粟酒裂殖酵母的转化方法、转化体以及异源蛋白质的制造方法

专利名称：粟酒裂殖酵母的转化方法、转化体以及异源蛋白质的制造方法
技术领域：
本发明涉及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的转化方法、转化体以及异源蛋白质的制造方法。
背景技术：
利用转化体制备异源蛋白质的技术在各个产业被广泛应用，所述转化体是利用基因重组技术导入了编码宿主本身无法生产的异源蛋白质的外源基因(异源蛋白质结构基因)的转化体。在这样的异源蛋白质的制造中，尤其是制造来源于真核生物的蛋白质的情况下，认为作为宿主利用属于真核生物的微生物的方法较为理想。尤其是，从酵母中不含有对人体带来不良影响的物质，且其为单细胞而容易操作等方面考虑，开发了很多将酵母用作宿主的表达系统。其中，已知与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等出芽酵母相比，属于裂殖酵母的khizosaccharomyces pombe (下称粟酒裂殖酵母)的细胞周期和染色体结构、RNA 剪接等与动物细胞更为相似，所生成的蛋白质的翻译后修饰也与动物细胞接近，因而可进行更为复杂的翻译后修饰。将粟酒裂殖酵母用作宿主的异源蛋白质的制造中，以往在粟酒裂殖酵母中导入表达载体(该载体具有异源蛋白质结构基因、启动子以及终止子)，使该表达载体以染色体外基因组(质粒)的方式存在。但是，这种情况下，在粟酒裂殖酵母的培养中这些表达载体有可能从细胞脱离而消失，因此，需要利用营养需求性互补或耐药性积极维护质粒。为此，作为更为稳定地生产异源蛋白质的方法，公开了利用通过同源重组将表达载体整合到粟酒裂殖酵母的染色体的转化体的方法。专利文献专利文献1 日本专利特开2000-262^4号公报发明概要专利文献1中记载的转化体中，传代超过50代后整合到染色体的表达载体仍以未脱离的状态存在。但是，在工业上制造异源蛋白质时，要求更长时间的连续培养中的异源蛋白质的稳定生成，因此，希望进一步提高转化体在传代中的维持稳定性。因此，本发明的目的在于能够获得在传代中的维持稳定性更佳，且可稳定地制备目标异源蛋白质的转化体的粟酒裂殖酵母的转化方法、其转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法为目的。以下表示本发明的粟酒裂殖酵母的转化方法、转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法。〔1〕粟酒裂殖酵母的转化方法，它是利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizoasccharomyces pombe)的染色体中的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组，其特征在于，所述重组位点的碱基序列为将实质上具有同一碱基序列的位点作为靶位点且能够与该靶位点进行同源重组的序列，该位点分别存在于所述粟酒裂殖酵母的多个染色体中的各个不同的染色体和/或以其间夹有一个以上的必需基因的方式存在于同一染色体的多个位置。〔 2〕前述〔1〕所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，在粟酒裂殖酵母的染色体中存在 5个以上的所述靶位点。〔3〕前述〔1〕或〔2〕所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，所述靶位点为转座子基因 Tf2中的碱基序列。。〔4〕粟酒裂殖酵母的转化方法，它是利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的染色体的靶位点的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组，其特征在于，所述粟酒裂殖酵母染色体的靶位点为转座子基因Tf2中的碱基序列。〔5〕前述1 4中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，选择在2个以上的所述靶位点上整合有所述表达盒的转化体。〔6〕前述1 5中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，所述载体包含2个以上的表达盒。