一种杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建方法

专利名称：一种杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及微藻基因工程，具体是一种杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建方法，通 过构建杜氏盐藻(以下简称盐藻)叶绿体转化载体，并且转化盐藻，再经同质化筛选，最终实 现盐藻叶绿体转化。
背景技术：
以细胞核为外源基因受体的传统植物基因工程虽己发展趋于成熟并得到广泛应 用，但随着研究的不断深入，人们逐渐认识到对细胞核基因组的遗传转化存在一系列难以 解决的问题例如由于细胞核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整合的拷贝数难 以人为控制，造成外源基因表达效率低，容易出现基因沉默等；同时转入多个基因时操作步 骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，环境安全难以保证。叶绿体转化系统的出现为克服这些困难提供了一个新途径。与核基因转化系统相 比，叶绿化转化系统有以下特点①基因组小，遗传背景清晰。目前已有几十种植物和藻类 的叶绿体基因组全序列被测定，这就为外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基 因组奠定了基础。定点整合有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在 适于表达的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等引起的基因沉默问题，而且简 化了外源基因转化后的筛选工作。例如莱茵衣藻的核基因组为1051Λ，至少有17个连锁群， 上万个基因，这些基因的结构、功能与序列还不清楚；而叶绿体基因组仅为2031Λ，除rrn基 因和trn基因外编码大约100个基因，全序列已测定，基因的背景资料非常清楚，叶绿体转 化载体插入的靶序列非常明确，不会影响其它基因的功能。②外源基因超量表达。由于叶 绿体中DNA分子有多个拷贝，同时叶绿体在细胞中处于相对隔绝状态，对表达产物的积累 有较强的承受能力，目的基因产物的积累不会对细胞的正常功能产生过大影响，因而为外 源基因在叶绿体中的大量表达提供了保障。一系列实验结果表明叶绿体转化系统可以使目 的基因超量表达，蛋白产量比核基因表达高出20倍以上，甚至高达100-300倍。③基因表 达的原核方式。由于叶绿体基因组基因的排列方式、调控方式、G C碱基对含量及翻译所偏 爱的密码子与原核生物类似。因此，对来自原核生物的有重要价值的外源基因，无需改造 和修饰就可以在叶绿体内高效表达，这是核基因转化无法做到的。④利于同时进行多基因 转化。在叶绿体基因组中，许多功能相近的基因聚合在一起，共用同一个启动子，组成多 顺反子，这种结构为在同一启动子的调控之下同时表达多个外源基因提供了可行性。许多 产品和重要性状往往是多基因共同作用的产物，仅转入单个基因难以取得理想效果。核转 化系统转入多个基因操作复杂，工作量大，而且易出现基因沉默。在叶绿体中表达多个 外源基因时可采取“多顺反子”原核表达形式，通过一次转化就可将多个基因引入受体植 物，并由共同的启动子控制，既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共 沉默”。⑤母性遗传，环境安全性高。由于叶绿体基因组小，与核基因组相比非编码区很少，外源片段的随机插入往往 导致自身基因的失活，转化采用同源重组定点整合的形式，需一定长度的同源片段，通过交换定点整合入叶绿体基因组。因为外源基因的插入位点可控，较少发生基因失活、基因沉默 等现象，但因插入位点仅局限于特定的同源区域，使叶绿体基因组转化效率远远低于核基 因组，因此同源片段的选择至关重要，是构建叶绿体转化载体及成功实现转化的一个关键 因素。一般来说需要①适当的同源片段长度。片段过短同源重组发生率低，但片段过长 操作复杂，转入难度大。实验证明，两端同源臂长度均在1 1Λ-2 1Λ左右较好；②选择正确 的插入位点，使外源基因的插入不损伤叶绿体功能或者不影响宿主正常生存；由于叶绿体 在进化过程中有大规模的遗传信息转移或者流失，保留下的几乎全部是与叶绿体的蛋白合 成、DNA复制和光合作用密切相关的重要基因，其破坏将导致细胞的死亡，因此随机插入对 于叶绿体系统是致死性的，合适的插入位点的选择是叶绿体转化的第一关键点，这也是制 约许多植物叶绿体转化载体构建的一大瓶颈。至今为止，高等植物叶绿体转化成功的物种有烟草、拟南芥、水稻、马铃薯等，高 等植物叶绿体转化中亟待解决的技术难点在于叶绿体转化后的同质化问题。在高等植物 的叶肉细胞中含有多个叶绿体，每个叶绿体中又含有多个基因组拷贝。以显花植物为例， 其每个叶肉细胞中约有100个叶绿体，每个叶绿体中又含有100多个质体基因组拷贝。如 何使外源基因完全整合到叶绿体每个DNA拷贝中是目前限制叶绿体转化技术推广应用的 难题之一。与此相对比，低等单细胞绿藻的叶绿体转化后的同质化则相对简便，这与其只具 有单一巨大杯状叶绿体有关，叶绿体占整个细胞的50%左右，包围着细胞核，而且紧贴细胞 膜，便于遗传操作。