专利名称：一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法
技术领域：
本发明涉及一种铁皮石斛种苗生产方法，尤其涉及一种铁皮石斛组培菌根化种苗 生产方法。
背景技术：
铁皮石斛iPendrobium officinale Kimura et Migo)属珍稀濒危高附加值药材， 其养生保健治疗效果确切，在《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目》、《现代中药大辞典》、2010 年版《中华人民共和国药典》等医药典籍中均有记载。唐开元年道家经典著作《道藏》收录 中华九大仙草(铁皮石斛、天山雪莲、三两重人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山 灵芝、海底珍珠、冬虫夏草)，因铁皮石斛滋阴补虚效果显著，被列为“中华九大仙草”之首 位。李时珍《本草纲目》记载“强阴益精。久服，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮 肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱，定智除惊，轻身延年。益气除热，健阳，逐皮肤风痹，骨中久冷， 补肾益力。治发热自汗，痈疽排脓内塞。”在2010年版《中华人民共和国药典》一部中单列， 与其它环草石斛、马鞭石斛、黄草石斛、金钗石斛和鼓槌石斛等普通石斛种类区分，其功能 与主治“益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。”
因属濒危、珍稀、高附加值的资源性药材，铁皮石斛被列入《国家重点保护野生药材 物种名录》(1987年)、《中国植物红皮书》(1992年)、《濒危野生动植物种国际贸易公约》 (CITES)附录II。2010年，铁皮石斛生产技术及产业化再次被列入国家重点新产品计划和 国家火炬计划的优先发展技术领域。铁皮石斛作为一种常用中药材，市场需求量较大，如何 解决需求与资源之间的矛盾惟一的途径是人工栽培，采用植物组培技术。随着组织培养技 术的发展和应用，铁皮石斛的组培技术已经基本成熟，但是组培无菌苗移入自然条件下成 活率低，易染杂菌，这些都和缺少与之共生的菌根真菌有关。在自然状态下，兰科植物要与 真菌共生形成菌根，才能使兰科植物健壮的生长。根据这个特点，我们自1992年开始从事 铁皮石斛菌根真菌的分离、培养及铁皮石斛组培苗的菌根化方法的研究。
发明内容
本发明目的在于提供一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，使用该方法不仅促 进铁皮石斛组培种苗生长，而且组培苗明显粗壮，种植成活率高。本发明采用的方法是先分别培养菌根真菌和细菌，再将菌根真菌及细菌与铁皮石 斛茎诱导出的原球茎小芽共生培养，具体方法如下
(1)菌根真菌的培养
将菌根真菌LPl菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于PDA平皿中，于 23^280C (优选M 26°C)恒温培养1(T15 d (优选1广13 d)，在菌落边缘打孔成菌片(优选 Φ =8 mm)，并以小块接入固体培养基或液体培养基；菌根真菌LPl为毛壳菌属ijOhaetomium 印.)，该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CPCC 480286 ；
菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素，由选自原料棉籽壳、木屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成，加水，水量为原料的15(T200 wt%(优 选16(T180 wt%)；高压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 g培养基接2 3片 菌片；真菌用试管、锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时 取出备用；
菌根真菌的液体培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物；菌根真菌的液体培 养基用水配制，其中葡萄糖If 22 g/L(优选20 g/L)，KH2PO4 18^22 g/L(优选20 g/L)， MgSO4 1.2 1.8 g/L(优选1.5 g/L)，维生素B1 8 12 mg/L(优选10 mg/L)，天然物麦麸 25 35 g/L (优选30 g/L)(煮汁)或马铃薯180 220 g/L (优选200 g/L)(使用其浸出 液)，培养基PH值为5.6飞.5(优选？!1=6.0)；高压灭菌后接入经培养所得菌根真菌LPl，每 100 mL培养基接入广2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通气暗培养，盛装量为50%，置于 23 25°C振荡，转速10(T120 rpm，培养2(T30 d后收获；培养结束后得到液态菌根真菌，可 直接使用或用勻浆机打碎培养产物备用； (2)菌根细菌的培养
