专利名称：IgA肾病的预测方法和IgA肾病患者的选择方法
技术领域：
本发明涉及IgA肾病的预测方法和IgA肾病患者的选择方法，具体而言，涉及在确诊IgA肾病前能够以高概率预测为IgA肾病的方法以及选择出扁桃体摘除有效的IgA肾病患者的方法。
背景技术：
IgA肾病是一种慢性肾小球性肾炎，其特征在于，可观察到IgA在肾脏的肾小球系膜区域的优势沉积。IgA肾病占日本的慢性肾小球性肾炎的一大半，作为单一的肾病是最多的，其中15 30%预后不良而转为肾功能衰竭。但是，IgA肾病的病因尚未明确，因此没有根本性的治疗方法。IgA肾病的确诊使用对肾脏的一部分进行活检，通过免疫学染色确认肾小球系膜中的IgA免疫复合物的沉积的方法，因此存在对患者造成的负担大的问题。因而， 期望开发出能够在实施肾活检前、在不对被测者造成躯体上的负担的情况下简便且迅速地实施，而且能够以高概率预测IgA肾病的方法。另外，已知IgA有IgAl和IgA2这两种，IgAl在上消化道、呼吸道、扁桃体产生， IgA2在下消化道产生。IgA肾病中沉积于肾脏的是IgAl，因而近年来进行了摘除IgA肾病患者的扁桃体的治疗方法。非专利文献1中报道对16名IgA肾病患者进行扁桃体摘除，3年后56. 3%的患者的蛋白尿得到缓解。另外，非专利文献2中报道对M名IgA肾病患者进行扁桃体摘除， 6个月后41. 7%的患者的蛋白尿得到缓解，2年后50%的患者的蛋白尿得到缓解。此外，非专利文献3中报道通过并用扁桃体摘除和类固醇脉冲治疗，约60%的IgA肾病患者的尿蛋白和尿潜血两者同时得到缓解。但是，扁桃体摘除对于约40%的IgA肾病患者是无效的，存在无法预先预测扁桃体摘除的有效性的问题。由于扁桃体摘除需要伴随全身麻醉的手术，躯体上的负担大，因而期望建立一种以高概率选择扁桃体摘除有效的患者的方法。现有技术文献非专利文献非专利文献 1 Tokuda M et al. Acta Otolaryngol Suppl 523 ； 182—184，1988.非专利文献 2:Akagi H et al. Acta Otolaryngol Suppl 540 ；64-66,1999.非专利文献3 =Hotta et al. Am J Kid Dis 38，pp736_743，2001.
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够在不对被测者造成躯体上的负担的情况下简便且迅速地实施、而且能够以高概率预测IgA肾病的方法。另外，本发明的目的在于提供一种以高概率选择对于IgA肾病的治疗扁桃体摘除有效的IgA肾病患者的方法。本发明为了解决上述课题，包含以下技术方案。[1] 一种IgA肾病的预测方法，其特征在于，包括对来自被测者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属(Ti^ponema)细菌或弯曲杆菌属(Campylobacter)细菌进行检测的步
马聚ο[2]如上述[1]所述的IgA肾病的预测方法，其特征在于，所述步骤中，对密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性的核酸进行检测。[3]如上述[1]所述的IgA肾病的预测方法，其特征在于，所述步骤中，使用与密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。[4]如上述[1]所述的IgA肾病的预测方法，其中，密螺旋体属细菌选自通过以下 PCR检测出的细菌中的一种以上所述PCR中，以从密螺旋体属细菌提取的总RNA反转录所得到的cDNA作为模板，并且使用序列号1表示的碱基序列构成的引物和序列号2表示的碱基序列构成的引物组合而成的引物组。[5]如上述[1]所述的IgA肾病的预测方法，其中，密螺旋体属细菌为选自由齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、文氏密螺旋体(Ti^ponema vincentii)、媒介密螺旋体(Ti^ponema medium)、索氏密螺旋体(Ti^ponema socranskii)、蚀疮溃疡密螺旋体 (Treponema phagedenis)、食果月交密il旋体(Treponema pectinovorum)、食淀粉密il旋体 (Treponema amylovorum)、 嗜麦芽糖密螺旋体(Tr印onema maltophilum)、布氏密螺旋体 (Treponema bryantii)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、嗜糖密螺旋体(Treponema saccharophilum)和产琥珀酸密螺旋体(Treponema succinifaciens)组成的组中的一种以上。