产生2n配子或未减数配子的植物的制作方法

专利名称：产生2n配子或未减数配子的植物的制作方法
产生2N配子或未减数配子的植物本发明涉及产生第二次分裂再组(Second Division Restitution, SDR)配子的植物，还涉及产生未减数配子(apomeiotic gamete)的植物，以及它们在植物育种中的用途。2n配子(也称为二倍体配子(diplogamete))是具有体细胞染色体数目而不是配子体染色体数目的配子。已经表明它们可用于几种作物的遗传改良(有关综述，参见(例如)RAMANNA & JAC0BSEN，Euphytica 133，3_18，2003)。具体地，二倍体配子的产生使得不同倍数水平的植物之间能够杂交，例如四倍体作物植物与其二倍体野生型亲缘植物之间的杂交，从而在植物育种项目中使用它们的遗传多样性。2η配子的形成来源于减数分裂期间的异常(有关综述，参见VEILLEUX，Plant Breeding Reviews 3，252-288，1985 或 BRETAGN0LLE & THOMPSON， New Phytologist 129， 1-22，1995)。在正常减数分裂中，染色体首先复制，从而产生了姐妹染色单体对。在该轮复制之后是两轮分裂称作减数分裂I和减数分裂II。减数分裂I期间，同源染色体重组并分离进入两个细胞，它们的每一个包含一套单倍体容量的染色体。在减数分裂II中，从减数分裂I中产生的两个细胞进一步分裂，姐妹染色单体分离。因此，由该分裂产生的孢子为单倍体并且带有重组的遗传信息。导致2η配子形成的异常特别地包括异常胞质分裂、跳过(skip)减数第一次或第二次分裂或者异常的纺锤体几何形状(有关综述，参见VEILLEUX，Plant Breeding Reviews 3,252-288，1985 或 BRETAGN0LLE & THOMPSON,New Phytologist 129，1-22，1995)。这些异常导致产生了不同类型的未减数配子。例如，减数第一次分裂的失败导致第一次分裂再组 (Firtst Division Restitution, FDR)配子，而减数第二次分裂的失败导致第二次分裂再组(SDR)配子。尽管已经在多种植物物种中报道了能够产生2η配子的多种突变体，但是到目前为止，仅仅在分子水平上鉴定并表征了一个与2η花粉形成有关的基因。命名为 AtPSl (Arabidopsis thaliana parallel spindles)的该基因的失活产生了二倍体雄性孢子，从而导致产生了有活力的二倍体花粉颗粒并且在子代中产生了自发的三倍体植物。在 2008年7月8日提交的欧洲专利申请08490672中和D' ERFURTH等人(PLoS Genet. 2008 Nov ；4(11) :el000274. Epub 2008 Nov 28)的出版物中公开了该基因及其在产生2n花粉中的用途。目前，本发明人已在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定了与植物中2η配子形成有关的另一个基因。本发明人已发现该基因的失活导致跳过减数第二次分裂。这产生了二倍体雄性和雌性孢子，从而导致产生了有活力的二倍体雄性和雌性配子， 即SDR配子。该基因在下文中将命名为OSDl (omission of second division)。拟南芥 (Arabidopsis thaliana)的OSDl基因序列可在TA^数据库中以登记号At3g57860获得， 或者在GenBank数据库中以登记号NM_115648获得。该基因编码243个氨基酸的蛋白质 (GenBank NP_191345)，其序列也在所附序列表中以SEQ ID N0:1表示。
之前在HASE等人(Plant J，46，317-26，2006)的出版物中已经将拟南芥 (Arabidopsis thaliana)的OSDl基因描述为“UVI4矿基因(UVI4-L)，该出版物描述了名为UVI4的其旁系同源基因。根据HASE等人，UVI4起到核内复制(endo-reduplication)抑制子的作用，并且其是维持有丝分裂状态所必需的，而OSDl (UVI4-L)似乎不是该过程所需要的。相反，如本文所示，OSDl似乎是使减数分裂I能够向减数分裂II过渡所必需的。本发明人还在水稻(Oryza sativa)中鉴定了拟南芥(Arabidopsis thaliana) OSDl基因的直系同源基因。水稻(Oryza sativa)OSDl基因的序列可在OryGenes或TAIR 数据库中以登记号0s02g37850获得。它编码了 234个氨基酸的蛋白质，其序列在所附序列表中以 SEQ ID NO:;35 表示。拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)的 OSDl蛋白在它们的序列全长上有23. 6%的同一性和35%的相似性。