配制无氮培养基葡萄糖8 12g/L (优选10 g/L)，NaCl 0. 18 0. 22 g/L (优选0. 2 g/ L)，KH2PO4 0. 18 0. 22 g/L (优选 0. 2 g/L)，CaSO4 · 2H20 0. 08 0. 12g/L (优选 0. 1 g/L)， MgSO4 0. 18 0. 22g/L (优选 0. 2g/L)，CaCO3 4 6 g/L (优选 5 g/L)，其余为水；调节 pH 值为 6.纩7.2(优选7.0)，于120°C高压灭菌20 min后，放入4°C冰箱备用，保存不超过半年；
将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于上述配制的无氮培养基中， 20 30°C水浴静止培养16 h，或者20 30°C (优选25°C )水浴摇床，转速100 120 rpm 培养8 10 h (优选9 h)；菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter印.)，保藏于中国林业微生 物菌种保藏管理中心，保藏编号为CFCC1605 ； (3)铁皮石斛组培苗培养 本步骤在培养室中培养，温度为23 27°C，采用组培特定光谱节能灯(红光波长 640^650 nm，蓝光波长450 460 nm)作为光源，每天光照10 14 h (优选12 h)；取野生 的生长一年的铁皮石斛的茎进行灭菌处理，将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段，接种于诱 导培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L，诱导茎节发芽；将芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导出大量原球茎；将原球茎接种于培养基(1/2_1)N6+BA 1.5 mg/ L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，诱导原球茎分化成小芽；将小芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中，在此培养基中同时加入备好的液体菌 根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L，以及细菌培养液广2 mL/L，在此培养 基中小芽生长成小植株；再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖 3 wt%+液体菌根真菌1. 5 3. 0 mL/L或固体菌根真菌1. 5 3. 0 g/L+细菌培养液广2 mL/L, 其pH=5. 8，待小芽生长成中植株；最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香 蕉汁+3 wt%蔗糖+液体菌根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L+细菌培养 液广2 mL/L，其pH=5. 8，待中植株生长成大植株； (4)组培苗的水培炼苗
营养液由以下组分构成硝酸钾1. 0 1. 2 wt%o (优选1. 1 wt%o)，硫酸铵0. 18 0. 22 wt% (优选 0. 2 wt% )，硝酸铵 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 1 wt%。)，硫酸镁 0. 1 0. 14 wt% (优选 0. 12 wt% )，磷酸二氢钾 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 10 wt%。)，氯化钙0. 04 0. 08 wt% (优选 0. 06 wt% )，硫酸锰 0. 01 0. 03 wt%。(优选 0. 02 wt%。)，硫 酸亚铁 0. 02 0. 04 wt% (优选 0. 03 wt% )，硫酸锌 0. 004 0. 006 wt%。(优选 0. 005 wt%。)，其余为水；
将得到的铁皮石斛培养苗取出，用15 20°C (优选17°C)的清水冲洗，浙去多余水分， 栽种于架在营养液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，将营养液注入营养液槽中，使营养 液浸没根系的40飞0%，开动营养液槽的循环水泵，流速4飞m/s;通风，风速0.3 0.5 m/s, 进行种苗炼化；1圹22 d后，铁皮石斛种苗根系发达，再生根增多，茎长长增粗，叶片变绿，变 厚，即可以拔出进行大田移栽。采用本发明提供的铁皮石斛组培菌根化苗的生产方法，不仅促进铁皮石斛组培种 苗生长，而且组培苗明显粗壮。移栽后，成活率可达95%以上，生长量大，新芽分蘖多且长势 迅猛，抗逆性强。与不接菌根真菌和细菌组培的铁皮石斛苗对照组相比，接菌的铁皮石斛苗 比对照植株根系发达，植株节间明显膨大，鲜重有所提高，一般提高1(Γ20%。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行进一步说明。实施例1
(1)菌根真菌的培养