〔7〕前述1 6中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法中，进行同源重组后，选择整合于所述染色体的表达盒的总数为3 40个的转化体。〔8〕前述1 7中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，所述表达盒中的异源蛋白质结构基因的5’末端侧具有在粟酒裂殖酵母内起作用的分泌信号基因。〔9〕由前述1 8中任一项所述的转化方法获得的转化体。〔10〕培养前述9所述的转化体，获取由该转化体产生的异源蛋白质的异源蛋白质的制造方法。(11)在培养液中培养通过前述8所述的转化方法获得的转化体，从所述培养液中获取由该转化体产生的异源蛋白质的异源蛋白质的制造方法。采用本发明的粟酒裂殖酵母的转化方法，能够获得传代中的维持稳定性更佳，且可以稳定地制造目标异源蛋白质的转化体。另外，本发明的转化体的传代的维持稳定性更佳，能够更加稳定地制造目标异源蛋白质。另外，本发明的异源蛋白质的制造方法利用传代的维持稳定性更好的转化体，因此能够更加稳定地制造目标异源蛋白质。附图简要说明

图1是表示Tf2基因的染色体上的分布的示意图。图2是Tf 2整合型载体的结构图。图3是表示整合的拷贝数及其位置的电泳观察图。图4是表示传代50代后的稳定性的对照图。实施本发明的方式
(宿主)本发明的转化体是，通过将粟酒裂殖酵母用作宿主，在该宿主的染色体上整合包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因(编码异源蛋白质的基因)以及终止子的表达盒而获得。本发明所使用的粟酒裂殖酵母可以为野生型，根据用途也可以为使特定基因缺失或失活的突变型。作为使特定基因缺失或失活的方法，可采用公知的方法。具体而言，可通过采用拉图尔法(Nucreic Acids Res (2006) 34 :ell和国际公开第2007/063919号文本等中记载)来使基因缺失。也可通过采用诱变剂的突变分离法(酵母分子遗传学实验法，1996年，学会出版中心)、采用PCR(聚合酶链式反应)的随机突变法 (PCR方法及应用(PCR Methods Appl.)，1992年，第2卷，p. 28-33.)等向基因的一部分中引入突变，藉此使该基因失活。作为使特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母宿主，例如记载在国际公开第2002/101038号文本，国际公开第2007/015470号文本等。并且，较好是使用作为宿主而使用的粟酒裂殖酵母中具有用于选择转化体的标记物的宿主。例如，较好是使用基于某个基因的缺失而在生长中以特定的营养成分为必要成分的宿主。通过在载体上整合所述缺失的基因(营养需求性互补标记物)，使转化体不具有宿主的营养需求性。通过该宿主和转化体的营养需求性的不同，区别两者而可获得转化体。例如，将使乳清苷酸脱羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而形成的尿嘧啶需求性粟酒裂殖酵母作为宿主，利用包含ura4基因(营养需求性标记物)的载体进行转化后，选择尿嘧啶需求性消失了的宿主，藉此获得整合有载体的转化体。宿主中缺失而形成营养需求性的基因只要是能够使用于转化体的选择的基因则不受限于ura4基因，可以为异丙基苹果酸脱氢酶基因(Ieul基因)等。〔载体〕本发明的载体具有包含异源蛋白质结构基因、在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子和终止子的表达盒，以及与粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组的重组位点。表达盒是指用于表达异源蛋白质结构基因编码的异源蛋白质所需的DNA的组合，包含异源蛋白质结构基因、在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子以及终止子。表达盒还可以包含5’ -非翻译区、3’ -非翻译区中的任一种以上。优选的表达盒为同时含有异源蛋白质结构基因、启动子、终止子、5’ -非翻译区、3’ -非翻译区的表达盒。 另外，还可以含有所述营养需求性互补标记物、导入到异源蛋白质结构基因的5’末端侧的在粟酒裂殖酵母内起作用的分泌信号基因等基因。异源蛋白质结构基因是指编码异源蛋白质的基因。本发明中，“异源蛋白质”是指粟酒裂殖酵母本身不生产(野生型的粟酒裂殖酵母不具有编码该蛋白质的基因)的蛋白质。