特别是近年来已有多种单细胞绿藻如衣藻、小球藻、肾藻、盐藻等的叶绿 体全基因组得到了测序，使得合适的同源片段和插入位点的选择成为可能，为单细胞绿藻 的叶绿体转化奠定了坚实的基础。盐藻属绿藻门团藻目，是一种原生质裸露的耐盐单细胞藻，长约6-15 μ m,呈椭圆 形或梨形，无细胞壁只有细胞膜，且有双鞭毛，能在水中游动；有一个大型杯状叶绿体约占 细胞体积的48%左右。该藻的突出优点在于培养条件极其简单，光合自养，抗逆性极佳，可 在0. 05M-5M的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度为10 15%。这是许多其它生物易难以生存 的环境，故其大规模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用开放式培养，因 此大大降低生产成本；而且盐藻本身无毒，富含多种天然维生素，食用价值高，WHO已批准 其为天然胡萝卜素来源的食物添加剂。因此，如果用盐藻生产口服型疫苗或其他口服型药 物，甚至无须纯化即可直接服用，也可大大降低生产成本，是一种理想的新型生物反应器。合适的插入位点和同源序列的选择是构建叶绿体转化载体的关键。外源基因的插 入可能会导致插入区域原有基因的失活，进而影响宿主生存。在以作物改良为目的的叶绿 体转化中，要求同源重组发生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又 不致于破坏插入位点原有基因的功能。为满足这一要求，高等植物的叶绿体转化工作都选 用了相邻的两个基因作为同源重组片段，例如rbcL/aacD，16strnV/rpsl2rps7，psbA/trnK， rpS7/ndhB等。当同源重组发生以后，外源基因定点插入在两个相邻基因的间隔区，保证了 原有基因的功能不受影响。这种方法要求对于叶绿体基因组中两个相邻的转录单位的序列 和结构有明确的研究结果才能选用。另一个实现叶绿体转化的主要因素是叶绿体基因组的同质化程度。同质化过程是 使所有叶绿体基因组都带有目的DNA片段的过程。叶绿体基因组通常以高拷贝数存在，同 时转化所有的基因组几乎是不可能的，极易出现转化的与未转化的叶绿体组成的异质体，无法保证获得的性状稳定遗传下去。因此叶绿体转化所面临的一个关键问题就是去除未转 化的基因组和未转化的叶绿体。这个问题的解决是通过向叶绿体表达载体中加入宿主敏感 的筛选标记基因，转化后在适度的选择压力下多次筛选，淘汰掉未转化的叶绿体，以实现转 化叶绿体基因组的同质化。同质化过程是转化子抗性逐步提高的过程，选择压力过小，不能 去除未转化的叶绿体基因组；选择压力过大，则可能因为宿主的迅速死亡而难以完成转化 后叶绿体基因组同质化过程。在实际工作中用到的筛选标记基因主要有突变型16SrRNA基 因、nptll基因、aadA基因和荧光标记基因等。表达元件的选择也是构建适宜的转化载体和表达外源蛋白的重要影响因素。为 了使外源基因整合进叶绿体基因组后能够高效表达，构建转化载体时，一般选用叶绿体来 源的启动子和终止子。例如，在已有的报道中，常用的启动子是叶绿体的16srRNA基因启 动子ftrn，以及光系统II作用中心蛋白基因的启动子PpsbA等；常用的终止子包括叶绿体 rbcL、ρsbA基因的终止子！"rbcL、TpsbA和叶绿体rpsl6基因的终止子iTrpsie等。

发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术，而专门提供的一种杜氏盐藻叶绿体转化载 体的构建方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的是以光非依赖性的原叶绿素酸酯还 原酶chlN、chlB或者ChlL基因为同源片段，以氯霉素乙酰转移酶CAT基因和除草剂草丁膦 抗性基因bar为筛选标记，并以atpA启动子和rbcL终止子为表达元件构建双交换双筛选 标记的杜氏盐藻叶绿体转化载体。通过基因枪法或者电激法转化盐藻，再经过两步法筛选 实现同质化，达到外源基因在盐藻叶绿体基因组的定点整合，获得稳定表达外源蛋白的叶 绿体转化盐藻藻株。具体包括以下步骤 1)、盐藻培养。2)、光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶基因同源片段的克隆。3)、构建双交换双标记杜氏盐藻叶绿体转化载体。该载体主要特征是含有光非依 赖性的原叶绿素酸酯还原酶基因为同源片段，以抗性基因CAT和bar为筛选标记，并以atpA 启动子和rbcL终止子为表达元件。4)、通过电激法或基因枪法将该叶绿体转化载体导入盐藻。5)、转化藻株的筛选培养。同质化前主要用氯霉素进行筛选，同质化后，用草丁膦 辅助筛选，有利于在较短时间内获得稳定转化株。外源基因的插入可能会导致插入区域原有基因的失活，进而影响藻体生存。在植 物和藻类中，叶绿素的合成有光依赖性和光非依赖性两条途径。在光照条件下，叶绿素的合 成主要通过光依赖性的原叶绿素酸酯还原酶系统(LPOR)催化完成，该途径高度保守，存在 于所有植物和藻类中，是叶绿素合成的主要途径；而除被子植物以外的其他植物和各种藻 类，则在光依赖性的原叶绿素酸酯还原酶系统(LPOR)以外，还存在着光非依赖性的原叶绿 素酸酯还原酶系统(DPOR)，可以在黑暗条件下催化叶绿素合成，该酶由chlN、chlL和chlB 基因编码，三者任一的破坏都可阻断叶绿素在黑暗条件下的合成，但是仍可通过光依赖性 的原叶绿素酸酯还原酶系统(LPOR)进行叶绿素合成，不影响正常生存。