本实施例采用菌根真菌LPl自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，转接与PDA平皿 中，25°C恒温培养12 d时，用Φ=8 mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，以小 块接入固体培养基；
真菌菌株培养采用固体培养，菌根真菌的固体培养基原料采用棉籽壳与阔叶树锯末按 重量比1:1混合，加水量为原料的170 wt%;高压灭菌后分别接入上述真菌，每100 g培养 基接2片菌片(Φ=8 mm)；真菌用锥形瓶静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取 出，得到固体菌根真菌；
(2)菌根细菌的培养
配制无氮培养基葡萄糖 10 g/L，NaCl 0. 2 g/L，KH2PO4 0. 2 g/L，CaSO4 · 2H20 0. 1 g/ L，MgSO4 0. 2 g/L, CaCO3 5 g/L，其余为水，调节pH值为7. 0，于120°C高压灭菌20 min后， 放入4°C冰箱备用，保存不超过半年；
将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于上述配制的无氮培养基中， 25°C水浴摇床，转速120 rpm，培养9 h ；菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter印.)，目前 保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CFCC1605 ；
(3)铁皮石斛组培菌根化苗的生产
本步骤在培养室中培养，温度为25士 1°C，采用组培特定光谱节能灯(红光波长645 nm，蓝光波长455 nm)作为光源，每天光照12 h ；取野生的生长一年的铁皮石斛的茎进行 灭菌处理，将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段，接种于诱导培养基(1/2-1)Ν6+ΒΑ 2.5 mg/ L，诱导茎节发芽；将芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导出大量 原球茎；将原球茎接种于培养基(1/2-1) N6+BA 1.5 mg/L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，诱 导原球茎分化成小芽；将小芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中，在此培养基中同时加入备好的固体菌根真菌2. 0 g/L,以及细菌培养液2. 0mL/L，在此培养基中小芽生长成小植株；再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖3 wt%+固体菌根真菌2. 0 g/L+细菌培养液2. 0 mL/L,其pH=5. 8，待小芽 生长成中植株；最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香蕉汁+3 wt%蔗糖 +固体菌根真菌2. 0 g/L+细菌培养液2. 0 mL/L，其pH=5. 8，待中植株生长成大植株； (4)组培苗的水培炼苗
按如下比例配制营养液硝酸钾1. 1 wt%。，硫酸铵0. 2 wt%。，硝酸铵0. 1 wt%。，硫酸镁 0. 12 wt%。，磷酸二氢钾0. 10 wt%。，氯化钙0. 06 wt%。，硫酸锰0. 02 wt%。，硫酸亚铁0. 03 wt%。，硫酸锌0. 005 wt%。，其余为水；
将得到的铁皮石斛培养苗取出，用17士 1°C的清水冲洗，浙去多余水分，栽种于架在营 养液槽上的打好小孔(Φ=5 mm)的泡沫板(厚5 mm)的孔隙中，将营养液注入营养液槽中， 使营养液浸没根系的50%，开动营养液槽的循环水泵，流速5米/秒；通风，风速0.4 m/s，进 行种苗炼化；19 d后，铁皮石斛种苗根系发达，再生根增多，茎长长增粗，叶片变绿，变厚，即 可以拔出进行大田移栽。实验设置对照组和接菌组，对照组植株生长过程不添加菌根真菌和细菌，其余所 有步骤与接菌组相同。实验结果如表1。实施例2
本实施例基本操作同实施例1，不同之处是
1、本实施例用的菌株LPl真菌菌株，不采用DP6细菌菌株。2、菌根真菌采用液体培养培养基。培养基的配制用水配制，葡萄糖20 g/L,KH2PO4 20 g/L, MgSO4 1. 5 g/L，维生素 B1 10 mg/L，天然物麦麸 30 g/L (煮汁)，培养基 pH=6. 0。 高压灭菌后接入上述真菌，每100 mL培养基接入2片菌片(φ=8 mm)。真菌用三角瓶振荡 通气暗培养，三角瓶装量50%，转速100 rpm，25°C培养25 d收获。培养结束后用勻浆机打 碎培养产物，得到液体菌根真菌。铁皮石斛组培菌根化苗的生产过程中菌根真菌添加为液体菌根真菌2 mL/L。实验设置对照组和接菌组，对照组植株生长过程不添加菌根真菌和细菌，其余所 有步骤与接菌组相同。实验结果如表1
权利要求
