减毒活疫苗的制作方法

专利名称：减毒活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用在疫苗组合物中的在个体中维持的减毒活细菌的产生，具体而言，本发明涉及去除细菌的至少一种ABC-转运蛋白的功能，从而产生在个体中维持并可用在疫苗组合物中的减毒细菌。
背景技术：
细菌感染由于导致发病和大量死亡而对畜牧业造成巨大的经济损失，并且对人类健康具有显著影响。具体而言，呼吸道感染和败血病是常见的感染性疾病，其可在整个动物群或人(个体)群中蔓延并对那些个体的健康产生不利影响。这可导致生产率显著下降， 并最终导致个体的死亡。例如病原菌，尤其是支原体属属(Mycoplasma)的病原菌是呼吸道疾病的主要诱因。败血病通常由大肠杆菌(E.coli)引起。据了解，包含经减毒的诸如细菌或病毒的病原微生物的疫苗组合物可在被接种的动物和人体中有效产生保护性的免疫应答。这种减毒活疫苗是有利的，因为免疫后，由疫苗所依赖的病原有机体所产生的后续激发导致最初由接种所诱导的免疫应答的快速再次激发。该作用为抑制病原体增殖并防止临床相关疾病的发展。通常，通过完全或部分去除一种或多种毒力因子使得有机体不再是病原性的来实现用在疫苗中的病原有机体的减毒。所公知的毒力因子具有直接致病和/或允许有机体在宿主中维持的那些特性。促进有害宿主应答的那些特性也是公知的毒力因子。通常的毒力因子包括例如，毒素、附着胞器(attachment organelle)和免疫逃避机制。这提出的问题在于多种毒力因子参与诱导免疫，并且因此毒力因子的缺失使得以这种方式被减毒的有机体的免疫原性减弱。减毒活疫苗优选仍是抗原性的，并且因此能诱导充足水平的宿主免疫， 同时是非病原性的。通常，减毒活疫苗不在个体中维持，并且这可归于疫苗所依赖的减毒活有机体的免疫原性的降低。尽管诸如毒素的某些毒力因子是用于减毒的明显靶标，但是不被认为是毒力因子的因子不是用于减毒的明显靶标。那些因子对有机体毒力的减毒效应不明显或不容易预测。ABC(ATP-结合盒)转运蛋白超家族的成员通常不被认为是毒力因子。ABC转运蛋白包含功能是穿过细胞内膜和细胞外膜转送底物的膜蛋白。由ABC转运蛋白运送的物质包括肽、寡肽、蛋白质、代谢产物、脂质、固醇和药物。ABC转运蛋白的序列比较表明，该超家族的基因和蛋白质在远源相关的门类中是保守的。本发明基于这个出人意料的发现如在在宿主-疾病模型系统中所评价的，病原有机体中ABC-转运蛋白基因的功能突变缺失使该病原有机体减毒，但是该减毒有机体保持免疫原性，且在个体中维持。
发明概述第一方面，提供了通过至少一种ABC转运蛋白基因的突变而被减毒的细菌，其中所述突变使得相应的ABC转运蛋白没有功能，并且其中所述减毒细菌在个体中维持。第二方面，提供了使细菌减毒的方法，所述方法包括使至少一种ABC转运蛋白基因突变，并且其中所述减毒细菌在个体中维持。第三方面，提供了包含至少一种第一方面的减毒细菌的免疫原性组合物。第四方面，提供了疫苗组合物，包含免疫原性有效量的至少一种第一方面的减毒细菌和药理学上可接受的载体。第五方面，提供了用于治疗或预防疾病的疫苗组合物的用途，其中所述疫苗组合物包含至少一种第一方面的减毒细菌。第六方面，提供了预防或改善个体疾病的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效剂量的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物包含至少一种第一方面的减毒细菌。第七方面，提供了预防疾病的方法，所述方法包括给予需要预防的个体治疗有效剂量的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物包含至少一种第一方面的减毒细菌。在一个实施方案中，可以通过插入、缺失、取代或以上的任意组合来产生突变，所述插入突变例如可以通过同源重组、转座子诱变和序列标签诱变来产生。在一个实施方案中，所述ABC转运蛋白基因可以是编码ABC-肽转运蛋白的基因。 例如 CvaB、CylB, SpaB、NisT、EpiT、ComA, PedD, LcnC、McbEF, OppD 和 DppD 以及它们的同源物，并且特别是ABC转运蛋白基因可以编码OppD。在一个实施方案中，所述细菌可以选自禽杆菌属(Avikicterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、布鲁氏菌属(Brucella)、巴尔通氏体菌属(Bartonella)、博德特氏菌属(Bordetella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、弧菌属(Vibrio)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、梭菌属(Clostridium)、弯曲杆菌属 (Campylobacter)、衣原体属(Chalmydia)、考克斯氏体属(Coxiella)、丹毒丝菌属 (Erysipelothrix)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、李斯特氏菌属(Listeria)、放线
(Actinobacillus) > Bf ifil ^ M (Haemophilus) > ff ^ M (Helicobacter)、H 胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、支原体属(Mycoplasma)、分支杆菌属 (Mycobacterium)、曼海姆氏菌属(Mannheimia)、鸟杆菌属(Ornithobacterium)、立克次氏体属(Rickettsia)、尿支原体属(Ureaplasma)和巴斯德氏菌属(Pasteurella)。减毒细 ^X^nT^^SOXl^ff ‘ (Avibacterium paragallinarum) >-^ff ^ ‘ (Bordetella avium) > - If lif (Ornithobacterium rhinotracheale)Π 1 lif (Salmonella