对异源蛋白质无特别限制，但从工业价值高的角度考虑，优选人或其它哺乳动物所产生的医药品原料蛋白质，微生物所产生的工业用酶蛋白质，植物所产生的食品原料蛋白质。启动子和终止子只要是能在作为宿主的粟酒裂殖酵母中起作用而表达异源蛋白质的启动子和终止子即可。作为在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子，可以使用粟酒裂殖酵母本身具有的启动子(优选转录起始活性高的启动子)或粟酒裂殖酵母本身不具有的启动子(来自于病毒的启动子等)。另外，在载体内可以存在两种以上的启动子。作为粟酒裂殖酵母本身具有的启动子，可例举例如乙醇脱氢酶基因的启动子、参与硫胺素代谢的nmtl基因的启动子、参与葡萄糖代谢的果糖-1，6-二磷酸酶基因的启动子、参与分解代谢物阻抑的转化酶基因的启动子(参考国际公开第99/23223号文本)、热休克蛋白质基因的启动子(参考国际公开第2007/26617号文本)等。作为粟酒裂殖酵母本身不具有的启动子，可例举例如日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报及日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于动物细胞病毒的启动子，优选CMV启动子、SV40启动子。作为在粟酒裂殖酵母内起作用的终止子，可使用粟酒裂殖酵母本身具有的终止子或粟酒裂殖酵母本身不具有的终止子。另外，在载体内可以存在两种以上的终止子。作为终止子，可例举例如记载在日本专利特开平5-15380号公报，日本专利特开平7-163373号公报、特开平10-234375号公报的来源于人的终止子，优选人脂皮质蛋白I 的终止子。本发明的载体优选含有选择标记物的载体。例如，优选使用根据宿主的营养需求性整合有所述营养需求性互补标记物的载体。在粟酒裂殖酵母内起作用的分泌信号基因是具有使表达的异源蛋白质分泌至宿主细胞外的功能的基因。由结合了分泌信号基因的异源蛋白质结构基因表达N末端侧结合有分泌信号的异源蛋白质，该蛋白质在宿主内的内质网和高尔基体等处其分泌信号被去除，之后分泌信号被去除了的异源蛋白质被分泌至细胞外。分泌信号基因(以及分泌信号) 必须要在粟酒裂殖酵母内起作用。作为在粟酒裂殖酵母内起作用的分泌信号基因，可以使用例如记载在国际公开第1996/23890号文本的基因。本发明的载体是具有环状DNA结构或线状DNA结构的载体，导入至粟酒裂殖酵母细胞内时，较好是以线状DNA结构导入。即，采用像通常使用的质粒DNA那样具有环状DNA 结构的载体时，较好是用限制酶将载体切开为线状之后，导入到粟酒裂殖酵母的细胞内。这样的情况下，切开具有环状DNA结构的载体的位置在重组位点内。由此，切开的载体的两端分别存在有重组位点的一部分，通过同源重组整个载体整合到染色体的靶位点。只要能够使载体具有两端分别存在有重组位点的一部分的线状DNA结构，除了切开具有环状DNA结构的载体的方法以外，例如还可以通过基于PCR法的酶扩增法或化学合成法来构建。为了构建本发明的载体，例如可以优选使用pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、 pUC18、pUC19等来源于大肠杆菌的质粒。利用来源于大肠杆菌的质粒构建的载体，通常，具有在大肠杆菌内复制时所需的称为“ori”的复制起始区域。另外，为了构建且扩增本发明的载体而使用大肠杆菌时，即使不使用如上所述的来源于大肠杆菌的质粒，也要利用上述 “ori”，获得具有“ori”的载体。此时，作为用于同源重组时的载体，优选去除了在大肠杆菌内复制所需的称为 “ori”的复制起始区域的载体。因此，将上述载体整合到染色体中时，可以提高其整合效率 (参考日本专利特开2000-262284号公报)。对去除了复制起始区域的载体的构建方法没有特别限制，优选采用日本专利特开 2000-262284号公报记载的方法。即，优选预先构建在重组位点内的切开部位上插入了复制起始区域的前体载体，在形成所述的线状DNA结构的同时使复制起始区域被切除的方法。 由此，能够简单地获得去除了复制起始区域的载体。另外，也可以是如下方法。即，采用记载在日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、国际公开第96/23890号文本，日本专利特开平10-234375号公报等的表达载体及其构建方法，建构具有表达盒以及重组位点的前体载体，进一步利用常规的基因工程手段从该前体载体中去除复制起始区域而获得用于同源重组的载体的方法。