在本发明中，选择杜氏盐藻光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶基因及其侧翼序列 为同源序列，其长度为2-41Λ。适宜的选择标记和选择压力是顺利完成叶绿体基因组同质化，实现稳定转化、提 高转化效率的关键步骤。本发明选择氯霉素抗性cat基因和草丁膦(PPT)抗性bar基因共 同作为筛选标记基因，CAT基因为主要筛选标记基因，而bar基因是辅助筛选标记基因。其 中氯霉素较温和，筛选周期较长，而PPT致死性强，可缩短筛选时间。因此同质化前主要用 氯霉素进行筛选，同质化发生后，用PPT辅助筛选，最终确定稳定转化株。本发明选择来源于盐藻近缘微藻一莱茵衣藻叶绿体的atpA启动子和rbcL终止子 为表达元件，莱茵衣藻是研究光合作用的模式生物，生长速率快，atpA和rbcL基因是光合 作用的关键基因，也是莱茵衣藻中转录最强的基因，可有效实现外源蛋白在叶绿体中的高 效表达。本发明的优点之一是选取DPOR的编码基因chlN、chlL和chlB基因作为同源片 段，DPOR参与黑暗条件下叶绿素的合成，破坏后不影响盐藻正常生存，盐藻仍可通过LPOR 合成叶绿素，但在暗光培养呈黄绿色，可作为转化子的辅助筛选标记。本发明选择氯霉素抗性CAT基因和草丁膦抗性bar基因共同作为筛选标记基因， 既便于叶绿体基因组的同质化，也有利于在较短时间内获得稳定转化株。


图1.双交换双筛选标记杜氏盐藻叶绿体转化载pchlN-CAT-BAR图谱
具体实施例方式下面通过结合实施例详细叙述本发明的具体内容
实施例一、杜氏盐藻叶绿体光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶基因的克隆和载体构 建，此处以chlN基因为例，chlL和chlB基因同源片段的克隆和载体构建与其类似。1、杜氏盐藻的培养
培养基配方如下:NaCl 58. 5 g/L, MgCl2 · 6H20 15g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 2 g/L, CaCl2 0. 151g/L, KNO3 0.5 g/L, NaHCO3 0.043 g/L, KH2PO4 0. 035 g/L，铁盐溶液 10 mL/L，微量元素溶液10 ml/L。铁盐溶液配方=Na2EDTA· 2H20 209 mg/L, FeCl3 · H2O 244 mg/L。微量元素溶液配 方=H3BO3 61 mg/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 38 mg/L, CuSO4 · 5H20 6 mg/L, CoCl2 · H2O 5. 1 mg/ L, ZnCl2 4. 1 mg/L, MnCl2 · H2O 4. lmg/L，用 HCl 调 pH 值到 7. 5,0. 11 MPa 灭菌 20 min。以10%的浓度接种藻液，培养温度25 士 2°C，光照强度3000 lux，光照周期为12 h光照/12 h暗培养。
2、杜氏盐藻叶绿体DNA的提取
取10 ml处于对数生长后期的杜氏盐藻培养液，5000 g 4°C离心5 min，盐藻细胞沉淀 M 350 μ 1 NET (0.1 mol/L NaC 1,50 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris ·Η(Π，pH8. 0)悬浮后， 加入25μ1蛋白酶K (10 mg/ml),25y 1 20% SDS，混勻，55°C水浴2 h后，置于冰上冷却， 加入200μ 1.5 mol/L乙酸钾，冰上静置30 min。12000 g 4°C离心5 min，上清液加入等体
6积的酚/氯仿/异戊醇(25: : 1)，抽提两次，再用等体积的氯仿抽提一次。水相加入2倍 体积的无水乙醇，混勻后置于_70°C，15 min。12000 g 4°C离心10 min，沉淀用70%乙醇洗 涤去盐，真空干燥后溶于30 μ 1双蒸水中。
3、PCR扩增杜氏盐藻叶绿体chlN基因5'序列及3'序列
根据GenBank登录的杜氏盐藻叶绿体基因组全序列(GenBank登录号NC_005353)，合 成如下引物
ChlN5-l 5' -ACAGGAATTCCCCCTTTGGTTTCCCTCA-3'； ChlN5-2 5' -AAGAGAGCTCCTGACCACTATACGGAGC-3'； ChlN3-l 5' -AAGAGCATGCTAACGGTCTTGATTATGC-3'； ChlN3-2 5' -ATGAAAGCTTCCACTGAGGAGGTTCTTT-3'
以上述杜氏盐藻叶绿体基因组DNA为模板，分别以ChlN5-l和ChlN5-2为引物进行PCR 扩增杜氏盐藻叶绿体chlN基因5'序列；以ChlN3-l和ChlN3-2为引物，PCR扩增杜氏盐藻 叶绿体chlN基因3'序列。PCR反应条件为94°C 30 s，55°C 50 s，72°C 120 s，25个循环；将产物克隆到 PMD18-T载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。ChlN 基因 5'序列 CCCCTTTGGTTTCCCTCACGCGATGGACAAAGTCCTAGCCCTTAGGGGTCCGCTAAATTTTATAATTTTTTT