因此，本发明提供了获得产生第二次分裂再组2η配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下文中称作OSDl蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO 1 的AtOSDl蛋白或者与SEQ ID NO 35的OsOSDl蛋白有至少20%，以及按照优先性提高的顺序，至少 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 98%的序列同一性，或者有至少29%,以及按照优先性提高的顺序，至少35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95或98%的序列相似性。除非另外指明，否则本文所提供的蛋白序列同一性和相似性值是以缺省参数使用BLASTP程序或者使用尼德尔曼-文施(Needleman-Wunsch)全局比对算法(使用缺省参数的EMBOSS成对比对Needle工具)对序列全长计算的。相似性计算是使用得分矩阵 BL0SUM62进行的。根据本发明产生的SDR 2η配子在2η配子的所有常规应用中是有用的，例如， 用于产生多倍体植物或使不同倍数性水平的植物间能够杂交。它们还可用于基因作图方法，例如，美国专利申请20080057583中公开的“逆向子代基因作图(Reverse progeny mapping) ” 法。本发明人还发现通过将OSDl的失活与两个其它基因的失活相结合导致减数分裂完全被有丝分裂所取代但不影响随后的有性过程的基因型，所述两个其它基因中的一个基因(SP011-1)编码了植物中有效减数分裂重组所必需的蛋白质以及对其的抑制消除了重组和配对(GREL0N等人，Embo J，20，589-600，2001)，而其中的另一个基因(REC8， At2g47980)编码减数分裂期间着丝粒单极定向所必需的蛋白质(CHELYSHEVA等人，J Cell Sci, 118,4621-32,2005)以及对其的抑制改变了染色单体的分离。这种基因型在下文中被称作MiMe (有丝分裂代替减数分裂，mitosis instead of meiosis) 0有丝分裂对减数分裂的这种代替导致未减数配子，其保留了所有的亲代遗传信息(BICKNELL & K0LTUN0W，Plant Cell,16 Suppl，S228-45，2004)。

图1提供了下列项之机制之间比较的示意图有丝分裂、正常减数分裂、osdl突变体中的减数分裂、缺少SP011-1活性的突变体(Atspoll-Ι)中的减数分裂、缺少SP011-1和 REC8活性的双突变体(Atspol 1-1/Atrec8)中的减数分裂以及MiMe突变体中的减数分裂。在二倍体细胞的有丝分裂期间，染色体复制并且姐妹染色单体分离以产生子细胞，所述子细胞是二倍体的并且在遗传上与初始细胞相同。在正常减数分裂期间，一轮复制后是两轮染色体分离。在第一次分裂时，同源染色体重组并分离。减数分裂II更类似于有丝分裂，其导致姐妹染色单体平均分配。因此，所获得的孢子是单倍体且带有重组的遗传信息。在osdl突变体(本研究)中，减数分裂II被跳过，从而产生了二倍体孢子和具有重组遗传信息的SDR配子。Atspoll-I突变体经历了不平衡的第一次分裂，随后经历了第二次分裂，其导致不平衡孢子和不育。Atspol 1-1/Atrec8双突变体经历了有丝分裂样的分裂而不是正常的减数第一次分裂，随后经历了不平衡的第二次分裂，其导致不平衡孢子和不育。在 osdl/Atspoll_l/Atrec8 三突变体(MiMe)中，Atspoll-Ι 和 Atrec8 突变的存在导致了有丝分裂样的减数第一次分裂，而osdl突变的存在防止发生减数第二次分裂。因此，有丝分裂样分裂取代了减数分裂。所获得的孢子和配子在遗传上与初始细胞是相同的。可将MiMe突变体所产生的未减数配子以与SDR 2η配子相同的方式用于产生多倍体植物或者用于不同倍数性水平植物的杂交。对于无融合生殖(apomictic)植物(即下述植物能够从胚珠的母系组织中形成种子，产生的子代是母系亲代的遗传克隆)的产生来说，它们也是受到关注的。尽管在超过400种被子植物中存在，但是极少有作物物种是无融合生殖的，并且通过杂交引入该特性的尝试也失败了(SAVIDAN，The Flowering of Apomixis :From Mechanisms to GeneticEngineering 2001 ；SPILLANE等人，Sexual Plant Reproduction,14,2001)。