载体中的表达盒的数量可以是1个，也可以是2个以上。即使载体中的表达盒的数量为1个，也可以在粟酒裂殖酵母的染色体的同一处整合2个以上的表达盒。另外，如果载体中的表达盒的数量为2个以上，则可以在粟酒裂殖酵母的染色体的同一处连续整合多个表达盒。本发明的载体较好是具有1 8个表达盒，更好是具有2 4个。如果载体所具有的表达盒数为2个以上，则容易增加整合到粟酒裂殖酵母的染色体中的表达盒的数量，且进一步增加异源蛋白质的表达量。但是，在本发明中，后述的靶位点的数量多时，即使只有1个也可以增加整合的表达盒的数量。另外，如果载体所具有的表达盒的数量为8个以下，则容易抑制因载体变得过大而基于同源重组的载体的重组效率降低的问题。如果表达盒的数量为4个以下，则可以进一步提高重组效率。载体重组位点是具有能够与粟酒裂殖酵母的染色体中的同源重组的靶位点进行同源重组的碱基序列的部位。另外，靶位点是在粟酒裂殖酵母的染色体上整合表达盒的目标位点。靶位点可通过将载体的重组位点的碱基序列设为与该靶位点进行同源重组的碱基序列来自由设定。为了进行同源重组，需要使所述重组位点的碱基序列和靶位点的碱基序列的同源性为70%以上。另外，从容易发生同源重组的方面考虑，重组位点的碱基序列和靶位点的碱基序列的同源性较好是90%以上，更好是95%以上。通过使用具有这样的重组位点的载体，通过同源重组将表达盒整合到靶位点。重组位点的长度(碱基数)较好是20_2000bp。如果重组位点的长度在20bp以上，则容易发生同源重组。另外，如果重组位点的长度在2000bp以下，则容易防止载体变得过长而难以发生同源重组的问题。重组位点的长度较好是在IOObp以上，更好是在200pb 以上。另外，重组位点的长度较好是在SOObp以下，更好是在400pb以下。〔宿主的靶位点〕整合表达盒的靶位点是，粟酒裂殖酵母所具有的3条染色体中，(1)分别存在于多个染色体中的2个以上靶位点，或(2)以其间夹有一个以上的必需基因的方式存在于同一染色体的多个位置的2个以上的靶位点，或同时满足⑴以及⑵的多个靶位点。这些2个以上的靶位点是，实际上具有同一的碱基序列的部位。其中，实际上同一的碱基序列是指各靶位点的碱基序列彼此的同源性在90 %以上的序列。靶位点之间的同源性较好是在95 % 以上，更好是在99%以上。上述必需基因是指缺失或失活该基因时无法生长的基因，S卩，指对于本发明的转化体的生长不可缺少的基因。因此，对于以夹有该基因的方式导入的表达盒，如果该表达盒脱离，则必需基因也脱离而转化体无法生长。为此，在转化体的培养中，表达盒脱离了的转化体与表达盒未脱离的转化体共同生长的可能性减少，且异源蛋白质的生产效率降低的可能性减少(基于通常表达盒脱离了的转化体的繁殖速度快这一原因)。如此，通过靶位点分散地存在于粟酒裂殖酵母的染色体中，表达盒分散地整合到染色体，因此整合了的表达盒的脱离变得困难，传代的维持稳定性变得极高。因此，能够稳定地以高生产性制造异源蛋白质。另外，如上所述，通过使碱基序列为实质上同一的靶位点，从而即使不同的位置上存在多个靶位点，也能够利用一种载体简单地将载体整合到这些靶位点。本发明的转化方法中，供整合载体的靶位点优选为5个以上。如果靶位点为5个以上，则容易增加整合到染色体的表达盒的数量，因此进一步提高异源蛋白质的生产性。另外，靶位点较好是10-60个。如果靶位点为10个以上，则更为容易增加整合到染色体的表达盒的数量，进一步提高异源蛋白质的生产性。如果靶位点为60个以下，则容易抑制因整合到染色体的表达盒变得过多而异源蛋白质的表达量减少的问题。从利用一种载体一次性地将表达盒整合到分散地存在于粟酒裂殖酵母的染色体中的靶位点的方面考虑，作为靶位点优选转座子基因Tf2 (3个染色体上分别存在共13个位点，长度(碱基数)约为4900bp的转座子基因，相互之间的碱基序列的同源性在99.7%。 参考下述文献)中的碱基序列。(文献名)弥敦道鲍恩等人研究，“反转录转座子及其对RNA聚合酶II启动子的识别对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)全基因组序列中的转座元件的综合研究”，基因组研究，2003 年 13 1984-1997但是，靶位点不受限于上述位点。例如，除了转座子基因Tf2之外，可以将染色体中的多个包含具有前述重组位点的长度以上的长度且实质上相同的碱基序列的位点(基因等)作为靶位点。