enteritidis)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血曼海姆氏菌 (Mannheimia haemolytica)、大肠杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)、甲鸟支原体(Mycoplasma anatis)、鹅支原体(Mycoplasma anseris)、模仿支原体(Mycoplasma imitans)、产喊支原体(Mycoplasma alkalescens)、 精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛目艮支原体(Mycoplasma bovoculi)、力口禾Ij福尼亚支原体(Mycoplasma californicum)、山羊支原体(Mycoplasma capricolum)、殊异支原体(Mycoplasma dispar)、涯猫支原体(Mycoplasma felis)、 发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、猪月市炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、猪关节液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)、衣阿华支原体(Mycoplasma iowae)、蕈状支原体蕈状亚种(Mycoplasma mycoides subsp mycoides)大集落和小集落、鸡败血支原体(Mycoplasma gallis印ticum)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、□腔支原体(Mycoplasma orale)、穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、羊月市炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、鸡气管支原体(Mycoplasma pullorum)、Mycoplasma alligatorus、月市炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、Mycoplasma maleagridis、猫血支原体(Mycoplasma haemofelis)、Mycoplasma haemominutum、 Mycoplasma haematoparvum0 在一个实施方案中，细菌可以是禽病原性大肠杆菌菌株E956或鸡败血支原体菌株Ap3AS。 在一个实施方案中，所述减毒活细菌可以表达异源抗原。所述异源抗原可以由另一种病原有机体的核酸编码。编码异源抗原的核酸可从以下属中分离禽杆菌属、芽孢杆菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体菌、博德特氏菌属、伯克氏菌属、弧菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、考克斯氏体属、丹毒丝菌属、弗朗西丝氏菌属、李斯特氏菌属、放线杆菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、链球菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、支原体属、分支杆菌属、曼海姆氏菌属、鸟杆菌属、立克次氏体属、葡萄球菌Staphylococci)、尿支原体属和巴斯德氏菌属。编码异源抗原的核酸尤其可来源于副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、肠炎沙门氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪肺炎支原体、鸡败血支原体或关节液支原体、副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、无乳支原体、产碱支原体、鸭支原体、鹅支原体、模仿支原体、精氨酸支原体、微小脲原体、关节炎支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体、牛眼支原体、加利福尼亚支原体、山羊支原体、殊异支原体、狸猫支原体、发酵支原体、生殖道支原体、人型支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体、衣阿华支原体、蕈状枝原体蕈状亚种大集落和小集落、鸡败血支原体、关节液支原体、口腔支原体、穿透支原体、羊肺炎支原体、鸡气管支原体、Mycoplasma alligatorus、肺炎支原体、支原体属、Mycoplasma maleagridis、猫血支原体、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum。编石马异源抗原的核酸可从选自以下的病毒分离新城疫病毒(Newcastle Disease virus)、传染性支气管炎病毒、禽肺病毒、鸟痘病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、雏鸡传染性贫血病毒、马立克氏病病毒。
所述个体为脊椎动物，包括人类、牛类、犬类、猫类、山羊类、绵羊类、猪类、骆驼类 (camelid)、马类和禽类。所述牛类个体可以是母牛、公牛、野牛或水牛。所述犬类个体可以是狗。所述猫类个体可以是猫。所述山羊类个体可以是山羊。所述绵羊类个体可以是绵羊。所述猪类个体可以是猪。所述骆驼类个体可以是骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼、瘦驼或骆马。所述马类个体可以是马、驴、斑马或骡。所述禽类个体可以是任何商购的或驯养的禽类。特别是，所述禽类可以是雏鸡(包括矮脚鸡)、火鸡、鸭、鹅、雉、鹌鹑、山鹑、鸽、珍珠鸡、 鸵鸟、鸸鹋或孔雀。所述疫苗组合物和免疫原性组合物还可以包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，例如水、盐水、培养液、稳定剂、碳水化合物、蛋白质、诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂和缓冲液或以上的任意组合。所述稳定剂可以是SPGA。所述碳水化合物包括例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、 葡萄糖、葡聚糖或以上的组合。此外，诸如白蛋白或酪蛋白的蛋白质或诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂可用作药学上可接受的载体或稀释剂。用作药学上可接受的载体或稀释剂的缓冲液包括马来酸盐、磷酸盐、CABS、哌啶、 甘氨酸、柠檬酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸盐、 琥珀酸盐、MES、组氨酸、双-tris (bis-tris)、磷酸盐、乙醇胺、ADA、碳酸盐、ACES、PIPES、咪唑、双三羟基甲氨基丙烷、BES、MOPS、HEPES, TES、MOPSO, MOBS、DIPSO、TAPSO, TEA、焦磷酸盐、HEPPSO、POPSO、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、胼、双甘氨肽、TRIS、EPPS、二(羟乙基)甘氨酸、HEPBS, TAPS、AMPD, TABS、AMPS0、牛磺酸、硼酸盐、CHES、甘氨酸、氢氧化铵、 CAPS0、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS或以上的任意组合。所述疫苗组合物和免疫原性组合物可以是低压冻干的或冷冻干燥的。在某些实施方案中，所述疫苗组合物或免疫原性组合物海可以包含至少一种佐剂。佐剂的实例包括弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油、卡波姆氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、油乳剂(例如Bayol F 或Marcol 52 中的)、皂苷或维生素-E增溶剂或以上的任意组合。