因此，本发明的另一个目标是用于获得产生未减数配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下列蛋白质a)如上所定义的OSDl蛋白；b)在植物中参与减数分裂重组起始的蛋白质，所述蛋白质选自i)在下文中称作SP011-1蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO :2所示的SP011-1蛋白有至少40%，以及按照优先性提高的顺序，有至少45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少60%，以及按照优先性提高的顺序，有至少 65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性；ii)下文中称作SP011-2蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO :3所示的 SPOl 1-2蛋白有至少40%，以及按照优先性提高的顺序，有至少45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少60%，以及按照优先性提高的顺序，有至少 65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性；iii)下文中称作PRDl蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO :4所示的PRDl 蛋白有至少25%,以及按照优先性提高的顺序，有至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少35%，以及按照优先性提高的顺序，有至少 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 98%的序列相似性；iv)下文中称作PAIRl蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID N0:5所示的 PAIRl蛋白有至少30%,以及按照优先性提高的顺序，有至少35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少40%，以及按照优先性提高的顺序，有至少 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性；c)下文中称作Rec8蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO 6所示的Rec8 蛋白有至少40%，以及按照优先性提高的顺序，有至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98%的序列同一性，或者有至少45%，以及按照优先性提高的顺序，有至少50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95 或 98% 的序列相似性。SEQ ID NO :2 表示拟南芥(Arabidopsis thaliana) SP011-1 蛋白的序列。该序列可在Swissprot数据库中以登记号Q9M4A2获得。SEQ ID NO :3 表示拟南芥(Arabidopsis thaliana) SPOl 1-2 蛋白的序列。该序列可在Swissprot数据库中以登记号Q9M4A1获得。SEQ ID NO :4表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)PRDl蛋白的序列。该序列可在GenBank数据库中以登记号ABQU642获得。SEQ ID NO :5表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)PAIRl蛋白的序列。该序列可在GenBank数据库中以登记号NP_171675获得。SEQ ID NO :6表示拟南芥(Arabidopsis thaiiana)Rec8蛋白的序列。该序列可在GenBank数据库中以登记号NP_196168获得。SPOll-U SP011-2、PRDU PAIRl和Rec8蛋白在高等植物、单子叶植物和双子叶植物中是保守的。非限制性地例如单子叶植物中的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 SP011-U SP011-2、PRDU PAIRl和Rec8蛋白的直系同源物，可引用水稻(Oryza sativa) 的 SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 和 Rec8 蛋白。水稻(Oryza sativa) SP011-1 蛋白的序列可在GenBank中以登记号AAP68363获得；水稻(Oryza sativa) SP011-2蛋白的序列可在GenBank中以登记号NP_001061027获得；水稻(Oryza sativa)PRDl蛋白的序列可在GenBank中以登记号EAD0311获得；水稻(Oryza sativa)PAIRl蛋白的序列可在 SwissProt中以登记号Q75RY2获得；水稻(Oryza sativa) Rec8蛋白的序列可在GenBank中以登记号AAQ75095获得。可通过消除、阻断或降低它们的功能，或者有利地通过阻止或下调相应基因的表达，来获得上述 OSDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 或 Rec8 蛋白的抑制。