[6]如上述[1]所述的IgA肾病的预测方法，其中，弯曲杆菌属细菌为选自由直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠 ^ ffiff S‘ (Campylobacter coli)、·明胃曲 ff (Campylobacter concisus)、 曲杆菌(Campylobacter curvus)、昭禾口弯曲杆菌(Campylobacter showae)、粘膜弯曲杆菌(Campylobacter mucosalis)、月台儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、猪肠弯曲杆菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)、瑞士弯曲杆菌(Campylobacter helveticus)、乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis)禾口红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)组成的组中的一种以上。[7]如上述[1] W]中任一项所述的IgA肾病的预测方法，其特征在于，被测者在尿蛋白检查和尿潜血检查的至少一项中被判断为阳性。[8] 一种试剂盒，用于预测IgA肾病，其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一种以上(a)用于特异性检测密螺旋体属细菌的引物组；(b)用于特异性检测弯曲杆菌属细菌的引物组；(c)与密螺旋体属细菌特异性结合的抗体；和(d)与弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。[9] 一种IgA肾病患者的选择方法，用于选择对于IgA肾病的治疗进行扁桃体摘除有效的IgA肾病患者，其特征在于，包括对来自IgA肾病患者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌进行检测的步骤。[10] 一种IgA肾病患者的选择方法，用于选择对于IgA肾病的治疗进行扁桃体摘除和类固醇脉冲疗法有效的IgA肾病患者，其特征在于，包括对来自IgA肾病患者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌进行检测的步骤。[11]如上述[9]或[10]所述的IgA肾病患者的选择方法，其特征在于，所述步骤中，对密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性的核酸进行检测。[12]如上述[9]或[10]所述的IgA肾病患者的选择方法，其特征在于，所述步骤中，使用与密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。[13]如上述[9]或[10]所述的IgA肾病患者的选择方法，其中，密螺旋体属细菌选自通过以下PCR检测出的细菌中的一种以上所述PCR中，以从密螺旋体属细菌提取的总 RNA反转录所得到的cDNA作为模板，并且使用序列号1表示的碱基序列构成的引物和序列号2表示的碱基序列构成的引物组合而成的引物组。[14]如上述[9]或[10]所述的IgA肾病患者的选择方法，其中，密螺旋体属细菌为选自由齿垢密螺旋体、文氏密螺旋体、媒介密螺旋体、索氏密螺旋体、蚀疮溃疡密螺旋体、 食果胶密螺旋体、食淀粉密螺旋体、嗜麦芽糖密螺旋体、布氏密螺旋体、梅毒密螺旋体、嗜糖密螺旋体和产琥珀酸密螺旋体组成的组中的一种以上。[15]如上述[9]或[10]所述的IgA肾病患者的选择方法，其中，弯曲杆菌属细菌为选自由直肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、简明弯曲杆菌、曲形弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、粘膜弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、猪肠弯曲杆菌、痰液弯曲杆菌、瑞士弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌组成的组中的一种以上。[16] 一种试剂盒，用于选择对于IgA肾病的治疗进行扁桃体摘除有效的IgA肾病患者，其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一种以上(a)用于特异性检测密螺旋体属细菌的引物组；(b)用于特异性检测弯曲杆菌属细菌的引物组；(c)与密螺旋体属细菌特异性结合的抗体；和(d)与弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。根据本发明，能够在不对被测者造成躯体上的负担的情况下简便且迅速地、而且以高概率预测被测者是否为IgA肾病。另外，根据本发明，能够在不对被测者造成躯体上的负担的情况下简便且迅速地、而且以高概率选择对于IgA肾病的治疗扁桃体摘除有效的 IgA肾病患者。
图1是表示通过DGGE法网罗性地分析扁桃体菌群的结果的电泳图。图2是表示通过RT-PCR法检测摘除的扁桃体中的密螺旋体属细菌的结果的电泳图。图3是表示通过RT-PCR法检测摘除的扁桃体中的直肠弯曲杆菌的结果的电泳图。图4(A)是表示扁桃体中密螺旋体属细菌的有无和扁桃体摘除+类固醇脉冲疗法的治疗效果的图。图4(B)是表示扁桃体中嗜血杆菌属细菌的有无和扁桃体摘除+类固醇脉冲疗法的治疗效果的图。图4(C)是表示扁桃体中弯曲杆菌属细菌的有无和扁桃体摘除+类固醇脉冲疗法的治疗效果的图。
