.完整叶绿体的快速制备及其完整率的测定.植物生理学通讯， 1982， 1:59-61MarionKugler, Lothar Jansch, Volker Kruft, Udo K. Schmitz, Hans-Peter Braun. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE)。Photosynthesis Research, 1997, 53: 35—44[4]李贝贝，郭进魁,周云,张珠珠,张立新.一种分析叶绿体类囊体膜色素蛋白复合物 的蓝绿温和胶电泳系统.生物化学与生物物理进展,2003, 30 (4) :639-643陈云伟，张年辉，赵云，杜林方，MasatoNAKAI.油菜叶绿体被膜的制备和Toc33的 检测.植物生理学通讯，2004,40 (2) :223-225。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高得率的富含次生代谢物的药用木本植物的完整叶 绿体的提取方法，以克服该种植物叶绿体提取困难、得率不高和叶绿体完整度不高的缺 陷，从而建立一种得率高于80%的药用木本植物完整叶绿体的提取方法。本发明所采用的技术方案是
一种银杏叶片完整叶绿体提取技术，包括以下步骤
1)选用发育成熟的银杏叶片作为提取材料；
2)Percoll梯度液的制备将Percoll和2X叶绿体悬浮液按等体积混合均勻，并用 垂直转子经38000g，4°C离心45min制造其梯度，放于4°C备用；所说的叶绿体悬浮液的 组成为20mM Tricine-KOH,0.3M 山梨醇，5mM MgCl2 6H20, 2.5mM EDTA-Na2 ；
3)将叶片剪碎，在叶绿体粗提液中勻浆，勻浆后过滤；
4)滤液经2070g，4°C离心2min，沉淀即叶绿体粗颗粒；
5)将叶绿体粗颗粒悬浮于叶绿体悬浮液中，并缓慢的加入步骤2)的Percoll梯度 上，用水平转子经13300g，4°C离心lOmin，离心后离心管下部得到墨绿色沉淀；
6)取出离心管中墨绿色沉淀用叶绿体悬浮液通过离心的方式对其进行漂洗， 2070g, 4°C离心2min，重复3_4次，所得沉淀即为完整叶绿体；
以上步骤2) -6)的所有操作均需在0-4°C。一种优选的方案是，上述方法是步骤4)为滤液经200&在41离心2min，去 掉沉淀中富含的褐色杂质，上清经2070g，4°C离心2min，沉淀即叶绿体粗颗粒；
步骤5)为将叶绿体粗颗粒悬浮于叶绿体悬浮液中，并缓慢的将其加入到步骤2) 的Percoll梯度上，用水平转子经lOOOOg，4°C离心IOmin ；离心后离心管中下部得到墨绿 色沉淀。本发明方法中，步骤5)中离心时加速及下降的级别优选2级。本发明方法中，步骤3)中叶片与叶绿体粗提液的质量体积比为lg: 6ml。本发明方法中，步骤5)中含叶绿体粗颗粒的叶绿体悬浮液与Percoll梯度液的 体积比是1:5。本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果
本研究以富含次生代谢物的药用木本植物银杏叶片为材料，采用离心的方式获得一 个连续的Percoll梯度作为离心介质，使得分离介质的梯度变得更加均勻，减少更多的杂 质停留在叶绿体颗粒中。使银杏叶片细胞中大量的次生代谢物与叶绿体分离开来，提高 了叶绿体的分离纯度。在提取过程中通过改变离心条件，从而大大提高了其分离纯度和完整度。在获 得叶绿体粗颗粒之前，以200&在41离心2min，以去掉大量的组织碎片和其他细胞器， 更进一步提高了其分离的纯度。在密度梯度离心过程中，通过减小转速使完整叶绿体的分离条带更清晰，从而也使叶绿体的完整度大大提高。通过电镜结果显示，我们提取的 叶绿体完整率达80%以上，适用于对其进行细胞生物学、生物化学和分子生物学等的基 础研究。