在某些实施方案中，所述疫苗组合物可以包含尤其可应用于粘膜的佐剂，例如大肠杆菌不耐热毒素或霍乱毒素。所述疫苗组合物或免疫原性组合物可以经鼻内给药、眼科给药、皮内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、口服给药、气雾剂(喷雾接种)给药、经泄殖腔或肌内给药。当个体是禽类时，优选滴眼剂和气雾剂给药。当将疫苗组合物或免疫原性组合物给予大量的个体而言，尤其优选喷雾给药。所述免疫原性组合物或疫苗组合物每剂量可以包含至少约IO3-约IO5个减毒细菌、或者约IO5-约IO7个减毒细菌、或者约IO7-约IO9个减毒细菌、或者约IO9-约IO11个减毒细菌、或者约IO11-约IO13个减毒细菌、或者约IO13-约IO15个减毒细菌、或者约IO15-约 IO17个减毒细菌、或者约IO17-约1019、或者至少约IO19个减毒细菌。定义如在本申请中所用，单数形式“a (—个)”、“an (一个)，，和"the (这个)”包括复数形式，除非文中明确指出不是复数。例如术语“an ABC转运蛋白”也包括多个ABC转运蛋白。在本说明书的背景下，术语“包含(comprising)”表示“主要包括，而不是必需只包含”。此外，该词“包含(comprising)”的变体，例如“包含(comprise) ”和“包含 (comprises)，，具有相应变化的含义。本文所用的术语“免疫原性有效的”表示接种时或给予免疫原性组合物时，给予的减毒活细菌的量足以在个体中诱导针对毒力形式的细菌的有效免疫应答。
本文所用的术语“治疗(treating) ”和“治疗(treatment) ”指的是治疗疾病状况或症状、预防疾病状况或疾病建立或无论以任何方式预防、阻止、延迟或逆转疾病状况或疾病的进程或其它不需要的症状的任何或全部用途。本文所用的术语“维持(persist) ”和“维持(persistent) ”指的是建立和/或维持至少一部分个体的感染或建群。维持包括有机体在组织中存活的状态，无论复制与否。维持可与临床相关疾病有关或无关。附图简要说明

图1是成分和实验方案的示意性设计。A.信号标记的转座子(signature-tagged transposon) ^ *结构。B· /[言号 +示i己的"(signature-tagged mutagenesis, STM)实验的设计图2是对特定标签的检测。利用P2/P4引物对通过PCR筛查显示出色变的肉汤培养物(broth culture)，以检测各自的信号标签。每一样品与DNA大小标志物(用HaeIII 消化的PUC18) —起在2%的琼脂糖凝胶中电泳。泳道1，携带标签02的ST突变体；泳道2， 携带标签03的ST突变体；泳道3，携带标签04的ST突变体；泳道4，携带标签06的ST突变体；泳道5，携带标签07的ST突变体；泳道6，阴性对照。泳道7，含有携带标签02的转座子的质粒作为模板的阳性对照。图3是对STM转化体的证实。利用P2/P4引物对通过PCR筛查显示出色变的转化体，以证实个体信号标签的存在。每一样品(ample)与用HaeIII消化的pUC18d的DNA大小标志物一起在2%的琼脂糖凝胶中电泳。泳道1，含有标签02的重组Mg ；泳道2，标签03 转化体；泳道3，标签04克隆；泳道4，标签06转化体；泳道5，携带标签07的转化体；+，用标签02质粒作为模板的阳性对照。_，未添加模板的阴性对照。图4是确证筛选的实验设计。图5是ST突变体的序列和Southern印迹分析。A.直接测序所获得的电色图谱。(I).携带单转座子的ST突变体沈-2，具有的可读序列并入基因组。在ST突变体15-1(11)和25-1(111)中，在转座子和宿主菌株基因组的连接点处能观察到混合的序列信号。B.通过Southern印迹所检测的多重插入。泳道1，ST突变体15-1 ；泳道2，ST突变体15-2 ；泳道3，ST突变体15-3 ；泳道4，ST突变体25_1 ；泳道5，ST突变体25_2 ；泳道 6，ST突变体25-3。DNA大小标准品是用HindIII消化的噬菌体λ DNA。图6是毒力和感染力研究中鸟的RSA的分布和气囊损伤评分。Α.感染2周后的 RSA评分。B.气囊损伤评分。组1，阴性对照；组2，经ST突变体04-1感染；组3，经ST突变体33-1感染；组4，经ST突变体03-1感染；组5，经ST突变体感染；组6，经ST突变体18-1感染；组7，经ST突变体20-1感染；组8，经ST突变体22_1感染；组9，阳性对照 (经野生型Ap3AS感染)。图7是鸟的RSA分布和气囊损伤评分。A.第28天时的RSA评分。B.气囊损伤评分。6个不同气囊评分的总和。组1，阴性对照；组2，阳性对照(经野生型Ap3AS感染)； 组3，接种对照(接种ST突变体沈-1)；组4，经接种(ST突变体26-1)和激发(经野生型 Ap3AS 感染)。图8.用于同源重组的PCR构建体的示意图。用所述的寡核苷酸引物产生PCR产物。利用引物对TX/TY扩增卡那霉素基因，用于oppA和dppD基因构建体。对于oppD，通过利用WS/WU和WY/WT的其它PCR产物或对于dppD，通过在PCR中利用60个核苷酸的引物 WE/WF来产生和添加构建体臂。图9.利用PCR对同源重组的检测。dppD(A面)和oppD(B面)基因的寡核苷酸引物用在PCR中，以利用oppD的引物对WS/WT和dppD的引物对TZ/UA在大肠杆菌菌株中扩增各自的区:Ε956 (Α和B面的泳道1)、Δ dppD (Α面的泳道1)和Δ oppD (B面的泳道1)。图10.大肠杆菌E956dppD和oppD敲除体的Southern印迹。对卡那霉素、dppD和 oppD探针进行放射性标记，并用来探测I3Stl限制性的大肠杆菌E956、Δ dppD和Δ oppD的基因组DNA，分别为泳道1、2和3。详细描述本发明涉及在个体中维持的减毒活细菌及其在疫苗组合物中的用途。所述减毒细菌由于编码ABC转运蛋白的核酸发生突变而缺少至少一种功能性的ABC转运蛋白。可以借助任何手段使得ABC转运蛋白没有功能，但是这通常通过编码ABC转运蛋白的核酸的突变来实现。通常，所述突变是插入、缺失或移码突变或以上的任何组合。在某些实施方案中， 所述减毒活细菌还可以表达异源抗原。任何类型的细菌均可以按本发明被减毒，但是脊椎动物病原菌且尤其是禽病原菌的减毒是优选的。细菌在一个实施方案中，本发明涉及用在疫苗组合物中的减毒活细菌但不限于放线杆菌属、气单胞菌属、禽杆菌属、杆菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体菌、博德特氏菌属、伯克氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、考克斯氏体属丹毒丝菌属、弗朗西丝氏菌属、李斯特氏菌属、放线杆菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、李斯特氏菌属、气单胞菌属、巴斯德氏菌属、链球菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、支原体属、分支杆菌属、鸟杆菌属、曼海姆氏菌属、弧菌属、立克次氏体属、假单胞菌属、葡萄球菌、尿支原体属和巴斯德氏菌属。