TTTTTTAATTTTTTTTCGGCGGGTCCGTTTTCTTTGAGAAAACGGCCCGCCCGCCCGTGAGGGAAACGTCTCAAAAA AAAATTTCCGAACCCGTGAGGGAAACAACAAAATTGCCCTCATGGGCAACAAAGTTGCCCATGAGGGCAATTAAGTT GTTTTGTCGGCTAAATTGGATTCAAATAAATAAAAAAATCTTTTGTTTGTATATTTGATACAAACAAAAAAAAATTA ATAACATTTTAAACAAAAATATATATACTATTTATGCTAATTACATGAAAAAAAAAAAAATTCGTATTTATTGTATA ATCTAAAATTAAATAAATATAAATTTTTTATTAATTTTTTTATAAGAAATTTCTAAAATTTTATTTAGTTTTCAAAT ATTGAAATAAAATTTGTGTTTGTCCATGTGCACTAAACAATATAAGATATATAAATTTTTTATAAAAAAAAAAACTT TATAACTCAAAAAAAAAACCAAACATTGTAAATTACAACTTTCTCTAAATTTTATGTCAATTCATAAACAGGATAAA AGGATAAAGCAAAAAGCAAAAGCCTACTTAAATAAAAAATAAAATTAGACTTTATTAATAAAAAGGAAAATCAAAAA AGAATGACTAAAAACTGTAACTAAAAGTTTAATTCTTTTTTGAATGAAATTGGAGAAAAATTTTAAAAGAATCGTTT TCAATAATATTTCTCCAAAAACGCTGATTTGCTTTAGGTACTCTATATAATATAATAGATTTAAAAATCACTAATTA CAAAAGTAATATATTAATTATGAGAAAGTATTTTTTTCTCAGTTTAAATATAATTAATTTTTCTTATATTTTATATG GTAATACCATAATAATTTTCTTATAACTTATTATGGTATTACCATATAAAAATATAAAAAGTTATTCACTATGCCAA AGAAGATTGTTTAAAATTGATTTAACTTAAAAATTTTATAAATCTTTATTTCTTTATATATAATTAATAAATTTAAT TATATATAACAAATAACGAAAAAATAAAATTTATTGAAATTAAACTAAAACAAATTATTTATTTTTTGTTGATTTTC TAACCTTATTATTTTCTATTGATTCTAATATTAATGATATTTTTAACCTATGTTGAATAACAATTCTTAAAATAAAA AATTATAATAATAAAAATAATCTCTCGTCGCCGCGCTATTAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAATTAAAA AAAAAAAAATAATTAAAAAAAATAATAATTAAAAAAAATAATAATTAAAAAAATAATAATTAAAAAAAAAATAATTA TTGTATAATTATTTAATAATTTGTGGTTCTATTGAAAAACAGAATCCTCTCAAACGAGGCGGGAGTCGTTTTTAAGT TATTATGACTATAAAAAAATTTCTTATTTTGAAAATTAACTTTGTTAATTTTCTAAGCGGAAAAGAAATTTTTGATT TTTTTACTATTGTCCGCTCCCCTCACGGGCGGGGTCGGTATTTTTCTTATAACCGTTGCGCGAAAAATCCGGCAGTT AAATTAAAACTGTTTGGTTTTCACCGTTTTATATATTTTAAACGCATATCACAAGAGAAAATCTTTCTAAGGTCTGTTTATACAATTTTATTTTATACACTTAAAAATACGTGTTTACGTATTTTTGTTTTATTTTATGTTTAAAAATTGATTA TATTTCGCATTGTGCGGATTGTAATTTTAACTTTATGGTGAAAAACAAAAAAAGATTCCCTCTATTTCAAACTTTTA GAAATTCTTCGTCTATTCCGGCATCGAAAAACTCTGTATTAGAAACAGCTAATCAAAGTATTTCAGTTGAGTCATCA AATGAAACATCTACAGCTGCTCCGTATAGTGGTCAG
ChlN基因3'序列