具体实施例方式本发明人对从经肾活检诊断为IgA肾病的患者和慢性扁桃体炎患者体内摘除的扁桃体中的菌群进行了网罗性的分析，结果发现IgA肾病患者与慢性扁桃体炎患者之间扁桃体菌群不同，并且发现IgA肾病患者中存在密螺旋体属细菌、嗜血杆菌属细菌、弯曲杆菌属细菌的概率高。由该发现可知，如果扁桃体中存在密螺旋体属细菌、嗜血杆菌属细菌、弯曲杆菌属细菌的任一种，则为IgA肾病的概率高。其中，关于嗜血杆菌属细菌与IgA肾病的关联在本申请提出之前已有启示，但是，IgA肾病患者的扁桃体中密螺旋体属细菌和弯曲杆菌属细菌的阳性率高是由本发明人首次发现的。此外，本发明人发现，在IgA肾病患者中，对扁桃体检测出密螺旋体属细菌的患者或检测出弯曲杆菌属细菌的患者进行扁桃体摘除疗法是非常有效的，从而完成了本发明。即，本发明涉及IgA肾病的预测方法，其特征在于，包括对来自被测者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌进行检测的步骤。另外，本发明涉及一种 IgA肾病患者的选择方法，用于选择对于IgA肾病的治疗进行扁桃体摘除、或者进行扁桃体摘除和类固醇脉冲疗法有效的IgA肾病患者，其特征在于，包括对来自IgA肾病患者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌进行检测的步骤。作为本发明的IgA肾病的预测方法的对象的被测者没有特别限制，优选为疑似患 IgA肾病的人。作为疑似患IgA肾病的人，可列举出在尿蛋白检查和尿潜血检查的至少一项中被判断为阳性的人。更具体而言，例如，可列举出在学校体检、公司体检等体检时或门诊诊察时等实施的尿检中被查出蛋白尿和血尿且即使复查也持续尿检异常的人。IgA肾病多同时伴有蛋白尿和血尿，但也有仅呈现血尿的情况，因此优选将任一项持续阳性的人作为被测者。尿蛋白阳性(蛋白尿)的判断和尿潜血阳性(血尿)的判断例如可以通过使用通常的尿检中使用的公知的尿检试纸来进行。以往，在疑似患IgA肾病时，如果不通过肾活检来进行组织学检查则无法诊断，因而其结果是，被诊断为不是IgA肾病的被测者会承受不必要的躯体上的负担。如果使用本发明的IgA肾病的预测方法，则可以仅对患IgA肾病的概率高的被测者进行肾活检，从而能够避免不必要的躯体上的负担。作为本发明的IgA肾病患者的选择方法的对象的IgA肾病患者没有限制。优选为过去未进行过扁桃体摘除术的IgA肾病患者。以往，对于约40%的IgA肾病患者而言，扁桃体摘除是无效的，但是，如果使用本发明的IgA肾病患者的选择方法，则可以仅对扁桃体摘除有效的概率高的患者进行扁桃体摘除，因而能够避免不必要的躯体上的负担和经济上的负担。以下，将本发明的IgA肾病的预测方法和本发明的IgA肾病患者的选择方法并称为“本发明的方法”，对两方法中共有的项目进行详细说明。本发明的方法中，作为检测对象的密螺旋体属细菌没有特别限制，只要是扁桃体中可能存在的密螺旋体属细菌均可作为检测对象。作为这样的密螺旋体属细菌，例如可列举出通过以下PCR检测出的细菌该PCR中，以从密螺旋体属细菌提取的总RNA反转录所得到的cDNA作为模板，并且使用由正向引物(TTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAC、序列号1)和反向引物(GTCRYMGGCAGTTCCGCCWGAGTC、序列号2)构成的引物组。这里，碱基符号R表示鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)，Y表示胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)，M表示腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)，W表示腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)。具体而言，例如，可列举出齿垢密螺旋体(Tr印onema denticola)、文氏密螺旋体 (Treponema vincentii)、媒介密螺方宠体(Treponema medium)、索氏密螺方宠体(Treponema socranskii)、蚀疮溃疡密螺旋体(Tr印onema phagedenis)、食果胶密螺旋体(Treponema pectinovorum)、食淀粉密螺旋体(Treponema amylovorum)、嗜麦芽糖密螺旋体(Treponema maltophilum)、布氏密螺旋体(Treponema bryantii)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、嗜糖密螺旋体(Treponema saccharophilum)、产琥珀酸密螺旋体(Treponema succinifaciens)等。本发明的方法中，作为检测对象的弯曲杆菌属细菌没有特别限制，只要是扁桃体中可能存在的弯曲杆菌属细菌均可作为检测对象。