这些菌属包括对禽和各种不同的动物包括人是病原性的大多数物种。特别是，减毒细菌可以是但不限于副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、肠炎沙门氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪肺炎支原体、鸡败血支原体、关节液支原体、无乳支原体、产碱支原体、鸭支原体、鹅支原体、模仿支原体、精氨酸支原体、微小脲原体、关节炎支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体、牛眼支原体、加利福尼亚支原体、山羊支原体、殊异支原体、狸猫支原体、发酵支原体、生殖道支原体、人型支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体、衣阿华支原体、蕈状枝原体蕈状亚种大集落和小集落、鸡败血支原体、关节液支原体、口腔支原体、穿透支原体、羊肺炎支原体、鸡气管支原体、Mycoplasma alligatorus、肺炎支原体、支原体属、Mycoplasma maleagridis、猫血支原体、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum。在一个实施方案中，所述减毒活细菌可以选自大肠杆菌或鸡败血支原体。所述大肠杆菌可以是禽病原性大肠杆菌E956，以及所述鸡败血支原体可以是鸡败血支原体Ap3AS。在个体中维持所述减毒活细菌在个体中维持。减毒细菌的维持优选在个体-疾病模型系统中评价，但是也可以在已经给予了本文描述的疫苗组合物或免疫原性组合物的个体中维持。可以通过观察临床体征和/或症状来评价减毒细菌的维持。可选地或此外，可以通过测定采自个体的样品中减毒细菌的存在来评价维持。所述样品可以是组织样品(例如血液、皮肤毛发、口腔拭子(buccal scraping))或者身体分泌物或排泄物样品，例如粘液、尿、粪便、泪液。可以在个体活着时或者在尸检或验尸时采集样品。可以通过培养、诸如ELISA或PCR 的分子方法或本领域内已知的任何方法来评估样品中减毒细菌的存在。此外，在尸检或验尸时观察个体的受影响的部位也可以确定减毒细菌在个体中的维持。ABC转运蛋白ATP-结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)形成了最大的蛋白质和基因超家族之一，在从原核生物到人类的所有门类中均有代表。ABC转运蛋白是利用ATP来运送物质穿过细胞膜的跨膜蛋白。这些物质包括代谢物、肽、寡肽、脂质和固醇和药物。 在细菌中，根据每种ABC转运蛋白转送底物的类型，将ABC转运蛋白细分成三个主要的组。这些组是蛋白质转运蛋白、肽转运蛋白和运送非蛋白质底物的系统。按照本发明，可以通过使任何这些类别中的至少一种ABC转运蛋白基因发生突变，使得细菌缺少至少一种功能性的ABC转运蛋白来产生减毒活细菌。特别感兴趣的是ABC-肽转运蛋白，其包括例如，CvaB(大肠杆菌)、CylB(粪肠球菌(Enterococcus faecalis) )、SpaB (枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、NisT (乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) 6F3)、EpiT (表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))、 ComA (月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)), PedD (乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici))、LcnC(乳酸乳球菌乳酸亚禾中(Lactococcus lactis subsp. Lactis))、 McbEF(大肠杆菌)、OppD和DppD (大肠杆菌和鸡败血支原体(M. gallisepticum))以及它们在其它物种中的同源物。个体预期被给予所述减毒活细菌的个体可以是任何脊椎动物，包括人类、牛类、犬类、 猫类、山羊类、绵羊类、猪类、骆驼类、马类和禽类。所述牛类个体可以是母牛、公牛、野牛或水牛。所述犬类个体可以是狗。所述猫类个体可以是猫。所述山羊类个体可以是山羊。所述绵羊类个体可以是绵羊。所述猪类个体可以是猪。所述骆驼类个体可以是骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼、瘦驼或骆马。所述马类个体可以是马、驴、斑马或骡。所述禽类个体可以是任何商购的或驯养的禽类。特别是，所述禽类可以是雏鸡(包括矮脚鸡)、火鸡、鸭、鹅、 雉、鹌鹑、山鹑、鸽、珍珠鸡、鸵鸟、鸸鹋或孔雀。突变用于产生非功能性的ABC转运蛋白的突变可以是插入、缺失或取代突变或以上的组合，只要所述突变导致不能表达功能性的ABC转运蛋白。ABC转运蛋白可具有多种功能， 例如ATP-结合或寡肽结合功能。非功能性的ABC转运蛋白包括至少一种功能是缺陷的ABC 转运蛋白。这类突变可以是插入、缺失、取代突变或以上的任意组合，只要所述突变导致不能表达功能性的ABC转运蛋白。在优选的实施方案中，所述突变是敲除突变，其中编码ABC转运蛋白的核酸的至少实质性部分是缺失的。例如可以通过同源重组、转座子诱变或序列标签诱变来产生插入突变。
可以通过多种方式来获得用于本发明的减毒活细菌。例如可以通过用诱变剂处理野生型细菌来制备减毒活细菌，所述诱变剂例如嘌呤或嘧啶类似物、紫外线、电离辐射、DNA 嵌入剂、温度处理、转座子诱变。这些方法不会将突变靶向特定的基因，因此需要通过本领域内已知的方法来筛查处理过的减毒的细菌，例如通过对靶基因的DNA序列分析并联合病原性研究。利用诸如定点诱变的已知方法的重组DNA技术可用来在特定基因(例如oppD)的预定位点引入突变。定点诱变可用来引入诸如一个或多个核苷酸的插入、缺失、替代的突变，使得该突变的基因不再表达功能性的ABC转运蛋白。这类突变例如可通过若干核酸的缺失来产生。少至单个碱基，进而产生移码的缺失能使得ABC蛋白没有功能。在某些实施方案中，缺失更多的碱基。在其它实施方案中，可以缺失大多数或全部编码ABC转运蛋白的基因。引入终止密码子或移码的突变适于获得非功能性的ABC转运蛋白。编码ABC转运蛋白的基因不仅包含编码序列，还包含调控序列，例如启动子。基因还包含用于纠正mRNA翻译所必需的区域，例如核糖体结合位点。因此，减毒活细菌所包含的突变不仅可以在编码区中，还可以或可选择地在转录和翻译所必需的序列中，例如在启动子和核糖体结合位点中。与自发突变所产生的减毒细菌相反，由诸如缺失ABC转运蛋白基因片段或缺失全部ABC转运蛋白基因或插入异源DNA片段或以上的组合的突变所产生的减毒细菌具有不能恢复为野生型病原菌的优势。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了其中至少一种ABC 转运蛋白基因包含插入和/或缺失的减毒活细菌。表达异源抗原的减毒细菌在一个实施方案中，所述减毒活细菌可以用作编码其它病原菌或病毒抗原的异源基因的载体。