TAACGGTCTTGATTATGCTTTCACACAAGGTGAAGATACTGTTTTAGCTGCAATGGCACAAAAATGTCCAGC CCGTGAGGGCCGCTTAAAAAATATAAATTTACCTATCGCCCGCTCGGCGATCCGAGCGGACGAGACTTTAAAGTCCG CTCGTACGTCAGTCGAAGATCAAGCGACTAAAACTGTAACATCAAATTCTTCAAATTCCATAAACGCGGACCCGCCT ATAAGTAATAAACAACTAAAAGAACTTGTTCTATTTGGATCATTACCAACTACAATTGCCAATCAATTACAATTAGA ATTAAAACGTCAGGGTATTAATGTATCTGGTTGGTTACCATCTGCACGTTATTCTGACTTACCAGCTTTAGGTGAAA ATGTTTATGTTTGCGGTATTAATCCTTTTTTAAGTCGTACAGCTACTTCTTTAATGCGTCGTCGTAAATGTAAATTA ATTTCTGCTCCTTTTCCTATTGGTCCTGATGGTACTCGCGCGTGGGTTGAAAAAATCTGTAATGTTTTTGGTATTGT TCCTACTGGGTTAGAAGAACGTGAAAAAACGATTTGGACTAATTTAACAGAATCAATTAATTTTATTAAAGGTAAAT CTGTTTTTTTCATGGGGGATAATCTTTTAGAGATTTCATTAGCACGTTTTTTAATCCGTTGTGGAATGGTTGTATAT GAAATTGGTATCCCGTATATGGATAAACGTTTTCAAGCTGGTGAATTGGCTCTACTAGAAAAAACATGTATTAAAAT GAAAGTACCTTTTCCACGTATTGTTGAAAAACCTGATAATTATTACCAAATCCAACGTATTAAAGAATTAAAACCAG ATTTAGTAATAACTGGAATGGCACATGCTAACCCATTAGAAGCACGTGGTATTACAACTAAGTGGAGTGTAGAGTTC ACGTTTGCCCAAATACATGGTTTTACTAACACTAAGGACCTTTTAGAATTAGTTTCTAGACCATTACGTCGTAACAA AAACTTAGAAAATCATGATTCTTTAAGCAAAACTTTCGCTCTTCAATAAAATAAAAAAAATTTATGTTGCATTCAAA GCTCCTTATGGGCTTGCCTAAAAGCAAAAAATAAAAGACTTTCTTTTGTTAAAATAGAAGTGAAAGCCATAACTATA ATTCTTTTATTTATGGAAAGTTATGGCTTTCGCTTCCTATTTTAACCTATTTTACCTATTTTATTATTTTTATTTTT TTTATTTTTTATTTTTTATTTTTTATTTTTTATTTTTTTCGAATGTTCAAAAAAATAAATTGACTATATCTATTTAT AAAGATTTCTATCACTAATCACTATAATTAACTATCCTATCGTTTTTTTAAAGCTATTAAGCTTGTACTTCTAATAA CTATGTTTTTTGCTATCAACTTAATATGCAAAAAAAAAATTGAATTAAAGAATTTTAATTCATATATAAAATATATA AAATATATGAAATAAAATTGAATTTACGGGCTAGGCGTATACGCCGTTGCTTCAGGCGACGGATACGGATCTTGCGT ACCCGCCTAGAAAATCACAAAGTTGTTTTGTTCGCCTAAAGATGTTGAATTTTATTTTATAATTAGGTATGTAGAAA AAAAACTTATGAACAAAAACGTTATTAATTCTCTTTTTAATTATAAAAATTGTGTTTTATATATTTATATTTATATA AATATAAATATATATTTATAAAGTATAAATATAAGGAGAGATGGCTGAGTGGTCTAAAGCGGCTGATTGCTAATCCG TTGTACAATGTAAATTGTACCGAGGGTTCGAATCCCTCTCTCTCCGATAAAAAAGTGAAACAAAATAAATCTTTTTT ACGAAATCGAAAGTTTAGGGGCGGGAGCAAAATTTAACTTTATGTCGGAATTTTTGTACCAAAAATTCCTCAGGACA AATAAACCAGAGGTTTATTTGTCCGCCAATTTAAATTTTATTTCGTATGTATATGTACAAGCGTTCTTCAGCCCAAA GAACCTCCTCAGTGG
4、中间载体pUC18-chlN的构建
将上述已克隆并鉴定的杜氏盐藻叶绿体chlN基因5'序列及3'序列，分别以 EcoR I/Sac I和Sph I/Hind III双酶切，连接入质粒pUC18的相应位点，构成中间载体 pUC18-chlN。
实施例二、叶绿体启动子和终止子元件的克隆和载体构建，此处以莱茵衣藻叶绿体 atpA启动子和rbcL终止子元件为例阐明具体步骤。
1、莱茵衣藻的培养
莱茵衣藻生长在TAP( Tris-acetate-phosphate )液体培养基中，20_25°C，光照强度 为3000 Lux，光照周期为12 h光照/12 h暗培养。TAP液体培养基配方如下
1Tris碱2.42 g，Beijinercke缓冲液5 ml，磷酸盐缓冲液5 ml，微量元素溶液1 ml，冰醋酸1 ml，调节pH值至6. 8-7. 3，加水至1000 ml. 0. 11 MPa灭菌20 min待用。Beijinercke 缓冲液配方
NH4Cl 10 g , MgSO4 · 7H20 4 g, CaCl2 · 2H20 2 g，加水至 1000 ml。磷酸盐缓冲液配方
K2HPO4 · 3H20 373 g, KH2PO4 144 g，加水至 1000 ml。微量元素溶液配制方法