举例来说，可通过诱变相应基因或其启动子，以及选择部分地或完全地丧失所述蛋白质活性的突变体，来获得所述蛋白质的抑制。例如，根据突变的性质，编码序列内的突变可诱导失活蛋白质或活性受损蛋白质的表达；同样地，启动子序列内的突变可引起所述蛋白质表达缺乏或减少。例如，可通过编码序列或者编码所述蛋白质之基因的启动子或其部分的靶向缺失来进行突变，或者可通过外源序列靶向插入到所述编码序列或者所述启动子中来进行突变。还可通过诱导随机突变来进行，例如，通过EMS诱变或随机插入诱变，接着筛选所需基因中的突变体。高通量诱变和筛选的方法在本领域中是可用的。举例来说，可参见 TILLING (定向诱导基因组局部突变，如McCallum等人，2000中所述)。在OSDl基因内的突变中，可根据该突变纯合的植物的表型特征来鉴定导致产生 SDR 2n配子能力的那些突变这些植物可形成至少5 %，优选地至少10 %，更优选地至少 20%，更优选地至少50%和最高100%的二分体形式的减数分裂产物。在参与植物中减数分裂重组起始之蛋白质的编码基因内的突变中，如SP011-1基因或SP011-2、PRDl或PAIRl基因，可根据该突变纯合的植物的表型特征(特别地，减数分裂I中存在单价染色体而不是二价染色体，和植物不育)来鉴定可用于获得产生未减数配子之植物的那些突变。
在具有REC8基因内突变的突变体中，可根据该突变纯合的植物的表型特征(特别地，减数分裂中染色体断裂，和植物不育)来鉴定可用于获得产生未减数配子之植物的那些突变。根据用于获得能够产生SDR 2n配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案， 所述方法包括a)提供在OSDl基因之等位基因内具有突变的植物，所述突变导致该等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；b)使步骤a)中的所述植物自交，以获得所述突变纯合的植物。根据用于获得能够产生未减数配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案，所述方法包括a)提供在OSDl基因之等位基因内具有突变的植物，所述突变导致该等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；b)提供在选自SP011-1、SP011-2、PRD1或PAIRl之基因的等位基因内具有突变的植物，所述突变导致所述等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；c)提供在REC8基因的等位基因内具有突变的植物，所述突变导致所述等位基因所编码蛋白质的抑制，所述植物对该突变是杂合的；e)将步骤a)、b)和c)中的植物杂交，以获得在OSDl基因之等位基因内具有突变、 在选自SP011-1、SP011-2、PRD1或PAIRl的基因之等位基因内具有突变以及在REC8基因之等位基因内具有突变的植物，所述植物对每个突变是杂合的；f)将步骤e)中的植物自交，以获得以下突变纯合的植物，即OSDl基因内的突变、 选自SP011-1、SPOl 1-2、PRDl或PAIRl的基因内的突变和REC8基因内的突变。作为替代，通过沉默相应基因来获得靶标蛋白质的抑制。用于植物中基因沉默的方法本身是本领域已知的。例如，可提及反义抑制或共抑制，例如美国专利5190065和 5283323中所述的。还可使用靶向所述蛋白质mRNA的核酶。一些优选的方法是通过RNA干扰(RNAi)诱导基因沉默的那些方法，其使用靶向待沉默基因的沉默RNA。在本领域中，有多种用于递送沉默RNA的方法和DNA构建体是可用的。在本文中，“沉默RNA”定义为可以序列特异性的方式通过与互补mRNA分子碱基配对使靶标基因沉默的小RNA。特别地，沉默RNA包括小干扰RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA)。起初，用于在植物中递送沉默RNA的DNA构建体包含靶基因cDNA的300bp或以上 (一般为300-800bp，尽管有时较短的序列也可诱导有效的沉默)的片段，其处于在所述植物中具有活性的启动子的转录控制之下。当前，更广泛使用的沉默RNA构建体是可产生发夹RNA(hpRNA)转录本的那些。在这些构建体中，靶基因的片段是反向重复的，一般在所述重复之间具有间隔区(有关综述，参见WATSON等人，2005)。还可使用针对待沉默基因的人工微小RNA(amiRNA)(有关植物中沉默RNA特别是包括amiRNA的设计和应用的综述，参见例如 OSSOffSKI 等人(Plant J.，53，674-90，2008))。本发明提供了用于沉默选自OSDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 的一个或更多个靶基因的工具，特别地，其包括靶向所述基因的hpRNA或amiRNA的表达盒。本发明的表达盒可包含，例如