这允许减毒活细菌用来激发对多种疾病的免疫应答。编码ABC转运蛋白的基因可用作异源基因的插入位点。使用ABC转运蛋白基因作为插入点是有利的，因为编码异源抗原的序列的插入既失活了 ABC转运蛋白又引入了编码一种或多种异源抗原的序列。可以利用本领域内已知的标准技术常规地进行这类重组细菌的构建。另一个实施方案涉及选自禽杆菌属、葡萄球菌属Staphylococcus)、埃希氏菌属、布鲁氏菌属、沙门氏菌属、博德特氏菌属、伯克氏菌属、弧菌属、嗜血菌属、鸟杆菌属、曼海姆氏菌属、巴斯德氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、考克斯氏体属、丹毒丝菌属、 弗朗西丝氏菌属、李斯特氏菌属、放线杆菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、支原体属、分支杆菌属、立克次氏体属、尿支原体属和链球菌属的减毒活重组细菌，其不能产生功能性的ABC转运蛋白并且在其中插入了异源核酸。 异源核酸可以编码选自另一种病原微生物或病毒的抗原。核酸可以编码选自以下病原有机体的抗原副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、肠炎沙门氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、猪肺炎支原体、鸡败血支原体或关节液支原体、无乳支原体、产碱支原体、鸭支原体、鹅支原体、模仿支原体、精氨酸支原体、微小脲原体、关节炎支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体、牛眼支原体、加利福尼亚支原体、山羊支原体、殊异支原体、狸猫支原体、发酵支原体、生殖道支原体、人型支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体、衣阿华支原体、蕈状枝原体蕈状亚种大集落和小集落、口腔支原体、穿透支原体、羊肺炎支原体、鸡气管支原体、Mycoplasma alligatorus、肺炎支原体、支原体属、Mycoplasma maleagridis、猫血支原体、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum，或可以编码选自以下但不限于以下病毒的抗原新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽肺病毒、鸟痘病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、 鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、雏鸡传染性贫血病毒和马立克氏病病毒。在另一个实施方案中，ABC转运蛋白基因可以完全或部分由编码功能为引发或提高免疫应答的蛋白质的核酸替代，所述蛋白质例如白细胞介素或干扰素。疫苗组合物所述减毒活细菌适于用在疫苗组合物中。所述疫苗组合物可以包含能在个体中维持的免疫原性有效量的减毒活细菌和药学上可接受的载体或稀释剂。本文所述的疫苗组合物或免疫原性组合物可经鼻内给药、眼科给药、皮内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、口服给药、经泄殖腔给药、气雾剂(喷雾接种)或肌内给药。特别是，当个体是禽类时， 优选滴眼剂和气雾剂给药。当将疫苗组合物或免疫原性组合物给予大量的个体而言，尤其优选喷雾给药。在一种形式中，本发明提供了用于预防或治疗动物和人抗其非减毒形式包含ABC 转运蛋白基因的细菌感染的减毒活疫苗组合物。药学上可接受的载体或稀释剂可以选自水、盐水、培养液、稳定剂、碳水化合物、蛋白质、诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂和缓冲液或以上的任意组合。所述稳定剂可以是SPGA (每升 SPGA 含 74. 62g 蔗糖、0. 52g KH2PO4U. 25g K2HPO4, 0. 912g谷氨酸钾和IOg血清白蛋白)。用作药学上可接受的载体或稀释剂的碳水化合物例如是山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖或以上的组合。此外，诸如白蛋白或酪蛋白的蛋白质或诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂可用作药学上可接受的载体或稀释剂。同药学上可接受的载体或稀释剂磷酸缓冲液一样的缓冲液可以选自马来酸盐、磷酸盐、CABS (环己胺基)-1- 丁磺酸)、哌啶、甘氨酸、柠檬酸盐、双甘氨肽、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸盐、琥珀酸盐、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸水合物、4-吗啉乙磺酸)、组氨酸、双-tris(2，2-双(羟甲基)-2，2'，2〃 -三乙醇胺)、磷酸盐、乙醇胺、ADA(N-乙酰氨基)亚氨基二乙酸、N-(氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸)、碳酸盐、ACES (N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、PIPES (1，4-哌嗪二乙磺酸)、咪唑、双三羟基甲氨基丙烷(1，3_双[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)、BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、M0PS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、TES(2-[(2-羟基-l，l-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸)、M0PS0 (3-吗啉-2-羟基丙磺酸)、MOBS (4- (N-吗啉代)丁磺酸)、DIPSO (3- (N, N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)、TAPSO (2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-1-丙磺酸)、TEA (三乙醇胺)、焦磷酸盐、HEPPSO (4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)水合物)、P0PS0 (无水哌嗪-1， 4-双(2-羟基丙磺酸))、三羟甲基甲基甘氨酸、胼、双甘氨肽、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)、EPPSG-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、二(羟乙基)甘氨酸、HEPBS(N-(2-羟乙基) 哌嗪-N' -(4-丁磺酸))、TAPS([(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸)、 AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、TABS(N-三(羟甲基)甲基_4_氨基丁磺酸)、AMPSO (N- (1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、牛磺酸、硼酸盐、CHES (2-(环己胺基)乙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、甘氨酸、氢氧化铵、CAPSO (3-(环己胺基)-2-羟基-1-丙磺酸)、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS (3-(环己胺基)-1-丙磺酸)或以上的任意组合。