先分别将4. 4 g的一水硫酸锌溶于20 ml水中，2. 28 g的硼酸溶于40 ml水中，1. 012 g的二水氯化锰溶于10 ml水中，0. 322 g的六水氯化钴溶于10 ml水中，0. 314 g的五水硫 酸铜溶于10 ml水中，0.22 g的四水钼酸铵溶于W ml水中，0.998 g的七水硫酸亚铁溶于 10 ml水中(临用前现配)，然后将这些溶液都加于烧杯中煮沸，再加入50 ml 20%的EDTA， 不断搅拌至全部溶解后，冷却至70°C，用20%热的氢氧化钾溶液调pH至6. 7，并加水定容为 200 ml，转移溶液至三角烧瓶中，封口后室温放置7-14天，每天摇动一次，待溶液呈紫色并 有锈色沉淀后两层滤纸过滤，收集清亮滤液，冻存待用。
2、莱茵衣藻叶绿体DNA的提取
取10 ml处于对数生长后期的莱茵衣藻培养液，5000 g 4°C离心5 min，细胞沉淀用 350 μ 1 NET (0· 1 mol/L NaC 1,50 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris · HCl, pH 8. 0)悬浮后， 加入25μ1蛋白酶K(10 mg/ml)、25 μ 1 20% SDS，混勻，55°C水浴2 h后，置于冰上冷却， 加入200μ 1.5 mol/L乙酸钾，冰上静置30 min。12000 g 4°C离心5 min，上清液加入等体 积的酚/氯仿/异戊醇(25: : 1)，抽提两次，再用等体积的氯仿抽提一次。水相加入2倍 体积的无水乙醇，混勻后置于_70°C，15 min。12000 g 4°C离心10 min，沉淀用70%乙醇洗 涤去盐，真空干燥后溶于30 μ 1双蒸水中。
3、PCR扩增衣藻叶绿体atpA基因启动子及rbcL基因终止子
根据GenBank登录的莱茵衣藻叶绿体基因组全序列(GenBank登录号GQ250046)，合 成如下引物
PatpAl 5' -AGCCGGTACCGACTTTATTAGAGGCAGTGTT-3'； PatpA2 5' -GTGTCCCGGGCATTTTCACTTCTGGAGTGTAT-3'； TrbcLl 5' -CAGAGTCGACAAGCTTGTACTCAAGCTCGTAA-3‘； TrbcL2 5' -TCGACTGCAGGGATCGCACTCTACCGATTGAG-3‘
以上述莱茵衣藻叶绿体基因组DNA为模板，分别以I^atpAl和I^tpA2为引物进行PCR 扩增衣藻叶绿体atpA基因启动子序列；以TrbcLl和TrbcL2为引物进行PCR扩增衣藻叶绿 体rbcL基因终止子序列。PCR反应条件为94°C 30 s，55°C 45 s，72°C 45 s，25个循环；将产物克隆到PMD18-T载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。atpA启动子序列 GACTTTATTAGAGGCAGTGTTTATATACCTAAACGTCAAAAGTCATTTTTATAACTGGTCTCAAAATACCTA
TAAACCCATTGTTCTTCTCTTTTAGCTCTAAGAACAATCAATTTATAAATATATTTATTATTATGCTATAATATAAA TACTATATAAATACATTTACCTTTTTATAAATACATTTACCTTTTTTTTAATTTGCATGATTTTAATGCTTATGCTA TCTTTTTTATTTAGTCCATAAAACCTTTAAAGGACCTTTTCTTATGGGATATTTATATTTTCCTAACAAAGCAATCG GCGTCATAAACTTTAGTTGCTTACGACGCCTGTGGACGTCCCCCCCTTCCCCTTACGGGCAAGTAAACTTAGGGATT TTAATGCAATAAATAAATTTGTCCTCTTCGGGCAAATGAATTTTAGTATTTAAATATGACAAGGGTGAACCATTACT TTTGTTAACAAGTGATCTTACCACTCACTATTTTTGTTGAATTTTAAACTTATTTAAAATTCTCGAGAAAGATTTTA AAAATAAACTTTTTTAATCTTTTATTTATTTTTTCTTTTTTATGGCAATGCGTACTCCAGAAGAACTTAGTAATCTT ATTAAAGATTTAATTGAACAATACACTCCAGAAGTGAAAATG rbcL终止子序列
AAGCTTGTACTCAAGCTCGTAACGAAGGTCGTGACCTTGCTCGTGAAGGTGGCGACGTAATTCGTTCAGCTT GTAAATGGTCTCCAGAACTTGCTGCTGCATGTGAAGTTTGGAAAGAAATTAAATTCGAATTTGATACTATTGACAAA CTTTAATTTTTATTTTTCATGATGTTTATGTGAATAGCATAAACATCGTTTTTATTTTTTATGGTGTTTAGGTTAAA TACCTAAACATCATTTTACATTTTTAAAATTAAGTTCTAAAGTTATCTTTTGTTTAAATTTGCCTGTGCTTTATAAA TTACGATGTGCCAGAAAAATAAAATCTTAGCTTTTTATTATAGAATTTATCTTTATGTATTATATTTTATAAGTAAT AAAAGAAATAGTAACATACTAAAGCGGATGTAACTCAATCGGTAGAGTGCGATCC 4、中间载体pUC18-atpA-rbcL的构建
