专利名称：南方型玉米锈病病原真菌的检测引物及分子检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种南方型玉米锈病病原真菌的特异引物及分子检测方法。
背景技术：
玉米锈病是全球范围内越来越严重的一种玉米真菌病害。至今已报道的玉米锈病有3种，即由玉米柄锈菌(Puccinia sorghi Schw.)引起的普通玉米锈病，由玉米多堆柄锈菌(Puccinia polysora Underw.)引起的南方玉米锈病和由玉米壳锈菌[Physopella zeae (Mains) Cummins & Ramachar]弓I起的热带玉米锈病。我国玉米锈病发生范围较广，遍及南北主要玉米产区，主要有普通型锈病和南方型锈病两种类型，普通型锈病多发生在低温高湿的东北、西北玉米区；南方型锈病在我国台湾、海南、云南元江最先发生。近年来，玉米锈病在我国的危害逐渐加重，如随着杂交玉米的推广和玉米种植制度的变化，玉米锈病在我国海南、江苏、河南、山东、山西、河北、浙江等省大面积暴发，造成当地玉米产量锐减。锈病尤其南方型锈病对产量的影响有时是毁灭性的， 玉米锈病发病中度的田块，可以减产10% 20%，感病较重的可以达到50%以上，部分地块甚至绝收。玉米锈病真菌感染14天之后才能够在玉米叶片观察到病斑，但是此时进行农药喷施，不足以控制病情的蔓延，如果能够在玉米锈病病原菌感染早期，及时、准确的进行检测鉴定，可以做到提前预防，如选择敏感有效的杀真菌剂，以控制病情的流行大爆发。因此， 建立一种能够快速、准确的监测和鉴别玉米锈病病菌的检测方法对于我国玉米的安全生产具有重大的意义。近年来，随着分子生物学技术向植物病理学科的不断渗透，特别是相关的分子标记技术的发展与应用，为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径。PCR技术以其特异性强、 敏感性高的特点很早就被研究用于病原真菌的诊断。近年来的有关报道更是层出不穷，显示了很广阔的应用前景，如中国专利文献CN1880476C中公开了一种松树脂溃疡病菌的分子检测方法；CN101643788 A中公开了一种马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法。但有关玉米锈病菌的分子检测研究目前国内外尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好的南方型玉米锈病病原真菌的检测引物，并给出了一种可快速、准确鉴别检测出南方型玉米锈菌的分子检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是
针对南方型玉米锈病病原真菌的设计出一对检测引物，其核苷酸序列如下(如SEQ ID N0:2、3 所示)
上游引物:5，- CTCCAAGAACTTCCTCCTC -3，， 下游引物5，- TGACATGAAGTAGAAATTCT -3，。
与上述检测引物相对应的南方型玉米锈病病原真菌的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。所述上游引物和下游引物对南方型玉米锈病病原真菌特异性扩增出约MO bp左右的产物。所述检测引物可在对南方型玉米锈病病原真菌的鉴别和检测中的应用。一种南方型玉米锈病病原真菌的分子检测方法，包括以下步骤
S提取玉米叶片基因组DNA;
: PCR扩增，分别在PCR薄壁管中依次放入
10'Buffer 2. 5 μ L、25mmol/LMgCL2 2. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2. 0 μ L、前述上游引物和下游引物2mmol/L各2. 5μ L、玉米叶片基因组DNA 10 50ng、Taq DNA聚合酶1. 0U，最后以无菌去离子水补齐至25 μ L ；离心IOsec后进行PCR扩增；扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后94°C变性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸90sec，共30个循环；最后一循环，72°C延伸IOmin补齐末端，扩增完成；
S；上步所得PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上用1 X TAE缓冲液中电泳分析，电压为4
5V/cm,电泳结束后用凝胶成像系统分析；
④在M4 bp处出现特异条带，说明玉米叶片带南方型玉米锈病病原真菌，反之，则不携带该病原真菌。本发明具有积极有益的效果
1.本发明所用探针(引物)对玉米条锈菌具有很强的特异性，能够用于区别玉米南方锈病病菌和玉米普通锈病病菌及玉米大斑病菌，玉米小斑病菌，玉米弯孢霉菌等玉米上的常见病菌；可用于玉米锈病的检测，并且其灵敏度可达0. OOlng/μ L02.本发明检测方法实用性好，操作简便快速，测试成本较低。
图1为本发明引物(探针)在55°C退火温度下特异扩增的电泳图谱；其中，1 10 泳道分别是玉米南方锈病真菌孢子样品1，玉米南方锈病真菌孢子样品2，玉米南方锈病叶片，玉米普通锈病真菌孢子，玉米普通锈病叶片，大斑病菌，小斑病菌，弯孢霉菌，玉米健康叶片，无菌去离子水；玉米南方锈病特异引物扩增结果；
图2为本发明中玉米南方锈病引物(探针)在55°C退火温度下特异扩增的灵敏度电泳图谱，其中 1 8泳道分别为 20 ng/yL ,10 ng/yL,l ng/yL,0. 1 ng/yL,0. 01 ng/yL, 0. OOlng/μ L, 0. 0001 ng/μ L,0. 00001 ng/μ L, CK:无菌去离子7jC。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试齐Ll商店。
实施例1田间玉米锈病监测对比试验 (1)样品采集
2008年9月1日至9月9日，分别在河南省周口太康、驻马店西平、郑州毛庄、开封兰考、新乡原阳、南阳方城、鹤壁浚县，随机采集20株玉米叶片样本，-80°C保存备用。(2)按下述核苷酸序列合成南方型锈病检测引物(下同) 上游引物:5，- CTC CAA GAA CTT CCT CCT C -3，，
下游引物5，- TGA CAT GAA GTA GAA ATT CT -3’。(3)玉米锈菌检测