-在植物细胞中有功能的启动子；-200至lOOObp，优选300至900bp的一个或更多个DNA构建体，每个构建体包含选自OSDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl和REC8的靶基因的cDNA片段或其互补片段，或者与所述片段有至少95%的同一性，以及按照优先性提高的顺序，有至少96^^97^^98% 或99%的同一性的片段，所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。根据本发明的一个优选实施方案，hpRNA的表达盒包含-在植物细胞中有功能的启动子，-一个或更多个发夹DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自OSDl、SPOll-U SP011-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 的基因的发夹 RNA ；所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。一般地，所述发夹DNA构建体包括i) 200至lOOObp，优选300至900bp的第一 DNA 序列，其由靶基因的cDNA片段组成，或者与所述片段有至少95%的同一性，以及按照优先性提高的顺序，有至少96^^97^^98%或99%的同一性；ii)与所述第一 DNA互补的第二 DNA序列，所述第一和第二序列方向相反以及ii)分隔所述第一和第二序列的间隔序列，从而这些第一和第二 DNA序列在转录时能够形成单个双链RNA分子。所述间隔序列可以是随机的DNA片段。然而，优选地，使用可由靶标植物细胞剪接的内含子。它的大小一般为400 至2000个核苷酸长。根据本发明的另一个优选实施方案，amiRNA的表达盒包含-在植物细胞中有功能的启动子，-一个或更多个DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自0SD1、SP011-U SP011-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 的基因的 amiRNA ；所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。有利地，本发明的表达盒包含靶向OSDl基因的DNA构建体。根据一个特别优选的实施方案，它包含靶向OSDl基因的DNA构建体、靶向选自SP011-1、SP011-2、PRD1和PAIRl 的基因的DNA构建体和靶向REC8的DNA构建体。在本领域中，有许多适于在植物中表达异源基因的启动子选择是可用的。例如，它们可获得自植物、植物病毒或细菌如农杆菌(Agrobacterium)。它们包括组成型启动子，即在大多数组织和细胞中以及大多数环境条件下具有活性的启动子，以及组织特异性或细胞特异性启动子，它们仅在或主要在某些组织或某些细胞类型中具有活性，和可诱导型启动子，它们被物理或化学刺激所激活，如来自线虫感染的刺激。植物细胞中常用的组成型启动子的非限制性实例有花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S 启动子、Nos启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶启动子(rubiseo promoter)、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子。可在本发明中使用的器官或组织特异性启动子特别地包括能够导致减数分裂相关表达的启动子，如DMCl启动子(KLIMYUK & J0NES，Plant J, 11,1-14,1997)；还可使用基因 OSDl、SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl 或 REC8 的任何内源启动子。 本发明的DNA构建体一般还包括转录终止子(例如，35S转录终止子或胭脂碱合酶 (Nos)转录终止子)。 本发明还包括含有本发明嵌合DNA构建体的重组载体。通常，所述重组载体还包含一个或更多个标记基因，其使得能够对转化宿主进行选择。对于本领域的一般技术人员来说，适合载体的选择以及将DNA构建体插入其中的方法是熟知的。载体的选择取决于预期宿主和所述宿主转化的预期方法。在本领域中，对于多种植物物种、双子叶植物或单子叶植物来说，植物细胞或植物的多种遗传转化方法是可用的。非限制性地例如，可提及病毒介导的转化、通过微量注射、通过电穿孔的转化、微弹轰击(microprojectile)介导的转化、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化等。本发明还提供了包含本发明的重组DNA构建体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核细胞，例如农杆菌(Agrobacterium)细胞，或者真核细胞，例如用本发明的DNA构建体遗传转化的植物细胞。