通过添加稳定剂，所述疫苗组合物适于按照本领域内已知的方法低压干燥或冷冻干燥。因此，在实施方案中，所述疫苗组合物是冷冻干燥的或低压冻干的。在某些实施方案中，所述疫苗组合物可以包含至少一种具有佐剂活性的化合物。 适于用在疫苗组合物中的佐剂的实例可以选自弗氏完全或弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油、卡波姆氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、油乳剂(例如Bayol F 或Marcol 52 中的)、皂苷或维生素-E增溶剂或以上的任意组合。 在某些实施方案中，所述疫苗组合物可以包含尤其可应用于粘膜的佐剂，例如大肠杆菌不耐热毒素或霍乱毒素。可以将本发明的疫苗组合物配制成气雾剂(喷雾疫苗)使用。可以针对眼科用途配制本发明的疫苗组合物，例如以滴眼剂的形式配制。例如滴眼剂可以是水性滴眼剂、非水性滴眼剂、悬浮液滴眼剂或乳化滴眼剂。通过将减毒活细菌悬浮在水性溶剂或非水性溶剂中来制备滴眼剂，所述水性溶剂例如无菌蒸馏水、生理盐水溶液等，所述非水性溶剂例如包括棉籽油、大豆油、芝麻油、花生油的植物油、矿物油等。任选地，可以添加等渗剂、PH调节剂、增稠剂、悬浮剂、乳化剂和防腐剂。等渗剂包括例如氯化钠、硼酸、硝酸钠、硝酸钾、D-甘露醇、葡萄糖。pH调节剂包括硼酸、无水亚硫酸钠、盐酸、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸、醋酸钾、碳酸钠、硼砂和本文列出的任何缓冲液。增稠剂可以选自甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、硫酸软骨素钠、聚乙烯吡咯烷酮或以上的任意组合。悬浮剂可以选自聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧蓖麻油或以上的组合。此外，乳化剂的实例包括蛋黄卵磷脂和聚山梨醇酯80。此外可以使用的防腐剂例如苯扎氯胺、苄索氯铵、氯代丁醇、苯基乙醇、对羟基苯甲酸或以上的组合。剂量除了给药方式和接种所针对的病原体类型之外，给药剂量通常随年龄、体重和待接种的动物而改变。所述疫苗组合物可以包含足以激发免疫应答的任何剂量的细菌。例如剂量可以包含至少约IO3-约IO5个减毒细菌、或者约IO5-约IO7个减毒细菌、或者约IO7-约IO9个减毒细菌、或者约IO9-约IO11个减毒细菌、或者约IO11-约IO13个减毒细菌、或者约IO13-约IO15 个减毒细菌、或者约IO15-约IO17个减毒细菌、或者约IO17-约1019、或者至少约IO19个减毒细菌。在一个实施方案中，所述疫苗组合物可以作为气雾剂给药。治疗1立方米的剂量可以包含至少IO6-约IO8个减毒细菌或约IO8-约101°个减毒细菌、或约101°-约1012、或约 IO12-约IO14个减毒细菌、或约IO16-约IO18个减毒细菌、或约IO8-约102°个减毒细菌、或至少约102°个减毒细菌。给药方式本发明的疫苗组合物可以经鼻内给药、皮内给药、经泄殖腔给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、口服给药、气雾剂(喷雾接种)给药、于饮用水中给药、于食物中给药或肌内给药。为了应用于家禽，优选借助气雾剂和滴眼剂给药来给予。在存在待接种的多个个体的情况下，喷雾接种是特别优选的，因为其允许通过简单地使疫苗组合物雾化或产生疫苗组合物的气雾剂来接种大量的个体。疫苗组合物的雾化产生该疫苗组合物(减毒活细菌)的气雾剂，当该气雾剂被动物吸入时，减毒活病毒便被递送至动物，并侵入呼吸道，从而以呼吸道疾病的形象呈现。该接种方法特别有效，因为不需要对动物进行耗时的单独处理。现在通过参考以下具体的实施例来进一步更详细地描述本发明，不应以任何方式将这些实施例解释成对范围的限制。
实施例实施例1 鸡败血支原体突变体文库的创建和鉴定利用信号标记的诱变(STM)来产生并鉴定鸡败血支原体突变体文库。STM策略显示在图1中。将特有的DNA标签并入用来转化病原体的转座子，从而使该信号标签随机插入基因组中。偶尔，该信号标签(图1A)可以整合进基因并使其失活，产生插入突变。然后利用阴性选择过程在合适的动物模型中筛查ST突变体库。利用个体标签的PCR扩增，随后通过杂交，对输入库和从所述动物回收的ST突变体进行比较。该技术鉴定在输入库(预筛) 中存在，但在动物个体传代后回收的库中丢失的个体突变体(图1B)。这些丢失的突变体最可能在负责在个体中建群和生长的基因中含有突变，因此这些基因最可能编码毒力相关的决定因子。材料和方法细菌菌株和培养条件鸡败血支原体(Mg)Ap3AS最初从澳大利亚肉用仔雏鸡的气囊分离得到，并且是高度病原性的。使它于37°C在含10%猪血清的改良Frey肉汤(modified Frey，s broth,MB) 中生长，直到对数晚期(PH约6. 8)。信号标记的转座子利用携带转座子Tn4001mod的质粒ρ ISM 2062. 2来制备ST突变体文库，该质粒含有庆大霉素抗性基因。每个信号标签由特有的40bp的寡核苷酸DNA序列([NK]20;N = A、 C、G或T，K = G或Τ)组成，该DNA序列的侧翼是两个20bp的恒定臂，其能通过利用引物对 P2/P4或P3/P5的PCR来扩增和标记该特有区。将信号标签克隆入pISM 2062. 2的KpnI限制性位点(图1A)。各个信号标签的序列列于表1中。表1本研究所用的信号标签的DNA序列
权利要求
1.通过至少一种ABC转运蛋白基因的突变而被减毒的细菌，其中所述突变使得相应的 ABC转运蛋白没有功能，并且其中所述减毒细菌能在个体中维持。
2.如权利要求1所述的细菌，其中所述突变由插入、缺失、取代或以上的任意组合来产生。
3.如权利要求2所述的细菌，其中所述插入突变由同源重组、转座子诱变和序列标签诱变中的任一种或任意组合来产生。
4.如权利要求1所述的细菌，其中所述ABC转运蛋白基因编码ABC-肽转运蛋白。
5.如权利要求4所述的细菌，其中所述ABC-肽转运蛋白基因选自CvaB、CylB,SpaB, NisT, EpiT, ComA, PedD, LcnC, McbEF, OppD 和 DppD 以及它们的同源物。
6.如权利要求5所述的细菌，其中所述ABC转运蛋白基因是OppD。