另外，也可以例如在染色体中新导入多个包含具有所述重组位点的长度以上的长度且实质上相同的碱基序列的基因(靶位点)而形成靶位点之后，将载体导入到这些多个靶位点。〔转化体，转化方法〕本发明的粟酒裂殖酵母的转化方法是，利用前述载体，通过同源重组将表达盒整合到作为宿主的粟酒裂殖酵母的染色体的前述靶位点的方法。通过同源重组，将载体整合到染色体的方法本身可以采用公知或周知的方法(例如，参考日本专利特开2000-262^4 号公报)。另外，本发明的转化体是通过该转化方法获得的转化体。所述载体可以整合到存在于粟酒裂殖酵母的染色体中的多处靶位点的1处，也可以是整合到2处以上。在本发明中，优选选择载体整合到2处以上的转化体。另外，载体可以整合到存在于染色体中的多处的所有靶位点，也可以仅整合到一部分的靶位点。如果整合到染色体的表达盒变得过多，则有可能异源蛋白质的表达量减少， 因此整合了载体靶位点数较好是在20个以下。因此，存在于染色体中的靶位点数在20以下时，可以在其所有的靶位点整合载体，如果存在于染色体中的靶位点数超过20个，则整合了载体的靶位点数优选20个以下。更优选的整合了载体的靶位点的数量为2-15个(其中，靶位点数不足15个时相当于其靶位点的数量)，进一步优选为3-10个(其中，靶位点数不足10个时相当于其靶位点的数量)。靶位点为前述转座子基因Tf2时(靶位点数为 13)，整合了载体的Tf2的数量较好是2-13个，更好是2-8个。如前所述，所述载体可以具有2个以上的表达盒。因此，整合到染色体的表达盒的总数为载体中的表达盒数和整合了载体的靶位点的数量的乘积。基于本发明获得的转化体中，其染色体中的表达盒的总数较好是2-40个，更好是2-20个。如果整合到染色体的表达盒变得过多，则有可能异源蛋白质的表达量减少，因此整合到染色体的表达盒的总数较好是在40个以下，更好是在20个以下。在本发明的转化方法中，通常，在进行同源重组之后，选择获得的转化体。作为选择方法，可例举例如以下所示的方法。通过可利用所述营养需求性标记物选择转化体的培养基进行筛选，从所得的克隆中选择出多个克隆。接着，将这些克隆分别进行液体培养后， 考察各培养液中的异源蛋白质的表达量，选择出异源蛋白质的表达量较多的转化体。此外， 通过对这些选择出的转化体进行基于脉冲场凝胶电泳法的基因组分析，可考察出整合到染色体中的载体数或表达盒数。可以通过调节整合条件等在一定程度上可调节整合到染色体的载体的数量，但是，认为也可以通过载体的大小(碱基数)或结构来改变整合效率或整合数。本发明的目的在于获得异源蛋白质的表达效率高的转化体，其目的并不在于仅仅获得表达盒的总数更多的转化体。通常，预测表达盒的数量越多表达效率越高，但是，认为如果表达盒的数量过多，则增加对于细胞的生存或繁殖的负荷，进而异源蛋白质的表达效率降低。另外，认为如果载体过大，则降低整合到染色体的概率，难以提高整合的载体数，进而获得转化体的本身变得困难。认为载体的大小不仅受到表达盒的数量的影响，还受到异源蛋白质结构基因的长度(碱基数)的影响。因此，认为与异源蛋白质结构基因短的情况相比，在异源蛋白质结构基因长的情况下，整合的表达盒的数量受到限制。另外，认为异源蛋白质结构基因不仅基于其长度，而且还基于其序列的结构等基因的种类而变化。另外，本发明的转化体是通过本发明的转化方法获得的转化体。该转化体具有2 个以上的表达盒，与具有1个相同的表达盒的转化体相比其表达效率更高。认为获得异源蛋白质表达效率高的转化体的最佳的表达盒的总数，如前所述根据异源蛋白质结构基因的长度或种类等要素而不同。但是，只要通过同源重组法生成一定的比例以上的转化体，就可以通过选择获得转化体，并且通过测定获得的转化体的异源蛋白质的表达效率，可以从获得的转化体中选择异源蛋白质的表达效率高的株。进行上述选择的同时，可以测定转化体中的表达盒的数量，且建立表达效率和表达盒的数量之间的关系。如果以某一种异源蛋白质结构基因作为对象，则通常在一定程度上表达盒的数量越多表达效率越高。但是，认为有可能在不同的异源蛋白质结构基因之间，表达盒的数量和表达效率之间的关系不一定具有同样的关系。本发明者的之前的发明(日本专利特开2000-262^4号公报记载的发明)中，提供了染色体的1处具有2个以上表达盒的转化体。但是，与多个表达盒仅存在于染色体的 1处的情况相比，本发明的转化体中表达盒分散地整合到染色体，因此传代的维持稳定性变得极高。这可能是因为，例如与表达盒集中存在于1处的情况相比，繁殖以及表达的负荷被分散，另外，即使1处的表达盒脱离也能够保留其它部分的表达盒。