1. 一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，其特征在于步骤如下(1)菌根真菌的培养将菌根真菌LPl菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于PDA平皿中，于23l8°C 恒温培养1(T15 d，在菌落边缘打孔成菌片，并以小块接入固体培养基或液体培养基；菌根 真菌LPl为毛壳菌属ifhaetomium印.)，该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中 心，保藏编号为CPCC 480286 ；菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素，由选自原料棉籽壳、木 屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成，加水，水量为原料的15(Γ200衬％;高 压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 g培养基接2 3片菌片；真菌用试管、 锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；菌根真菌的液体培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物；菌根真菌的液体培 养基用水配制，其中葡萄糖If 22 g/L(优选20 g/L)，KH2PO4 18^22 g/L(优选20 g/L)， MgSO4 1.2 1.8 g/L(优选1.5 g/L)，维生素B1 8 12 mg/L(优选10 mg/L)，天然物麦麸 25 35 g/L (优选30 g/L)(煮汁)或马铃薯180 220 g/L (优选200 g/L)(使用其浸出 液)，培养基PH值为5.6飞.5(优选？!1=6.0)；高压灭菌后接入经培养所得菌根真菌LPl，每 100 mL培养基接入广2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通气暗培养，盛装量为50%，置于 23 25°C振荡，转速10(T120 rpm，培养2(T30 d后收获；培养结束后得到液态菌根真菌，可 直接使用或用勻浆机打碎培养产物备用；(2)菌根细菌的培养配制无氮培养基葡萄糖 8 12g/L，NaCl 0. 18 0. 22 g/L, KH2PO4 0. 18^0. 22 g/L, CaSO4 · 2H20 0. 08 0. 12g/L, MgSO4 0. 18 0. 22g/L, CaCO3 4 6 g/L，其余为水；调节 pH 值为 6. 9^7. 2，于120°C高压灭菌20 min后，放入4°C冰箱备用，保存不超过半年；将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于上述配制的无氮培养基中， 20 30°C水浴静止培养16 h，或者20 30°C水浴摇床，转速100 120 rpm培养8 10 h ； 菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter印.)，保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保 藏编号为CFCC1605 ；(3)铁皮石斛组培苗培养 本步骤在培养室中培养，温度为23 27°C，采用组培特定光谱节能灯(红光波长 640^650 nm，蓝光波长450 460 nm)作为光源，每天光照10 14 h (优选12 h)；取野生 的生长一年的铁皮石斛的茎进行灭菌处理，将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段，接种于诱 导培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L，诱导茎节发芽；将芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导出大量原球茎；将原球茎接种于培养基(1/2_1)N6+BA 1.5 mg/ L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，诱导原球茎分化成小芽；将小芽接种于培养基(1/2-1) N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中，在此培养基中同时加入备好的液体菌 根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L，以及细菌培养液广2 mL/L，在此培养 基中小芽生长成小植株；再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖 3 wt%+液体菌根真菌1. 5 3. 0 mL/L或固体菌根真菌1. 5 3. 0 g/L+细菌培养液广2 mL/L, 其pH=5. 8，待小芽生长成中植株；最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香 蕉汁+3 wt%蔗糖+液体菌根真菌1.5 3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5 3.0 g/L+细菌培养液广2 mL/L，其pH=5. 