所述构建体可瞬时表达；还可将它掺入到稳定的染色体外复制子中， 或整合到染色体中。根据用于提供能够产生SDR 2n配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案， 所述植物是转基因植物，以及所述方法包括a)用含有靶向OSDl基因的本发明DNA构建体的载体转化至少一个植物细胞；b)培养所述转化的植物细胞，以使得再生出植物，所述植物的基因组中具有包含所述DNA构建体的转基因。根据用于获得能够产生未减数配子之植物的本发明方法的一个优选实施方案，所述植物是转基因植物，以及所述方法包括a)用含有靶向OSDl基因的本发明DNA构建体的载体，含有靶向选自SP011-1、 SPOl 1-2,PRDl和PAIRl的基因的本发明DNA构建体的载体和含有靶向REC8基因的本发明 DNA构建体的载体转化至少一个植物细胞；b)培养所述转化的植物细胞，以使得再生出植物，所述植物的基因组中具有包含所述DNA构建体的转基因。根据用于获得能够产生未减数配子之植物的本发明方法的另一个优选实施方案， 所述植物是转基因植物，以及所述方法包括a)用含有靶向OSDl基因的本发明DNA构建体、靶向选自SPOl 1_1、SPOl 1_2、PRDl 和PAIRl的基因的本发明DNA构建体的载体和含有靶向REC8基因的本发明DNA构建体的载体转化至少一个植物细胞；b)培养所述转化的植物细胞，以使得再生出植物，所述植物的基因组中具有包含所述DNA构建体的转基因。本发明还涵盖了能够产生SDR 2n配子或未减数配子的植物，它们可通过本发明的方法获得。特别地，这包括包含下列的植物-OSDl基因内的突变，其中由于该突变，OSDl蛋白被抑制；和-选自SP011-1、SP011_2、PRDl或PAIRl基因之基因内的突变，其中由于该突变， 所述基因编码的SP011-1、SPOl 1-2、PRDl或PAIRl蛋白被抑制；和-REC8基因内的突变，其中由于该突变，RecS蛋白被抑制。这还包括被本发明的一个或更多个DNA构建体遗传转化的植物。优选地，所述植物是转基因植物，其中所述构建体包含在整合到植物基因组中的转基因中，从而使其在连续植物世代中传递。
靶向OSDl基因的嵌合DNA构建体的表达导致了 OSDl蛋白的下调，这为所述转基因植物提供了产生2n SDR配子的能力。靶向OSDl基因的嵌合DNA构建体，靶向选自 SPOl 1-1、SPOl 1-2、PRD1和PAIRl之基因的嵌合DNA构建体和靶向REC8基因的嵌合DNA构建体的共表达导致由这三个基因所编码的蛋白质的下调，并且为所述转基因植物提供了产生未减数配子的能力。本发明还涵盖了产生SDR 2η配子的方法，其中所述方法包括培养可通过本发明方法获得的植物，和回收由所述植物产生的配子。优选地，所述配子包含至少10%、更优选地至少20%，以及按照优先性提高的顺序，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90% 的有活力的2η配子。本发明还涵盖了产生未减数配子的方法，其中所述方法包括培养可通过本发明方法获得的植物，和回收由所述植物产生的配子。优选地，所述配子包含至少10%、更优选地至少20 %，并且按照优先性提高的顺序，至少30 %、40 %、50 %、或60 %、70 %、80 %或90 % 的有活力的未减数配子。本发明适用于农艺学所关心的广泛的单子叶植物或双子叶植物。非限制性地例如，可提及马铃薯、水稻、小麦、玉米、番茄、黄瓜、紫苜蓿、甘蔗、甘薯、木薯、苜蓿、大豆、麦草、香蕉、甜瓜、西瓜、棉花或观赏植物，如玫瑰、百合、郁金香和水仙。通过以下详细说明和附图，本发明的上述和其它目的和优势将变得显而易见。然而，应理解上述详细说明仅是示例性的，而不是对本发明的限制。
实施例实验步骤植物材料和生长条件如VIGNARD 等人(PLoS Genet，3，1894-906，2007)中所述，培养拟南芥 (Arabidopsis)植物。对于萌发测定和细胞计数实验，将拟南芥(Arabidopsis)在拟南芥培养基(ESTELLE & SOMERVILLE，Mol. Gen. Genet.，206，200-06，1987)上，在 21 °C，以 16h 光 /8h暗的光周期和70%的湿度进行体外培养。遗传分析使用两个引物对，通过PCR(30个循环的94°C 30s、56°C 30s和72°C lmin)对植物进行基因分型。对于每个基因型，表I中示出了引物对，并且在表II中示出了对插入片段特异性的引物对。表 I表I
权利要求
1.用于获得产生第二次分裂再组2η配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下文称作OSDl蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO :1的AtOSDl蛋白或与SEQ ID NO 35的OsOSDl蛋白有至少20%的序列同一性或至少四％的序列相似性。