并且，虽然可以对2种以上的靶位点的每个靶位点，使用不同的载体(重组位点的碱基序列不同的载体)导入表达盒，且获得多处具有表达盒的转化体，但是本发明中对多个靶位点利用相同的载体同时导入表达盒，因此转化体的制造变得非常容易。〔异源蛋白质的制造方法〕本发明的异源蛋白质的制造方法是培养本发明的转化体，获取由该转化体产生的异源蛋白质的方法。作为培养液，可使用公知的酵母培养用培养基，只要是含有粟酒裂殖酵母可利用的碳源、氮源、无机盐类等而能高效地进行粟酒裂殖酵母的培养的培养基即可。作为培养液，既可以使用天然培养基，也可以使用合成培养基。作为碳源，可例举例如葡萄糖、果糖、蔗糖等糖。作为氮源，可例举例如，氨、氯化铵、乙酸铵等无机酸或无机酸的铵盐、胨、酪蛋白
氨基酸等。作为无机盐类，可例举例如，磷酸镁、硫酸镁、氯化钠。作为培养可以采用公知的酵母培养方法，例如可以通过振荡培养、搅拌培养等进行。另外，培养温度较好是23-37°C。培养时间可适当决定。培养既可以是分批培养，也可以是连续培养。异源蛋白质的获取可以采用公知的蛋白质的获取方法。例如，培养后将菌体从培养液分离、且破坏分离了的菌体而获得含有目标异源蛋白质的成分，通过采用公知的蛋白质提纯方法从该成分获取目标异源蛋白质。另外，由利用具有结合了分泌信号基因的异源蛋白质结构基因的表达载体而获得的转化体中，异源蛋白质被分泌至培养液中。因此，此时可以通过公知的蛋白质提纯方法，从培养液中获得目标异源蛋白质。使用将异源蛋白质分泌至培养液中的转化体，且采用以连续培养来培养转化体的方法，可有效地获取异源蛋白质。可例举例如下述方法从培养了一定时间的培养液中获取异源蛋白质并同时回收培养上清，向该培养上清中再次添加培养液进行培养，反复进行上述操作来连续地进行培养。
实施例下面示出实施例和比较例，对本发明进行详细说明。但是，本发明并不受到下述记载的限定。〔实施例1〕可通过一次转化整合表达盒的基因座的确定通过染色体的测序，明确了在裂殖酵母的染色体中存在多个被认为可适用于一次性地将表达盒同时整合到多处，且高度保存的序列的重复(wood等，自然415卷871-880 页，2002年)。因此，利用桑格研究所(the Sanger Institute)的数据库GeneDB (http // www. genedb. org/genedb/)，进行了通过一次转化即可彻底整合表达盒的基因座的确定。首先，确认在着丝粒或复制起始点可见大量的富含AT(AT-rich)的序列的重复。 但是，这些序列在一级序列上的同源性并不高，不适合外源基因的导入。接着，可知还存在很多被认为是来源于LTR或Tf2转座子的序列。对于前者，已知存在 174 个(Bowen 等，基因组研究(Genome Research)刊物，13 卷，1984-1997 页，2003 年)，但其同源性仍然并不高。但是，Tf2的13个序列以99%以上的同源性分散在整个染色体。其结构示于图1。如此，除了 Tf2-7和Tf2-8相互邻接之外均分散在染色体上，其之间必然存在生长所需的必需基因。因此，判断能够将这些序列作为基因整合的部位来利用。并且，推断在染色体末端区域重复具有4个相同的基因(Mandell等，基因组生物学(Genome Biology)刊物，6卷，Rl页，2004年)。但是，在亚端粒区域中基因的转录被抑制，因此不适合作为外源基因的表达场所。端粒本身也由重复的序列构成，但是预料其长度根据细胞周期而变化等现象，因此不适于异源蛋白质的生产。〔实施例2〕Tf2整合型载体的制备通过以下方法制备可将绿色荧光蛋白(GFP)的表达盒整合到Tf2基因座上的载体 pTf2-ura4-EGFP (R)(图 2)。即，利用从细胞提取全基因组DNA的试剂盒(凯杰公司Oliagen)制DNeasy)，纯化粟酒裂殖酵母的全基因组DNA，以其中的1 μ g作为模板，利用5’末端侧导入了限制酶BsiWI 的识别序列(CGTACG)的引物对 5，-AAGGCCTCGTACGTGAAAGCAAGAGCAAAACGA-3，以及 5，-AAG GCCTCGTACGTGCTTTGTCCGCTTGTAGC-3，，通过 PCR 法扩增粟酒裂殖酵母的 Tf 2-2 (GeneDB 收录的系统名SPAC167. 08基因)的DNA片段(约3950个碱基对)。将扩增的DNA片段的两末端用限制酶BsiWI处理，通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯，制备成插入片段。