图1被膜破裂的银杏叶绿体电镜图。图2被膜完整的银杏叶绿体电镜图。图3纯度和完整率较高的银杏叶绿体电镜图。
具体实施例方式本发明中的术语说明如下
Percoll Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone, PVP)处理的硅胶颗粒
混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心 后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。本发明中使用的为购自 Sigma 公司的 Percoll。2X叶绿体悬浮液是指在上述叶绿体悬浮液的基础上浓度增加一倍，即40mM Tricine-KOH,0.6M 山梨醇，IOmM MgCl2 6H20, 5mMEDTA_Na2。1.材料与方法 1.1材料
发育成熟银杏叶片，采自江苏南京师范大学仙林校区。提取溶液和介质
叶绿体粗提液20mM Tricine-KOH CpH 8.4)，0.45 M 山梨醇，IOmM NaHCO3, 1 OmM EDTA-Na2，0.1% BSA ；
叶绿体悬浮液20mM Tricine-KOH CpH 7.6) ,0.3M 山梨醇，5mM MgCl26H20, 2.5mM EDTA-Na2;
Percoll梯度液将Percoll和2X叶绿体悬浮液按等体积混合均勻。提取方法
取100-200g叶片在4°C暗处放置1天，耗尽淀粉粒，用去离子水洗净后擦干，放于 4°C备用。实验前先配制Percoll梯度液，并用垂直转子经38000g，4°C离心45min制造其 梯度，放于4°C备用。将叶片剪碎，在600-1200ml预冷的叶绿体粗提液中勻浆，勻浆2 次每次2秒，时间要尽量的短以保证叶绿体的完整率。勻浆后四层纱布加一层尼龙网过 滤。此后分2种方法离心
(1)滤液经2070g，4°C离心2min，沉淀即叶绿体粗颗粒。将沉淀悬浮于适量的叶 绿体悬浮液中，以备于Percoll梯度离心。将含叶绿体粗颗粒的叶绿体悬浮液缓慢的加入 到准备好的Percoll梯度上(体积比为1 5)，用水平转子经13300g，4°C离心IOmin (缓 慢加速及下降)，取出离心管下部墨绿色区域用叶绿体悬浮液通过离心的方式对上述颗 粒进行漂洗，2070g，4°C离心2min，重复3_4次，所得沉淀即为完整叶绿体。以上所有 操作均需在0-4°C。(2)滤液经200&在41离心2min，去掉沉淀，上清经2070g，4°C离心2min，沉淀即叶绿体粗颗粒。将沉淀悬浮于适量的叶绿体悬浮液中，以备于Percoll梯度离心。 将含叶绿体粗颗粒的叶绿体悬浮液缓慢的加入到准备好的Percoll梯度上(体积比为1 : 5)，用水平转子经lOOOOg，4°C离心IOmin (缓慢加速及下降)，取出离心管下部墨绿 色区域用叶绿体悬浮液通过离心的方式对上述颗粒进行漂洗，2070g，4°C离心2min，重 复3-4次，所得沉淀即为完整叶绿体。以上所有操作均需在0-4°C。完整率的检测
1.4.1 Hill反应速率测定叶绿体完整率
先测定提取的叶绿体的Hill反应速率将Hill反应液(0.05mol/L Tris 一 HCI (pH7.6), 5mmol/L MgCI2, 10mmol/L NaCI, 10mmol/L K3Fe (CN) 2，10mmol/L NH4CI., 0.66mol/L山梨醇溶液，0.5 mol/LKCI溶液)以1:1的体积与0.66mol/L山梨醇 溶液混合，使之保持0.33mol/L山梨醇浓度，再加入叶绿体(每毫升提取液含叶绿素约 50 μ g)，用氧电极测定放氧速率。再测定涨破叶绿体的Hill反应速率将叶绿体溶液与Hill反应液混合使叶绿体被 膜在低渗介质下涨破，再以1:1的体积比与0.66mol/L山梨醇溶液混合，使测定是同样保 持0.33mol/L的山梨醇浓度。在相同条件下测定放氧速率。叶绿体完整率按照如下公式计算