将上述已克隆并鉴定的衣藻叶绿体atpA基因启动子及rbcL基因终止子，分别 以Kpn I/Sma I和Ml I/Pst I双酶切，连接入质粒pUC18的相应位点，构成中间载体 pUC18-atpA-rbcL。
实施例三、双选择标记基因序列的克隆与载体构建 1、氯霉素抗性选择标记基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因克隆 质粒载体pCAT3-Control (Promega公司，GenBank登录号U57025. 2)上克隆有氯霉素 抗性选择标记基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，设计引物如下 CATl 5' -GAATCCCGGGATGGAGAAAAAAATCACTGGA-3'； CAT2 5' -ATAAGGATCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTC-3‘
以质粒载体pCAT3-Control为模板，PCR扩增CAT序列；PCR反应条件为94°C 30 s, 55°C 45 s，72°C 45 s，25个循环；将产物克隆到pMD18_T载体上，挑选酶切鉴定正确的克 隆进行测序。
CAT基因序列
ATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCA TTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAA AAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGG CAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACG TTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTT TCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACG CAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAAT GCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAA
2、除草剂草丁膦抗性选择标记基因bar序列的克隆
质粒载体PCAMBIA3301克隆有除草剂草丁膦抗性选择标记bar基因，设计引物如下 barl 5' -TTACTCTAGAATGAGCCCAGAACGACGCC-3‘； bar2 5' -AGTTGTCGACTTAGATCTCGGTGACGGGC-3‘
以质粒载体PCAMBIA3301为模板，PCR扩增bar序列；PCR反应条件为94°C 30 s,55°C 45 s，72°C 45 s，25个循环；将产物克隆到pMD18_T载体上，挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序。
bar基因序列
ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGACATCCGCCGTGCCACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATC GTCAACCACTACATCGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTACCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGACGGACGACCT CGTCCGTCTGCGGGAGCGCTATCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGACGGCGAGGTCGCCGGCATCGCCTACGCGGGCC CCTGGAAGGCACGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCGGACGGGA CTGGGCTCCACGCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGTCATCGG GCTGCCCAACGACCCGAGCGTGCGCATGCACGAGGCGCTCGGATATGCCCCCCGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCT TCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTG CCCGTCACCGAGATCTAA
3、双选择标记中间载体pUC18-CAT-BAR的构建
将上述已克隆并鉴定的CAT基因序列及bar基因序列，分别以Sma I/BamH I和 Xba I/ Sal I双酶切后，连接入中间载体pUC18-atpA-rbcL的相应位点，构成中间载体 PUC18-CAT-BAR,使氯霉素抗性选择标记CAT基因和除草剂草丁膦抗性选择标记bar基因同 处于衣藻叶绿体atpA基因启动子及rbcL基因终止子之间，构成完整的表达盒。