作为这样的弯曲杆菌属细菌，例如，可列举出直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、 结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、简明弯曲杆菌(Campylobacter concisus)、曲形弯曲杆菌(Campylobacter curvus)、昭禾口弯曲杆菌(Campylobacter showae)、粘膜弯曲杆菌(Campylobacter mucosalis)、月台儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、猪肠弯曲杆菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)、瑞士弯曲杆菌(Campylobacter helveticus)、乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)等。其中，优选直肠弯曲杆菌。供于本发明的方法中的试样只要是来自被测者或患者的扁桃体的试样即可。例如，可列举出由扁桃体组织、扁桃体拭子液等制备的DNA、RNA、细胞悬浮液、细胞破碎液等。 这些试样均可以通过本领域技术人员公知的方法制备。检测密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌的方法只要是能够特异性检测密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌的方法则没有特别限制。例如，可列举出对密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性的核酸进行检测的方法、使用与密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体的方法等。检测上述核酸的方法中的核酸可以是DNA，也可以是RNA。本发明中，可以适当使用公知的核酸检测方法。具体而言，例如，可列举出PCR法、DNA印迹法、RNA印迹法、RT-PCR 法、原位杂交法、原位PCR法、DNA阵列法等。其中，从检测灵敏度、操作的简便性、快速性、 低成本性的观点来看，优选使用RT-PCR法。在使用RT-PCR法检测密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌时，使用由扁桃体组织、扁桃体拭子液等制备的总RNA作为试样。总RNA可以通过公知的方法制备。RT-PCR法可以通过本领域技术人员公知的方法实施。例如，可列举出以下方法 由扁桃体组织、扁桃体拭子液等制备总RNA，使用反转录酶由该总RNA合成cDNA，以该cDNA 为模板，利用对来自检测对象细菌的DNA片段进行特异性扩增的引物组进行PCR。对来自检测对象细菌的DNA片段进行特异性扩增的引物组没有特别限制，只要由公知的数据库(例如，GenBank等)获取检测对象细菌的基因组序列信息或核糖体RNA的序列信息，根据公知的方法设计引物即可。以下，例示出可以适用于本发明的方法的引物组，但不限于此。作为能够特异性检测密螺旋体属细菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物TTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAC(序列号1)
反向引物GTCRYMGGCAGTTCCGCCWGAGTC (序列号 2)通过使用该引物组，可以期待扩增657bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作为能够特异性检测齿垢密螺旋体的引物组，可列举出以下引物组正向引物TAATACCGAATGTGCTCATTTACAT(序列号 3)反向引物CTGCCATATCTCTATGTCATTGCTCTT(序列号 4)通过使用该引物组，可以期待扩增860bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作为能够特异性检测文氏密螺旋体的引物组，可列举出以下引物组正向引物GTCTCAATGGTTCATAAGAA(序列号 5)反向引物CAAGCCTTATCTCTAAGACT(序列号 6)通过使用该引物组，可以期待扩增851bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作为能够特异性检测媒介密螺旋体的引物组，可列举出以下引物组正向引物CACTCAGTGCTTCATAAGGG(序列号 7)反向引物CCGGCCTTATCTCTAAGACC(序列号 8)通过使用该引物组，可以期待扩增851bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作为能够特异性检测直肠弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC(序列号 9)反向引物TTTCTGCAAGCAGACACTCTT(序列号 10)通过使用该引物组，可以期待扩增598bp的DNA片段(Archives of Oral Biology,2006. 51 :ρ·10—14.)。作为能够特异性检测空肠弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物AGAATGGGTTTAACTCGTGTGATAAGT(序列号 11)