叶绿体完整率(％)=[(涨破叶绿体的放氧速率_完整叶绿体的放氧速率)/涨破的叶绿 体的放氧速率]X 100
1.4.2电子显微镜检测叶绿体纯度及完整率
取提取的叶绿体颗粒用4%戊二醛固定结束后于4°C下保存备用。固定l_2h (4°C) 后用磷酸缓冲液浸洗3次，每次15min,最后装入磷酸缓冲液中4°C备用。用1%溶化的 琼脂预包埋材料，再经脱水、树脂包埋、聚合、切片、染色，最后进行电镜观察。被膜 破裂的银杏叶绿体电镜图如图1所示，被膜完整的银杏叶绿体电镜图如图2所示，纯度和 完整率较高的银杏叶绿体电镜图如图3所示。每次观察选定20个视野，每个视野含叶绿 体大概30个，记录完整和破损的叶绿体的数目，统计计算平均值。2结果与分析 2.1 Hill反应测定结果
用Hill反应测定不同的离心方法得到的完整率如表1所示，采用改进的方法2得到 叶绿体的完整率达到83%。表1不同离心方法Hill反应测定结果
权利要求
1.一种银杏叶片完整叶绿体提取方法，其特征在于，包括以下步骤1)选用发育成熟的银杏叶片作为提取材料；2)Percoll梯度液的制备将Percoll和2X叶绿体悬浮液按等体积混合均勻，并用 垂直转子经38000g，4°C离心45min制造其梯度，放于4°C备用；所说的叶绿体悬浮液的 组成为20mM Tricine-KOH,0.3M 山梨醇，5mM MgCl2 6H20, 2.5mM EDTA-Na2;3)将叶片剪碎，在叶绿体粗提液中勻浆，勻浆后过滤；4)滤液经2070g，4°C离心2min，沉淀即叶绿体粗颗粒；5)将叶绿体粗颗粒悬浮于叶绿体悬浮液中，并缓慢的加入步骤2)的Percoll梯度 上，用水平转子经13300g，4°C离心lOmin，离心后离心管下部有墨绿色沉淀；6)取出离心管中墨绿色沉淀用叶绿体悬浮液通过离心的方式对其进行漂洗， 2070g, 4°C离心2min，重复3_4次，所得沉淀即为完整叶绿体；以上步骤2)-6)的操作均需在0-4°C进行。
2.根据权利要求1所述的银杏叶片完整叶绿体提取方法，其特征在于，步骤4)为 滤液经200&在41离心2min，去掉沉淀中富含的褐色杂质，上清经2070g，4°C离心 2min,沉淀即叶绿体粗颗粒；步骤5)为将叶绿体粗颗粒悬浮于叶绿体悬浮液中，并缓慢的将其加入到步骤2) 的Percoll梯度上，用水平转子经lOOOOg，4°C离心IOmin ；离心后离心管下部得到墨绿色 沉淀。
3.根据权利要求1所述的银杏叶片完整叶绿体提取方法，其特征在于，步骤3)中叶 片与叶绿体粗提液的质量体积比为Ig 6ml。
4.根据权利要求3所述的银杏叶片完整叶绿体提取方法，其特征在于，步骤5)中含 叶绿体粗颗粒的叶绿体悬浮液与Percoll梯度液的体积比是1 5。
全文摘要
本发明为一种高得率的富含次生代谢物质的药用木本植物银杏完整叶绿体提取技术，属于生物化学领域。本发明方法是采用特定生育期的银杏叶片，先制得叶绿体粗颗粒，再通过对Percoll梯度离心，用特定的离心力，获得叶绿体。本发明可以有效的增加叶绿体提取的纯度和完整度。采用本方法获得的银杏叶绿体完整率达80%以上，且提取的叶绿体当中没有其他杂质。该叶绿体颗粒适用于进行细胞生物学、生物化学和分子生物学等方面的基础研究。
文档编号C12N9/00GK102021150SQ20101055772
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者陈国祥, 魏晓东 申请人:南京师范大学