实施例四、双交换双选择型杜氏盐藻叶绿体转化载体pChlN-CAT-BAR的构建 将上述构建的中间载体pUC18-CAT-BAR，用Mc I/Sph I双酶切，切下完整的 atpA-CAT-BAR-rbcL表达盒，插入到中间载体pUC18-chlN的相应位点，构建成载体 pChlN-CAT-BAR，可经由chlN基因序列作为同源片段，介导发生载体序列与杜氏盐藻叶绿 体基因组间的双交换型重组，使atpA-CAT-BAR-rbcL表达盒稳定整合到氏盐藻叶绿体基因 组的chlN基因位点，在atpA启动子和rbcL终止子的调控下得到高效表达。
实施例五、将外源目的基因导入盐藻 1、用电激法将外源目的基因导入盐藻
取培养第5天的盐藻培养液，1000 rpm离心15 min，弃上清，用含有0. 2 M甘露醇和0.2 M山梨醇液处理后加入电激缓冲液，调整盐藻密度在IO8个/ml。继之加入终浓度为IOyg/ ml的含外源基因的质粒及25 μ g/ml的处精DNA，混勻后，置冰上5_10 min,吸取0. 5 ml置于轰击小室中待用。电激仪(Backon 2000型)电激时电压为9. 5KV，每次电激时间为0. 05 μ s，次数为21(1，循环次数100次，电激高度2 mm，每次电激间隔时间为62. 5 S。2、用基因枪法将外源目的基因导入盐藻
取培养第5天的盐藻培养液，1000 rpm离心15 min，弃上清，用盐藻培养液将盐藻密度 调整在IO8个/ml，再取0.5 ml盐藻培养液铺于含抗生素的固体培养基中央，直径为3 cm 的圆形有效轰击范围内，置超净台下吹干待用。在无菌条件下，用基因枪(Bio-Rad公司产的PDS-1000型)轰击。具体步骤如下 取50μ1 (60 μ g/ml)金粉悬浮液加入6 μ g含有外源基因的质粒以及50 μι 2. 5 M Cacl2*20 μ 1 0. 1 M亚精胺，振荡3 min, 12000 rpm离心10 s，弃上清。用无水乙醇洗一 次，振荡，12000 rpm离心，弃上清，共二次。最后将附有金粉的质粒悬浮于60 μ 1无水乙醇 中。每次轰击取6-8 μ 1，每皿轰击3次，轰击后将培养皿放入盐藻适宜培养条件下培养。
实施例六、转化藻株的筛选和鉴定
基因枪轰击后，用2 ml培养液洗脱琼脂表面盐藻，26°C 300 Lux弱光培养8 -12 h，其 后在3000 Lux下光照培养M h。继之加氯霉素至100 mg/ L，过渡培养1 -2天后，用培养 液稀释藻液至IX IO6个细胞/ ml，补加氯霉素至终浓度为200 mg/ L，光强4500 Lux进行 筛选培养。15天后视情况再加入终浓度2 mg / L-3 mg / L草丁膦进行氯霉素、草丁膦双 蹄选。
权利要求
1.一种杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建方法，其特征在于是以光非依赖性的原叶绿 素酸酯还原酶chlN、ChlB或者ChlL基因为同源片段，以氯霉素乙酰转移酶CAT基因和除 草剂草丁膦抗性基因bar为筛选标记，并以atpA启动子和rbcL终止子为表达元件构建双 交换双筛选标记的杜氏盐藻叶绿体转化载体。
2.根据权利要求1所述的杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建方法，其特征在于杜氏盐 藻自身chlN、chlB或者chlL基因及其侧翼序列，其长度为2-41Λ。
3.根据权利要求1所述的杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建方法，其特征在于CAT基因 为主要筛选标记基因，而bar基因是辅助筛选标记基因。
4.根据权利要求1所述的杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建方法，其特征在于atpA启 动子和rbcL终止子来源于莱因衣藻叶绿体。
全文摘要
一种杜氏盐藻叶绿体转化载体的构建，具体是以光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶chlN、chlB或者chlL基因为同源片段，以氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)和除草剂草丁膦(PPT)的抗性基因bar为筛选标记，并以atpA启动子和rbcL终止子为表达元件，构建双交换双筛选标记杜氏盐藻叶绿体转化载体。通过基因枪法或者电激法转化杜氏盐藻，再经两步法筛选实现同质化，确保外源基因在杜氏盐藻叶绿体基因组的定点整合，最终获得稳定表达外源蛋白的叶绿体转化杜氏盐藻藻株。本发明选取chlN、chlB或者chlL基因作为同源片段，可作为转化子的辅助筛选标记；选择氯霉素抗性CAT基因和草丁膦抗性bar基因共同作为筛选标记基因，有利于在较短时间内获得稳定转化株。
文档编号C12N15/65GK102121026SQ201010583119
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月11日 优先权日2010年12月11日
发明者侯桂琴, 曲东京, 李 杰, 潘卫东, 薛乐勋, 贾岩龙 申请人:郑州大学