专利名称：猪ERp44基因启动子区转录调控元件的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及ー种猪ERp44基因启动子区的转录调控元件的克隆及功能验证。
背景技术：
内质网蛋白44(ERp44)參与调节细胞内分泌蛋白的正确合成与分泌。ERp44可滞留细胞内的ER01，影响PDI氧化形成ニ硫键。此タト，ERp44还能与免疫球蛋白M亚基、脂联素和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)形成ニ硫键，从而调节其分泌和转运。ERp44在蛋白质的滞留和内质网内的成熟控制中发挥重要作用，它能与IP3R1结合，调节其在内质网内的加工和 Ca2+浓度依赖的分泌调节(Higo et al.，200 。脂联素是由脂肪组织特异分泌的可调节胰岛素敏感性和能量代谢平衡的重要脂肪細胞因子。体内循环系统中的脂联素以高分子量、 低分子量和三聚体等三种主要的形式存在(Sim et al.，2009)。最近的研究发现，ERp44、 EROl-La和GGA能调控脂联素的合成与分泌，而PPAR γ激动剂能増加脂联素的分泌(Wang et al.，2007)，这表明ERp44基因可能受到PPARγ的转录调控，但其分子机制尚不明确。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷。提供ー种猪ERp44基因(GenBank注册号NM_001137629)5’上游转录调控区域，确定猪ERp44基因的启动子区转录调控元件，对研究ERp44在脂肪細胞中的表达调控机制及其与脂联素分泌调节的关联具有重要意义，有助于从分子水平阐明脂联素的系统生理功能，为治疗肥胖和胰岛素抵抗提供相关理论基石出。本发明的另ー个目的在于提供含有上述基因启动子区转录调控元件的载体。实现本发明的技术方案如下申请人:通过克隆技术，从猪基因组获得内质网蛋白ERp44基因启动子转录调控区域，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示的1 1562位(即猪ERp44基因的-1562 -1 位)。为了获得本发明的ERp44基因的表达调控元件，对猪ERp44基因的启动子区的5’ 端逐步缺失，插入到pGL3-BasiC载体，得到一系列表达质粒，利用萤火虫荧光素酶报告基因检测这些质粒在猪肾细胞系IBRS2和小鼠成纤维細胞系NIH/3T3中的转录活性。结果显示，在序列表SEQ ID NO 1所示序列的246 1091位为主要转录活性调控区域(即猪 ERp44 基因的-1317 -472 位)。对SEQ ID NO 1所示序列的M6-1091位为主要转录活性调控区域的序列分析显示该取段序列中包含ー个PPRE位点，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO=I所示的559 582位的DNA片段(即猪ERp44基因的-1004 -981位)。本发明针对该PPRE位点进行了删除或突变，检测其对ERp44基因转录活性的影响。结果显示，上述PPRE位点是PPAR γ 调控ERp44基因表达的关键调控元件，PPARy可与该位点结合抑制ERp44基因的转录，从而促进脂联素的分泌。本发明首次鉴定了猪ERp44基因启动子关键调控元件，对于研究ERp44基因的表达调控机制和脂联素分泌调节具有重要意义。
图1为猪ERp44基因启动子5’逐步缺失质粒在NIH/3T3和IBRS2細胞内的荧光素酶活性分析。图1中(A)为猪ERp44基因启动子不同截短的结构示意图；(B)为猪ERp44 基因启动子不同截短的活性分析。荧光素酶载体瞬时转染到NIH/3T3和IBRS2細胞内， pGL3-Basic作为对照，含有CMV启动子的海肾荧光素酶报告质粒作为内參，反应转染的效率；(C)为不同物种ERp44基因启动子内保守的PPRE位点分析。结果显示，-1317 -472 位的启动子截短载体具有最大的启动子活性，而这ー个区域正好含有推測的在多物种中高度保守的PPRE结合位点(-1004 -981)，说明PPAR γ可能在调节ERp44的转录活性中起作用。图2为PPRE位点缺失时PPAR γ对猪ERp44基因启动子活性的影响。图 2 中ERp44 启动子截短 pGL3_ERp44 (-1317/+180)和 pGL3_ERp44 (-472/+180) 与pcPPAR Y (或对照pcDNA3. 1)共转染NIH/3T3細胞，4 后检测荧光素酶活性。结果显示，共转染PPARy后显著的降低了 pGL-ERp44(-1317/+180)的荧光素酶活性，而 pGL-ERp44 (-472/+180)的活性没有变化，说明猪ERp44启动子-1004 -981位的PPRE结合位点是PPAR γ调控ERp44基因转录必需的调控元件。图3为PPRE位点突变时PPAR γ对猪ERp44基因启动子活性的影响。图3中野生和突变型的ERp44启动子分别于PPARy共转染NIH/3T3細胞，检测启动子活性。保守的PPRE位点如图所示。结果显示，突变PPRE位点后的ERp44启动子活性不再受PPAR γ的抑制，进ー步证实了 ERp44的启动子受到PPAR γ的调控作用。图4为不同浓度PPAR γ对猪ERp44基因启动子活性的影响。图 4 中，分别用 0. 1、0. 5 和 2μ g 的 pcPPAR γ 与 pGL3_ERp44 (-1317/+180)共转染NIH/3T3細胞，检测启动子活性。pcDNA3. I(EV)空质粒作为对照。结果显示，PPARy对 ERp44启动子活性的影响呈现剂量效应，浓度越大时对ERp44的启动子的抑制效果也越显