2.根据权利要求1的方法，其中OSDl蛋白的抑制是通过诱变OSDl基因或其启动子而获得的，并且选择部分地或者完全地丧失了 OSDl蛋白活性的突变体。
3.根据权利要求1的方法，其中OSDl蛋白的抑制是通过在所述植物中表达靶向编码所述蛋白质之基因的沉默RNA而获得的。
4.用于获得产生未减数配子之植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中抑制下列蛋白质a)如权利要求1中所定义的OSDl蛋白；b)参与植物中减数分裂重组起始的蛋白质，所述蛋白质选自i)下文中称作SP011-1蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO 2的SP011-1蛋白有至少40%的序列同一性，或至少60%的序列相似性； )下文中称作SP011-2蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQ ID NO :3的SP011-2蛋白有至少40%的序列同一性，或至少60%的序列相似性；iii)下文中称作PRDl蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQID NO :4的PRDl蛋白有至少25%的序列同一性，或至少35%的序列相似性；iv)下文中称作PAIRl蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQID NO :5的PAIRl蛋白有至少30%的序列同一性，或至少40%的序列相似性；c)下文中称作RecS蛋白的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQID NO 6的RecS蛋白有至少40%的序列同一性，或至少45%的序列相似性。
5.根据权利要求4的方法，其中OSDl、SPOl1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl或Rec8蛋白中至少之一的抑制是通过诱变编码所述蛋白质之基因或其启动子而获得的，并且选择部分地或者完全地丧失了所述蛋白质活性的突变体。
6.根据权利要求4的方法，其中OSDl、SPOl1-1、SPOl 1-2、PRDl、PAIRl或Rec8蛋白中至少之一的抑制是通过在所述植物中表达靶向编码所述蛋白质之基因的沉默RNA而获得的。
7.表达盒，其包含-在植物细胞中有功能的启动子；-至少一个选自下列的DNA构建体a)200至IOOObp的一个或更多个DNA构建体，每个所述构建体包含选自0SD1、 SPOl 1-1、SP011-2、PRDl、PAIRl和REC8之靶基因的cDNA的片段，或其互补片段，或者与所述片段有至少95%的同一性的片段，所述DNA序列处于所述启动子的转录控制之下；b)一个或更多个发夹DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自0SD1、SPOll-U SP011-2、PRDl、PAIRl 和 REC8 之基因的发夹 RNA ；c)一个或更多个DNA构建体，其在转录时能够形成靶向选自0SD1、SPOl 1-1、SPOl 1-2、 PRDl、PAIRl 和 REC8 之基因的 amiRNA ；所述DNA构建体处于所述启动子的转录控制之下。
8.根据权利要求7的表达盒，其包含靶向OSDl基因的DNA构建体。
9.根据权利要求7的表达盒，其包含靶向OSDl基因的DNA构建体，靶向选自SPOl1-1、 SP011-2、PRDl和PAIRl之基因的DNA构建体以及靶向REC8的DNA构建体。
10.重组载体，其包含根据权利要求7至9中任一项的表达盒。
11.产生第二次分裂再组2η配子的植物，其为含有转基因的转基因植物，所述转基因包含根据权利要求8的表达盒。
12.产生未减数配子的植物，其可通过权利要求4至6中任一项的方法获得。
13.根据权利要求12的植物，其为含有转基因的转基因植物，所述转基因包含根据权利要求9的表达盒。
14.产生第二次分裂再组2η配子的方法，其中所述方法包括培养可通过根据权利要求 1至3中任一项的方法获得的植物，以及回收由所述植物产生的配子。
15.产生未减数配子的方法，其中所述方法包括培养可通过根据权利要求4至6中任一项的方法获得的植物，以及回收由所述植物产生的配子。
全文摘要
本发明涉及其中蛋白质OSD1失活的植物，所述蛋白质OSD1参与减数分裂I向减数分裂II的过渡。这些植物产生了第二次分裂再组(SDR)2n配子。本发明还涉及其中OSD1的失活与下述基因失活相组合的植物，所述基因即参与植物中减数分裂重组的基因以及参与减数分裂期间着丝粒单极定向的基因。这些植物产生了未减数配子。这些植物可用于植物育种。
文档编号C12N15/82GK102308000SQ201080007059
公开日2012年1月4日 申请日期2010年1月6日 优先权日2009年1月7日
发明者伊莎贝尔·德弗思, 劳伦斯·克罗默, 妮科尔·弗罗热, 拉裴尔·梅西耶, 西尔维·霍利韦特 申请人:国家农艺研究院