①提取玉米叶片基因组DNA;
②PCR扩增，25μ L反应体系分别在PCR薄壁管中依次放入
10'Buffer 2. 5 μ L、25mmol/LMgCL2 2. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2. 0 μ L、上述玉米南方锈病菌上游引物和下游引物2mmol/L各2. 5 μ L、玉米叶片基因组DNA 10 50ng、Taq DNA聚合酶1. 0U,最后用无菌去离子水补齐至25 μ L ；离心lOsec，将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增；扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后94°C变性45seC，55°C退火45seC，72°C 延伸90sec，共30个循环；最后一循环，72°C延伸IOmin补齐末端，扩增完成；
③PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上用1 X TAE缓冲液中电泳分析，电压为4 5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。④共有12株样本在M4bp出现了一条特异带，其检出率为60%。上述检测结果与2008年玉米锈病菌当年田间病情普查的结果基本一致，这表明该检测方法能够预测预报玉米病害爆发趋势状况。实施例2田间玉米锈病监测对比试验 (1)样品采集
2009年2月17日，海南省三亚市冲坡镇，8月沈日，吉林省长春市，9月M日，重庆市钱江新华，分别随机采取10、7、4株玉米叶片样本，-80°C保存备用。(2)玉米锈菌检测
①提取玉米叶片基因组DNA;
②PCR扩增，25μ L反应体系分别在PCR薄壁管中依次放入
10'Buffer 2. 5 μ L、25mmol/LMgCL2 2. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2. 0 μ L、用上述玉米南方锈病菌的上游引物及下游引物2mmol/L各2. 5 μ L、玉米叶片基因组DNA 10 50ng、Taq DNA 聚合酶1.0U，最后用无菌去离子水补齐至25yL;离心lOsec，将PCR薄壁管放入PCR仪中扩增；扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后94°C变性45seC，55°C退火45seC，72°C 延伸90sec，共30个循环；最后一循环，72°C延伸IOmin补齐末端，扩增完成；
③PCR产物在1.5 %琼脂糖凝胶上用1 X TAE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析。④使用玉米南方锈病菌上游引物及下游引物的玉米叶片DNA扩增的结果显示 海南和重庆的14个样本共有10个样本在M4bp出现了一条特异带，其检出率为71.4%，吉林的7个样本均没有条带；该结果证实引物的特异性，可以准确鉴别玉米南方锈病病菌，该结果也与当年玉米锈病菌田间病情普查的结果基本一致，能够准确预测预报当年玉米病害流行爆发的情况。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种南方型玉米锈病病原真菌的检测引物，其核苷酸序列如下 上游引物:5，- CTCCAAGAACTTCCTCCTC -3，，下游引物5，- TGACATGAAGTAGAAATTCT -3，。
2.根据权利要求1所述南方型玉米锈病病原真菌的特异引物，其特征在于，与所述检测引物相对应的南方型玉米锈病病原真菌的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.根据权利要求1所述南方型玉米锈病病原真菌的特异引物，其特征在于，所述上游引物和下游引物对南方型玉米锈病病原真菌特异性扩增出约544 bp的产物。
4.权利要求1所述检测引物在对南方型玉米锈病病原真菌的鉴别和检测中的应用。
5.一种南方型玉米锈病病原真菌的分子检测方法，包括以下步骤 X提取玉米叶片基因组DNA;PCR扩增，分别在PCR薄壁管中依次放入 10'Buffer 2. 5 μ L、25mmol/LMgCL2 2. 0 μ L、2. 5mmol/LdNTP 2. 0 μ L、权利要求 1 所述上游引物和下游引物2mmol/L各2. 5 μ L、玉米叶片基因组DNA 10 50ng、Taq DNA聚合酶 1.0U，最后以无菌去离子水补齐至25μ L ；离心IOsec后进行PCR扩增；扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后94°C变性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸90sec，共30个循环；最后一循环，72°C延伸IOmin补齐末端，扩增完成；S上步所得PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上用IXTAE缓冲液中电泳分析，电压为 4-5V/cm,电泳结束后用凝胶成像系统分析；④在544 bp处出现特异条带，说明玉米叶片带南方型玉米锈病病原真菌，反之，则不携带该病原真菌。
全文摘要
本发明涉及一种南方型玉米锈病病原真菌的特异引物及分子检测方法。该特异引物包括上游引物5’-CTCCAAGAACTTCCTCCTC-3'，下游引物5’-TGACATGAAGTAGAAATTCT-3'；采用上述引物，经PCR扩增(扩增参数95℃预变性5min；然后94℃变性45sec，55℃退火45sec72℃延伸90sec，共30个循环；72℃延伸10min)、琼脂糖凝胶电泳，通过扩增产物(片段长度约540bp)检测田间玉米的带菌情况。本发明所用引物对玉米条锈菌具有很强的特异性；可用于玉米锈病的检测，其灵敏度可达0.001ng/μL；本发明检测方法实用性好，操作简便快速。
文档编号C12Q1/68GK102174647SQ20101060698
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者张磊, 杨文博, 王明凤, 蒋士君, 袁红霞, 许君, 邢国珍, 郑文明 申请人:河南农业大学