反向引物TACCACGCAAAGGCAGTATAGCT (序列号 12)通过使用该引物组，可以期待扩增493bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测结肠弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物AAATGCTAGTGCTAGGGAAAAAGACTCT(序列号 13)反向引物TGAGGTTCAGGCACTTTTACACTTACTAC(序列号14)通过使用该引物组，可以期待扩增96bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测简明弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物AGCGGGCCTAACAAGAGTTATTACA(序列号反向引物TGTAAGCACGTCAAAAACCATCTTT(序列号 16)通过使用该引物组，可以期待扩增217bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测曲形弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组
正向引物CTGCCAAAGTAAGGACGCAAGTATA(序列号 17)反向引物GGCAAGATCGCCTGAAATACG(序列号 18)通过使用该引物组，可以期待扩增108bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测昭和弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物AGGGTTTAAGCATAGGAACGCTG(序列号 19)反向引物CACCAGATAAAGCTCGCTGATCG(序列号20)通过使用该引物组，可以期待扩增86bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测粘膜弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物TGCGATTATGAACAAGGCCCTA(序列号21)反向引物TCGCTTGAAACACACGGTCA(序列号22)通过使用该引物组，可以期待扩增224bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测胎儿弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物AGAGCTGGGCTTACAAGAGCTATTACA(序列号 2 反向引物GGTAAAATCGCTTGAAACGCTCTAT(序列号 24)通过使用该引物组，可以期待扩增482bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测猪肠弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物CGGTCAAAAGATGACTTTTGAAGTACTT(序列号 25)反向引物GCTTCCCTGCCACGAGCT(序列号26)通过使用该引物组，可以期待扩增108bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测痰液弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物AGCTTTACTTGCTGCAAGAGGAAGA(序列号 27)反向引物AGGAAGCGTTCCAACAGAAAAGTT(序列号 28)通过使用该引物组，可以期待扩增94bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测瑞士弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物CAATAACATACGCACACCAGATGGA(序列号四)反向引物CAGGCACTTTAACGCTCACTATGG(序列号 30)通过使用该引物组，可以期待扩增176bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作为能够特异性检测乌普萨拉弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物GCTTACGCGTGTAATTACAAACTATGTC(序列号 31)反向引物AATTGCCTTAGCCTCGATAGGG(序列号 32)通过使用该引物组，可以期待扩增250bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。