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书O图5为PPAR γ抑制剂GW9662对猪ERp44基因启动子活性的影响。图5中，NIH/3T3细胞共转染pGL3(-1317/+180)和pcPPAR γ后，分别用或者不用 50ymol/L GW9662处理細胞，24h后检测启动子活性。pcDNA3. 1 (EV)空质粒作为对照。结果显示，PPAR γ抑制剂GW9662可显著抵消PPAR γ对ERp44启动子活性的抑制作用。图6为猪ERp44基因启动子的PPRE位点与PPAR γ的结合实验分析。图6中(A)为在IBRS2細胞和猪脂肪组织中进行ChIP检测；⑶为用10 μ mol/ L的罗格列酮处理IBRS2細胞24h后，进行ChIP检测。总染色质作为阳性对照进行PCR input ；用IgG沉淀的染色质作为阴性对照。结果显示，IBRS2和猪脂肪组织内PPARy都能结合到ERp44的启动子区域上。另外，IBRS2細胞用10 μ mol/L的罗格列酮处理后，能増加 PPARy的结合能力。图7为PPAR γ通过抑制ERp44的转录增加脂联素分泌的分析。
图7中(A)为脂联素稳定转染的HEK293細胞用不同浓度(ΙΟμπιοΙ/L and 50ymol/L)的PPAR γ激动剂罗格列酮处理，1 后，换成无血清培养液，;Bh后，收集培养液进行Wfestern blot。(B)为用定量PCR检测ERp44 mRNA的表达变化。DMSO处理组作为对照。结果显示，細胞内的ERp44表达受到抑制，而脂联素的分泌显著提高。图8为猪ERp44基因启动子区结构示意图。图8中转录起始位点标记为+1(阴影部分)；翻译起始位点加粗显示(五角星)。 推測的转录因子结合位点用下划线突出显示，相应的转录因子在横线下方标记出来。推測的PPRE位点用阴影标记出。启动子截短所用的引物用方框标记。染色质免疫共沉淀(ChIP) 试验所用的扩增引物也在图中用下划线标记。
具体实施例方式实施例1猪ERp44基因启动子的克隆和双荧光素酶报告基因载体的构建以猪肝脏总DNA为模板，利用上游引物5，-GTAGCTGGTGTTCAGGAAATG-3，和下游引物5，-AGTGAGGTCGGGTAAGGATAG-3，扩增猪ERp44基因启动子序列，得到序列表SEQ ID NO 1 所示的序列，序列长度为1742bp。PCR反应体系如下总体积为50μ 1，其中基因组模板DNA 为20ng，2XGC缓冲液I 25 μ L，dNTP终浓度为300 μ mol/L，引物终浓度为0. 3ymol/L, IU LA Taq DNA聚合酶。PCR反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性45s，56°C退火45s，72°C 延伸2min，35个循环；72°C延伸lOmin。扩增到的片段进行TA克隆后测序验证。根据扩增到的猪ERp44基因启动子序列，设计带有酶切位点或者突变位点的引物进行PCR扩增获得不同截短和含有突变位点的启动子区段，反应条件同上。将产物分別回收后通过MluI和XhoI双酶切，插入到pGL3-BasiC载体(Promega)中，测序验证。用于猪 ERp44基因启动子载体构建的引物见表1所示。表1用于猪ERp44基因启动子载体构建的引物设计
权利要求
1.一种克隆的猪ERP44基因启动子区转录调控元件，其核苷酸序列选自下组(1)SEQID NO 1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中发生ー处或多处缺失突变或替换突变的功能的等价物。
2.如权利要求1所述的猪ERp44基因启动子区转录调控元件，其特征在于含有至少ー 个控制ERp44基因表达的调控元件，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中1-1562位所示。
3.如权利要求2所述的猪ERp44基因启动子区转录调控元件，其特征在于所述调控元件的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1中M6-1091位所示。
4.ー种含有荧光素酶报告基因的真核細胞表达载体，其特征在干，它还含有如权利要求1，2和3所述的猪ERp44基因启动子区转录调控元件。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种猪ERp44基因启动子区转录调控元件的克隆及功能验证。首次鉴定了猪ERp44基因启动子区，并将5’端逐步缺失和部分调控元件被改变的启动子序列插入报告基因上游，构建了一系列真核表达质粒，通过转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了猪ERp44基因启动子区的关键转录调控元件，发现转录因子PPARγ可结合到ERp44基因启动子区的调控位点，通过抑制ERp44基因的转录促进脂肪细胞因子脂联素的分泌。本发明对研究ERp44在脂肪细胞中的表达调控机制以及脂联素的分泌调节具有重要意义，有助于从分子水平阐明脂联素的系统生理功能，为治疗肥胖和胰岛素抵抗提供相关理论基础。
文档编号C12N15/113GK102533753SQ201010583790
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者周磊, 杨在清, 陈小冬, 雷霆, 龙勤强 申请人:华中农业大学