接着，对染色体整合用载体pXL4 (Idiris等，酵母刊物23卷83_99页，2006年)， 也使用相同的限制酶BsiWI进行酶切，获得含有氨苄青霉素抗性基因(ApR)以及大肠杆菌的复制起始点(PBR322-ori)的区域(约2130个碱基对)。对该DNA片段，进一步利用脱磷酸酶(宝生物株式会社制的CIAP)进行脱磷酸化处理，通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯，制备载体的片段。利用连接试剂盒(宝生物株式会社制DNA连接试剂盒ver. 2)，连接上述插入片段和载体片段之后，转化大肠杆菌DH5 (东洋纺株式会社制)，制备重组质粒pTf2-2 (6071个碱基对)。将0. 1 μ g的上述构建的载体pTf2-2作为模板，利用引物对5’-GGGGTACCAAGCTTC TAGAGTCGACTCCGGTGCTACGACACTTT-3，(5，末端具有限制酶 KpnI、HindIII、XbaI、Sail 的识别序列)以及 5，-GGGGTACCAGGCCTCTCGAGGCTAGCCATTTCCAGCGTACATCCT-3’(5，末端具有限制酶KpnI、StuI、XhoI.Nhel的识别序列)，通过PCR法扩增全长，获得6060个碱基对的片段。用KpnI酶切其两末端，且通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯后，利用连接试剂盒自我环化， 制备转座子基因Tf2-2序列的内部进一步包含多克隆位点(MCQ的6058个碱基对的载体 pTf2(MCS)。利用限制酶KpnI以及NheI双酶切上述构建载体pTf2(MCS)，通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯6040个碱基对的片段。并且，在粟酒裂殖酵母的尿嘧啶需求性标记物 ura4 (GeneDB收录的系统名SPCC330. 05c，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因)的两端，通过 PCR法制备附加有限制酶KpnI和NheI的识别序列的片段，利用限制酶KpnI以及NheI双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯2206个碱基对的片段。用连接试剂盒连接这两个片段， 制备转座子基因Tf2-2序列的内部进一步包含多克隆位点(MCQ的8246个碱基对的载体 pTf2(MCS)-ura40用限制酶&111酶切上述构建载体？1€2(1 ^)-111^4，且用补平试剂盒(宝生物株式会社制，DNA Blunting kit)将获得的8246个碱基对的片段的两末端平端化，通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯之后经过脱磷酸化制得载体片段。并且，利用限制酶SpeI和Bstll07I双酶切pTL2EGFPl，切出1720个碱基对的GFP表达盒，利用补平试剂盒将其两末端平端化后， 通过琼脂糖凝胶电泳分离提纯而制得插入片段。利用连接试剂盒，连接上述载体以及插入片段，制得Tf2整合型载体PTf2-ura4-EGFP (R)(图2)。
〔实施例3〕转化体的获取利用限制酶BsiWI酶切3 μ g的在实施例2中制得的Tf2整合型载体 PTf2-ura4-EGFP(R)，通过R崎等的方法(R崎等，核酸研究刊物，18卷，6485-6489页，1990 年)，转化裂殖酵母ARCO10株(基因型h-leul-32 ura4_D18)。将转化物涂布于添加亮氨酸的基本培养基(MMA+leu)的表面，在32°C下培养4天。从长出来的约500个尿嘧啶需求性恢复菌落中，通过利用荧光观察装置(GFP Viever TR-100，池田理化株式会社制)的肉眼观察，筛选了 96个显示绿色荧光蛋白(GFP)的荧光的菌落。刮取各个菌落，接种至Iml的不含亮氨酸的合成培养基SDC-Leu (SD Medium-LEU, 凯毕欧杰(Qbiogene)株式会社制)，在M孔培养板中振荡培养约M小时。分别获取0. Iml 的菌体增殖液，接种至Iml的YES液体培养基(5g/l的酵母提取物(BD株式会社(Becton， Dickinson and Company)制)，30g/l的葡萄糖(和光纯药株式会社制)、250g/l的SP Supplements (凯毕欧杰(Qbiogene)株式会社制))，在M孔培养板中再次振荡培养约M 小时。