作为能够特异性检测红嘴鸥弯曲杆菌的引物组，可列举出以下引物组正向引物CTATGTTCGTCCTATAGTTTCTAAGGCTTC(序列号33)反向引物CCAGCACTATCACCCTCAACTAAATAA(序列号 34)通过使用该引物组，可以期待扩增250bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。关于使用与密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体的方法中的抗体，在检测密螺旋体属细菌时只要是与密螺旋体属细菌特异性结合的抗体即可，在检测弯曲杆菌属细菌时只要是与弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体即可。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。另外，可以是完整的抗体分子，也可以是能够特异性结合的抗体片段(例如，Fab片段、F(ab' )2片段等)。与密螺旋体属细菌特异性结合的抗体(多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段)和与弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体(多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段)，可以通过使用检测对象细菌的构成成分作为免疫原，利用公知的方法制作、获取。作为使用与密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体的方法，例如， 可列举出酶免疫测定法(EIA法)、固相酶联免疫测定法(ELISA法)、放射免疫测定法(RIA 法)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、免疫组化法、抗体阵列法等。其中，从检测灵敏度、操作的简便性、快速性、低成本性的观点来看，优选使用ELISA法。在使用ELISA法检测密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌时，适合使用由扁桃体组织、扁桃体拭子液等制备的细胞悬浮液或细胞破碎液等作为试样。ELISA法可以根据本领域技术人员公知的方法实施。例如，可列举出以下方法使与检测对象细菌特异性结合的一次抗体结合到微孔板的孔或塑料管等固相上，向其中添加来自扁桃体的试样(细胞悬浮液或细胞破碎液等)，清洗后添加酶标记的二次抗体；清洗、 除去未结合的二次抗体后，添加显色底物，用分光光度计测定生成的显色物质的量，从而测定吸光度。本发明的方法通过使用试剂盒，能够简便且迅速地实施。因此，本发明提供用于预测IgA肾病的试剂盒、以及用于选择扁桃体摘除有效的IgA肾病患者的试剂盒(以下，将两试剂盒并称为“本发明的试剂盒”)。作为本发明的试剂盒的一个实施方式，可以提供以下RT-PCR用试剂盒，该试剂盒包含选自用于特异性检测密螺旋体属细菌的引物组和用于特异性检测弯曲杆菌属细菌的引物组中的至少一种以上的引物组。除引物组以外的试剂盒的构成品没有特别限制，例如， 优选含有用于由组织或细胞制备RNA的试剂、反转录酶、用于反转录反应的缓冲液、耐热性 DNA聚合酶、PCR用试剂、PCR用管、PCR用板等。作为本发明的试剂盒的另一实施方式，可以提供以下ELISA用试剂盒，该试剂盒包含选自与密螺旋体属细菌特异性结合的抗体和与弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体中的至少一种以上的抗体。除抗体以外的试剂盒的构成品没有特别限制，例如，优选含有已标记的二次抗体、显色用试剂、清洗用缓冲液、ELISA用板等。此外，作为本发明的试剂盒的其他实施方式，可列举出包含DNA阵列的试剂盒、包含抗体阵列的试剂盒等。实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些例子。[实施例1:IgA肾病患者的扁桃体菌群的研究](1)患者的登记对于在大阪大学医学部附属医院住院的、经肾活检被诊断为IgA肾病的68名患者和因慢性扁桃体炎而进行了扁桃体摘除的观名患者，得到书面同意书后，获得了扁桃体摘除时的扁桃体样品。扁桃体摘除后，立即使用iTrizol (invitrogen)进行RNA提取，以RNA 形式进行保存。关于IgA肾病患者的扁桃体的研究，在得到大阪大学医学部附属医院伦理委员会的许可后实施。(2)基于DGGE(变性梯度凝胶电泳)法的扁桃体菌群的网罗性分析将由IgA肾病的患者以及慢性扁桃体炎的患者的扁桃体得到的RNA进行反转录， 以所得到的cDNA为模板，使用针对细菌的16S核糖体RNA的V6 · V8区域的PCR引物组通用细菌引物卯4f (CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG G、序列号 35)禾Π 1369r (GCCCGGGAACGTATTCACCG、序列号 36)进行 PCR(参考文献Yu，Z. and Μ. Morrison, Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(8) :p. 4800-6.)。各 PCR 反应液含有 IOOng的DNAUOpmol的各引物、0. 16mM的三磷酸脱氧核苷酸、5 μ L的IOXBlend Taq缓冲液(东洋纺)和1.25U的Blend Taq聚合酶(东洋纺)，用蒸馏水调节最终容量为50 μ L。 PCR的条件为第1次在95°C下进行4分钟的融化、在95°C下进行30秒钟的变性、在61°C 下进行30秒钟的退火并在72°C下进行1分钟的延伸，然后，以0. 5°C的间隔降低退火温度， 同时在95°C下进行4分钟的融化、在95°C下进行30秒钟的变性、在各循环的温度下进行30 秒钟的退火并在72°C下进行1分钟的延伸，共进行10个循环。进而，使用56°C的延伸