7.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌选自禽杆菌属(Avikicterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、布鲁氏菌属(Brucella)、巴尔通氏体菌属(Bartonella)、博德特氏菌属(Bordetella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、弧菌属(Vibrio)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、梭菌属(Clostridium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chalmydia)、考克斯氏体属(Coxiella)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、李斯特氏菌属(Listeria)、放 ^ff ^M (Actinobacillus) > Bf ifil ^ M (Haemophilus) > ff ^ M (Helicobacter) > 单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Str印tococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、支原体属(Mycoplasma)、分支杆菌属 (Mycobacterium)、曼海姆氏菌属(Mannheimia)、鸟杆菌属(Ornithobacterium)、立克次氏体属(Rickettsia)、尿支原体属(Ureaplasma)禾口巴斯德氏菌属(Pasteurella)。
8.如权利要求7所述的细菌，其中所述细菌是副鸡禽杆菌(Avihcterium paragal 1 inarum) > - fl|# 1 lif (Bordetella avium) > #- ff lif (Ornithobacterium rhinotracheale)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)、大肠杆菌(E. coli)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae) ^zfeM^Hi.{φ (Mycoplasma alkalescens) > ？-1 !! .^ (Mycoplasma anatis) > 鹅支原体(Mycoplasma anseris)、模仿支原体(Mycoplasma imitans)、精氨酸支原体 (Mycoplasma arginini)、微小服原体(Ureaplasma parvum)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛目艮支原体(Mycoplasma bovoculi)、力口利福尼亚支原体(Mycoplasma californicum)、山羊支原体(Mycoplasma capricolum)、殊异支原体(Mycoplasma dispar)、狸猫支原体(Mycoplasma felis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、猪月市炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、猪关节液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)、衣阿华支原体(Mycoplasma iowae)、蕈状支原体蕈状亚种(Mycoplasma mycoides subsp mycoides)大集落禾口小集落、 鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae) > 口腔支原体(Mycoplasma orale)、穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、羊月市炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、鸡气管支原体(Mycoplasma pullorum)、Mycoplasma alligatorus、月市炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、支原体属(Mycoplasma)、Mycoplasma maleagridis、猫血支原体(Mycoplasma haemofelis)、Mycoplasma haemominutum、 Mycoplasma haematoparvum0
9.如权利要求8所述的细菌，其中所述细菌是禽病原性大肠杆菌菌株E956或鸡败血支原体菌株Ap3AS。
10.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述减毒细菌表达异源抗原。
11.如权利要求10所述的细菌，其中所述异源抗原由来自相同或另一种病原有机体的核酸编码。
12.如权利要求11所述的细菌，其中所述编码异源抗原的核酸从选自以下的属中分离禽杆菌属、芽孢杆菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体菌属、博德特氏菌属、伯克氏菌属、弧菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、梭菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、考克斯氏体属、丹毒丝菌属、 弗朗西丝氏菌属、李斯特氏菌属、放线杆菌属、嗜血菌属、螺杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、链球菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、支原体属、分支杆菌属、曼海姆氏菌属、鸟杆菌属、立克次氏体属、尿支原体属和巴斯德氏菌属或以上的任意组合。
13.如权利要求12所述的细菌，其中所述编码异源抗原的核酸来源于副鸡禽杆菌、鸟博德特氏菌、鼻腔鸟杆菌、肠炎沙门氏菌、出血败血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、无乳支原体、产碱支原体、鸭支原体、鹅支原体、模仿支原体、精氨酸支原体、微小脲原体、关节炎支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体、牛眼支原体、加利福尼亚支原体、山羊支原体、殊异支原体、狸猫支原体、发酵支原体、生殖道支原体、人型支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体、衣阿华支原体、蕈状支原体蕈状亚种大集落和小集落、鸡败血支原体、关节液支原体、口腔支原体、穿透支原体、羊肺炎支原体、鸡气管支原体、Mycoplasma alligatorus、月市炎支原体、支原体、Mycoplasma maleagridis、猫血支原体、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum 或以上的任意组合。