之后，利用荧光强度测定装置(Spectra Max Gemini XS，日本分子仪器株式会社 (molecular device)制)，测定每Iml的菌体培养夜的荧光强度，筛选GFP显示的荧光强度最高的克隆。〔实施例4〕染色体上的整合位置以及拷贝数的分析从实施例3制得的转化体中提取总DNA成分。将该DNA为模板，将载体侧的通用引物5’ -GGTGATGACGGTGAAAACCT-3’分别与表1所示的13个各Tf2基因特异性引物对结合，用KOD Plus (东洋纺株式会社制)进行PCR，对染色体上的表达载体的整合位置以及拷贝数进行分析。其结果，如图3所示，确认到Tf2_l、2、6、7、8的5处整合有共计5个表达盒。表 权利要求
1.粟酒裂殖酵母的转化方法，它是利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的染色体中的转化方法， 所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组，其特征在于，所述重组位点的碱基序列为将实质上具有同一碱基序列的位点作为靶位点且能够与该靶位点进行同源重组的序列，该位点分别存在于所述粟酒裂殖酵母的多个染色体中的各个不同的染色体和 /或以其间夹有一个以上的必需基因的方式存在于同一染色体的多个位置。
2.如权利要求1所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，在粟酒裂殖酵母的染色体中存在5个以上的所述靶位点。
3.如权利要求1或2所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，所述靶位点为转座子基因Tf2中的碱基序列。
4.粟酒裂殖酵母的转化方法，它是利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的染色体的靶位点的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组，其特征在于，所述粟酒裂殖酵母染色体的靶位点为转座子基因Tf2中的碱基序列。
5.如权利要求1 4中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，选择在2 个以上的所述靶位点上整合有所述表达盒的转化体。
6.如权利要求1 5中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，所述载体包含2个以上的表达盒。
7.如权利要求1 6中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，进行同源重组后，选择整合于所述染色体的表达盒的总数为3 40个的转化体。
8.如权利要求1 7中任一项所述的粟酒裂殖酵母的转化方法，其特征在于，所述表达盒中的异源蛋白质结构基因的5’末端侧具有在粟酒裂殖酵母内起作用的分泌信号基因。
9.转化体，其特征在于，由权利要求1 8中任一项所述的转化方法获得。
10.异源蛋白质的制造方法，其特征在于，培养权利要求9所述的转化体，获取由该转化体产生的异源蛋白质。
11.异源蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养液中培养通过权利要求8所述的转化方法获得的转化体，从所述培养液中获取由该转化体产生的异源蛋白质。
全文摘要
本发明提供用于获得传代中的维持稳定性更佳且能够稳定地制备目标异源蛋白质的转化体的粟酒裂殖酵母的转化方法。并且，提供基于该方法获得的转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法。利用具有表达盒和重组位点的载体通过同源重组将所述表达盒整合到粟酒裂殖酵母的染色体的转座子基因Tf2位点的转化方法，所述表达盒包含在所述粟酒裂殖酵母内起作用的启动子、异源蛋白质结构基因以及终止子，所述重组位点与所述粟酒裂殖酵母的染色体进行同源重组。还提供基于该方法获得的转化体以及利用该转化体的异源蛋白质的制造方法。
文档编号C12N1/19GK102292442SQ201080006331
公开日2011年12月21日 申请日期2010年1月26日 优先权日2009年1月27日
发明者东田英毅, 依地热斯·阿里木江, 浜祐子 申请人:旭硝子株式会社