夕；^〒> * 3 >)进行25个循环，最后在72°C下进行2小时的延伸。使用DCode 通用突变检测系统(Bio-Rad laboratories)，将 PCR 产物在 82V、60°C 下进行15小时的电泳。电泳用凝胶使用丙烯酰胺/N，N’ -甲叉双丙烯酰胺30%溶液四 1 (Bio-Rad laboratories，目录号161-0156)制作。标志物使用 DGGE Marker 11(10 片段) (株式会社日本基因，目录号:315-06404)。电泳后的凝胶用STOR Green I(LonZa，罗克兰， 缅因州，美国)染色，然后使用凝胶摄影装置GelDoc XR(Bio-Rad laboratories)得到各样品的条带的位置和强度(条带的浓度)的数据(参考文献MuyZer，G· , et al. ,Denaturant gradient gel electrophoresis in microbial ecology. Molecular Microbial Ecology Manual, Vol. 3. 4. 4，1998 :p. pp. 1-27.)。对于所得到的条带的位置和强度的数据进行多变量分析(PLS-DA)，由此显示出在 IgA肾病和慢性扁桃体炎之间扁桃体菌群是不同的。另外，通过进行加载绘图分析(Loading plot analysis)，发现了 IgA肾病的特征性条带。电泳的结果示于图1。图1中，染色的条带分别表示存在于扁桃体中的菌，箭头A、B和C所示的条带是IgA肾病的特征性条带。将这些条带切出，进行TA克隆，根据常规方法确定碱基序列，与公知的基因数据库收录的碱基序列进行同源性检索，结果可知，A的条带与密螺旋体属细菌(Tr印onema sp.)显示出高同源性，B的条带与惰性嗜血杆菌(Haemophilus segnis)显示出高同源性，C的条带与直肠弯曲杆菌(CampylcAacterrectus)显示出高同源性。对于68名IgA肾病患者和28名慢性扁桃体炎患者，将上述A、B、C的条带所对应的细菌的阳性率示于表1。使用t检验进行数据的统计学分析。由表1可知，IgA肾病患者的扁桃体中存在密螺旋体(Ti^ponema)属的细菌、嗜血杆菌(Haemophilus)属的细菌、弯曲杆菌(Campylobacter)属的细菌的概率高。其中，关于嗜血杆菌(Haemophilus)属的细菌，已经报道了在IgA肾病患者的肾小球内和血清中检测到副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)的构成成分(Suzuki, et al. Lancet 1994)，从而暗示出其与IgA肾病的关联，但是，IgA肾病患者的扁桃体中密螺旋体属的细菌和弯曲杆菌属的细菌的阳性率高是本次才获知的，由此证实了检测扁桃体中的密螺旋体属的细菌或弯曲杆菌属的细菌的存在对于IgA肾病的诊断是有用的。[表1]
权利要求
1.一种IgA肾病的预测方法，其特征在于，包括对来自被测者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属(Ti^ponema)细菌或弯曲杆菌属(Campylobacter)细菌进行检测的步骤。
2.如权利要求1所述的IgA肾病的预测方法，其特征在于，所述步骤中，对密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性的核酸进行检测。
3.如权利要求1所述的IgA肾病的预测方法，其特征在于，所述步骤中，使用与密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。
4.如权利要求1所述的IgA肾病的预测方法，其中，密螺旋体属细菌选自通过以下PCR 检测出的细菌中的一种以上所述PCR中，以从密螺旋体属细菌提取的总RNA反转录所得到的cDNA作为模板，并且使用序列号1表示的碱基序列构成的引物和序列号2表示的碱基序列构成的引物组合而成的引物组。
5.如权利要求1所述的IgA肾病的预测方法，其中，密螺旋体属细菌为选自由齿垢密螺旋体(Ti^ponema denticola)、文氏密螺旋体(Ti^ponema vincentii)、媒介密螺旋体(Ti^ponema medium)、索氏密螺旋体(Ti^ponema socranskii)、蚀疮溃疡密螺旋体 (Treponema phagedenis)、食果月交密il旋体(Treponema pectinovorum)、食淀粉密il旋体 (Treponema amylovorum)、 嗜麦芽糖密螺旋体(Tr印onema maltophilum)、布氏密螺旋体 (Treponema bryantii)(Treponema pallidum) >Bf(Treponema saccharophilum)和产琥珀酸密螺旋体(Treponema succinifaciens)组成的组中的一种以上。