14.如权利要求13所述的细菌，其中所述编码异源抗原的核酸从选自以下的病毒分离新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽肺病毒、鸟痘病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、雏鸡传染性贫血病毒、马立克氏病病毒或以上的任意组合。
15.如权利要求1所述的细菌，其中所述个体是脊椎动物。
16.如权利要求15所述的细菌，其中所述脊椎动物选自人类、牛类、犬类、猫类、山羊类、绵羊类、猪类、骆驼类、马类和禽类。
17.如权利要求15所述的细菌，其中所述牛类个体可以是母牛、公牛、野牛或水牛。所述犬类个体可以是狗。所述猫类个体可以是猫。所述山羊类个体可以是山羊。所述绵羊类个体可以是绵羊。所述猪类个体可以是猪。所述骆驼类个体可以是骆驼、单峰骆驼、美洲驼、 羊驼、瘦驼或骆马。所述马类个体可以是马、驴、斑马或骡。
18.如权利要求15所述的细菌，其中所述禽类个体可以是任何商购的或驯养的禽类。
19.如权利要求18所述的细菌，其中所述禽类选自雏鸡(包括矮脚鸡)、火鸡、鸭、鹅、 雉、鹌鹑、山鹑、鸽、珍珠鸡、鸵鸟、鸸鹋或孔雀。
20.使细菌减毒的方法，所述方法包括使至少一种ABC转运蛋白基因突变，并且其中权利要求1-19中任一项所述的减毒细菌在个体中维持。
21.预防或改善个体疾病的方法，所述方法包括给予所述个体治疗有效剂量的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物包含至少一种权利要求 1-19中任一项所述的减毒细菌。
22.预防疾病的方法，所述方法包括给予需要预防的个体治疗有效剂量的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物包含至少一种权利要求1-19 中任一项所述的减毒细菌。
23.免疫原性组合物，包含至少一种权利要求1-19中任一项所述的减毒细菌。
24.疫苗组合物，包含免疫原性有效量的至少一种权利要求1-19中任一项所述的减毒细菌和药理学上可接受的载体。
25.用于治疗或预防疾病的疫苗组合物的用途，其中所述疫苗组合物包含至少一种权利要求1-19中任一项所述的减毒细菌。
26.如权利要求23所述的免疫原性组合物或如权利要求M所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，所述药学上可接受的载体或稀释剂选自水、盐水、培养液、稳定剂、碳水化合物、蛋白质、诸如牛血清或脱脂乳的含蛋白质的试剂和缓冲液或以上的任意组合。
27.如权利要求沈所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述稳定剂可以是 SPGA。
28.如权利要求沈所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述碳水化合物选自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖或以上的组合。
29.如权利要求沈所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述蛋白质是白蛋白或酪蛋白。
30.如权利要求沈所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述含蛋白质的试剂是牛血清或脱脂乳。
31.如权利要求沈所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述缓冲液选自马来酸盐、磷酸盐、CABS、哌啶、甘氨酸、柠檬酸盐、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸盐、琥珀酸盐、MES、组氨酸、双-tris、磷酸盐、乙醇胺、ADA、碳酸盐、ACES、 PIPES、咪唑、双三羟基甲氨基丙烷、BES、MOPS、HEPES、TES、M0PS0、MOBS、DIPS0、TAPS0、TEA、 焦磷酸盐、HEPPS0、P0PS0、三羟甲基甲基甘氨酸、胼、双甘氨肽、TRIS、EPPS、二(羟乙基)甘氨酸、HEPBS, TAPS、AMPD, TABS、AMPS0、牛磺酸、硼酸盐、CHES、甘氨酸、氢氧化铵、CAPS0、碳酸盐、甲胺、哌嗪、CAPS或以上的任意组合。
32.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物是低压冻干的或冷冻干燥的。
33.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，还包含至少一种佐剂。
34.如权利要求33所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油、 卡波姆氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、油乳剂皂苷、维生素-E增溶剂或以上的任意组合。
35.如权利要求33所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述佐剂是大肠杆菌不耐热毒素或霍乱毒素。
36.如权利要求23-35中任一项所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物经鼻内给药、眼科给药、皮内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、口服给药、泄殖腔给药、气雾剂(喷雾接种)或肌内给药。
37.如权利要求23-36中任一项所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物经翼网(wing web)或滴眼剂给药。
38.如权利要求23-37中任一项所述的疫苗组合物或免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物或免疫原性组合物每剂量包含至少约IO3-约IO5个减毒细菌、或者约IO5-约IO7个减毒细菌、或者约IO7-约IO9个减毒细菌、或者约IO9-约IO11个减毒细菌、或者约IO11-约 IO13个减毒细菌、或者约IO13-约IO15个减毒细菌、或者约IO15-约IO17个减毒细菌、或者约 IO17-约1019、或者至少约IO19个减毒细菌。
全文摘要
本发明涉及通过至少一种ABC转运蛋白基因的突变而被减毒的细菌，其中所述突变使得相应的ABC转运蛋白没有功能，并且其中所述减毒细菌在个体中维持。
文档编号C12N1/36GK102317439SQ201080007679
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月17日 优先权日2009年2月20日
发明者曾启文, 格伦·弗朗西斯·布朗宁, 菲利普·弗朗西斯·马卡姆 申请人:澳大利亚家禽Crc有限公司