8，待中植株生长成大植株；(4)组培苗的水培炼苗营养液由以下组分构成硝酸钾1. 0 1. 2 wt%o (优选1. 1 wt%o)，硫酸铵0. 18 0. 22 wt% (优选 0. 2 wt% )，硝酸铵 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 1 wt%。)，硫酸镁 0. 1 0. 14 wt% (优选 0. 12 wt% )，磷酸二氢钾 0. 08 0. 12 wt%。(优选 0. 10 wt%。)，氯化钙 0. 04 0. 08 wt% (优选 0. 06 wt% )，硫酸锰 0. 01 0. 03 wt%。(优选 0. 02 wt%。)，硫 酸亚铁 0. 02 0. 04 wt% (优选 0. 03 wt% )，硫酸锌 0. 004 0. 006 wt%。(优选 0. 005 wt%。)，其余为水；将得到的铁皮石斛培养苗取出，用15 20°C (优选17°C )的清水冲洗，浙去多余水分， 栽种于架在营养液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，将营养液注入营养液槽中，使营养 液浸没根系的40飞0%，开动营养液槽的循环水泵，流速4飞m/s;通风，风速0.3 0.5 m/s, 进行种苗炼化；1圹22 d后，铁皮石斛种苗根系发达，再生根增多，茎长长增粗，叶片变绿，变 厚，即可以拔出进行大田移栽。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述将菌根 真菌管经菌种活化后，接于PDA平皿中，于M 26°C恒温培养1广13 d。
3.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述菌根真 菌的固体培养基的加水量为原料的16(T180 wt%0
4.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述菌根真 菌的液体培养基用水配制，其中葡萄糖20 g/L, KH2PO4 20 g/L,MgSO4 1.5 g/L，维生素B1 10 mg/L，天然物麦麸30 g/L(煮汁)或马铃薯200 g/L(使用其浸出液)，培养基pH值为6.0。
5.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述配制 无氮培养基葡萄糖 10 g/L, NaCl 0. 2 g/L, KH2PO4 0. 2 g/L, CaSO4 · 2H20 0. 1 g/L, MgSO4 0. 2g/L，CaCO3 5 g/L，其余为水，调节pH值为7.0。
6.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述菌根细 菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后于无氮培养基中水浴摇床培养时，温度为25°C， 培养9 h。
7.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述铁皮石 斛组培苗培养时，每天光照12 h。
8.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述营养液 由以下组分构成硝酸钾1. 1 wt%。，硫酸铵0. 2 wt%。，硝酸铵0. 1 wt%。，硫酸镁0. 12 wt%0, 磷酸二氢钾0. 10 wt%。，氯化钙0. 06 wt%。，硫酸锰0. 02 wt%。，硫酸亚铁0.03 wt%。，硫酸锌 0.005 wt%。，其余为水。
9.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述组培 苗的水培炼苗时，将前述步骤得到的铁皮石斛培养苗取出，用17°C的清水冲洗，浙去多余水 分。
全文摘要
一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，其步骤分为(1)采用固体或液体培养基对菌根真菌进行培养，菌根真菌采用菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomiumsp.)；(2)菌根细菌的培养，菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobactersp.)；(3)铁皮石斛组培苗培养；(4)组培苗的水培炼苗。采用本发明提供的铁皮石斛组培菌根化苗的生产方法，不仅促进铁皮石斛组培种苗生长，而且组培苗明显粗壮。移栽后，成活率可达95%以上，生长量大，新芽分蘖多且长势迅猛，抗逆性强。与不接菌根真菌和细菌组培的铁皮石斛苗对照组相比，接菌的铁皮石斛苗比对照植株根系发达，植株节间明显膨大，鲜重提高10~20%。
文档编号C12N1/20GK102144540SQ201010581919
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者吴维佳, 崔晓娟, 张苏锋, 李 杰, 梁经军, 赵兴兵, 高正龙, 黄生云 申请人:梁经军