6.如权利要求1所述的IgA肾病的预测方法，其中，弯曲杆菌属细菌为选自由直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯 ffiff ^ (Campylobacter coli) > M BJ ^ ffi ff ^ (Campylobacter concisus)、曲胃曲杆菌(Campylobacter curvus)、昭禾口弯曲杆菌(Campylobacter showae)、粘膜弯曲杆菌(Campylobacter mucosalis)、月台儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、猪肠弯曲杆菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液弯曲杆菌(Campylobacter sputorum)、瑞士弯曲杆菌(Campylobacter helveticus)、乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis)禾口红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)组成的组中的一种以上。
7.如权利要求1 6中任一项所述的IgA肾病的预测方法，其特征在于，被测者在尿蛋白检查和尿潜血检查的至少一项中被判断为阳性。
8.一种试剂盒，用于预测IgA肾病，其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一种以上(a)用于特异性检测密螺旋体属细菌的引物组；(b)用于特异性检测弯曲杆菌属细菌的引物组；(c)与密螺旋体属细菌特异性结合的抗体；和(d)与弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。
9.一种IgA肾病患者的选择方法，用于选择对于IgA肾病的治疗进行扁桃体摘除有效的IgA肾病患者，其特征在于，包括对来自IgA肾病患者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌进行检测的步骤。
10.一种IgA肾病患者的选择方法，用于选择对于IgA肾病的治疗进行扁桃体摘除和类固醇脉冲疗法有效的IgA肾病患者，其特征在于，包括对来自IgA肾病患者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌进行检测的步骤。
11.如权利要求9或10所述的IgA肾病患者的选择方法，其特征在于，所述步骤中，对密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性的核酸进行检测。
12.如权利要求9或10所述的IgA肾病患者的选择方法，其特征在于，所述步骤中，使用与密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。
13.如权利要求9或10所述的IgA肾病患者的选择方法，其中，密螺旋体属细菌选自通过以下PCR检测出的细菌中的一种以上所述PCR中，以从密螺旋体属细菌提取的总RNA 反转录所得到的cDNA作为模板，并且使用序列号1表示的碱基序列构成的引物和序列号2 表示的碱基序列构成的引物组合而成的引物组。
14.如权利要求9或10所述的IgA肾病患者的选择方法，其中，密螺旋体属细菌为选自由齿垢密螺旋体、文氏密螺旋体、媒介密螺旋体、索氏密螺旋体、蚀疮溃疡密螺旋体、食果胶密螺旋体、食淀粉密螺旋体、嗜麦芽糖密螺旋体、布氏密螺旋体、梅毒密螺旋体、嗜糖密螺旋体和产琥珀酸密螺旋体组成的组中的一种以上。
15.如权利要求9或10所述的IgA肾病患者的选择方法，其中，弯曲杆菌属细菌为选自由直肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、简明弯曲杆菌、曲形弯曲杆菌、昭和弯曲杆菌、粘膜弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、猪肠弯曲杆菌、痰液弯曲杆菌、瑞士弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌组成的组中的一种以上。
16.一种试剂盒，用于选择对于IgA肾病的治疗进行扁桃体摘除有效的IgA肾病患者， 其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一种以上(a)用于特异性检测密螺旋体属细菌的引物组；(b)用于特异性检测弯曲杆菌属细菌的引物组；(c)与密螺旋体属细菌特异性结合的抗体；和(d)与弯曲杆菌属细菌特异性结合的抗体。
全文摘要
通过检测来自在尿蛋白检查和尿潜血检查的至少一项中被判断为阳性的被测者或者被诊断为IgA肾病的患者的扁桃体的试样中存在的密螺旋体属细菌或弯曲杆菌属细菌，能够在不对被测者造成躯体上的负担的情况下，简便且迅速地以高概率预测IgA肾病。另外，能够在不对被测者造成躯体上的负担的情况下，简便且迅速地以高概率选择出对于IgA肾病的治疗扁桃体摘除有效的IgA肾病患者。
文档编号C12N15/09GK102317453SQ20108000770
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月10日 优先权日2009年2月12日
发明者大野博司, 猪阪善隆, 福田真嗣, 长泽康行, 饭尾健一郎 申请人:国立大学法人大阪大学