专利名称：人类可溶性cd146、其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于在体内、离体或体外调节血管发生的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及可用于人类治疗情形中的可溶性CD146蛋白以及相应的抗体。本文描述的特定形式的CD146，可用于在体内或离体带动成熟和未成熟内皮细胞两者，以及增加它们对血管发生的影响。它们还可用于制备组合物，特别是药物、诊断或美容组合物以及相应的试剂盒。本发明还涉及使用上面提到的化合物、组合物和细胞的治疗或诊断方法以及美容性处理。
背景技术：
在高等生物体中，在胚胎发育过程中从分化的内皮细胞形成新血管(血管生成) 或在成年期中从现有血管形成新血管(血管发生)，是器官发育、再生和伤口愈合的基本特征。治疗性血管发生是治疗患有导致组织局部缺血的疾病或障碍的患者的有效手段。由于发现了有利于新血管形成的促血管生成因子，使用非手术疗法治疗局部缺血已成为可能。到目前为止已经描述了几种候选促血管生成因子，它们成为临床试验的主题。然而，热情受到一系列负面临床结果的阻碍。例如，对于VEGF来说，尽管该因子具有强的血管生成效应，但其表达不能有效增加患者中的肌肉血流。这由渗漏血管腔隙和动静脉短路的形成干扰了下游微循环来解释。已经在成人外周血、骨髓和脐带血中鉴定到内皮祖细胞(EPC) (Asahara T， Murohara T, Sullivan A, Silver Μ, van der Zee R, Li Τ, Witzenbichler B, Schatteman G，Isner JM.推测的用于血管发生的内皮细胞祖细胞的分离(Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.) Science. 1997 275 :964-7)。在从骨髓带动后，循环系统中的EPC参与新生儿新生血管化。已发现移植从血液或自体骨髓单核细胞获得的培养扩增的EPC，能够在体内增加局部缺血诱导的新生血管化。然而，在患者中使用培养细胞作为治疗方法，受到外周血中EPC的低比例、需要收获大量骨髓以分离足够数量的EPC以及回收到的EPC的非均质性的相当大的限制。尽管其存在缺点，但使用血管生成生长因子至今仍是用于治疗患者、例如表现出严重外周动脉疾病(也称为外周血管病)或局部缺血性心脏病的患者的治疗性血管发生的主要策略。⑶146，也称为MCAM、MUC18或Mel-CAM，是属于免疫球蛋白超家族的内皮连接的组分(Bardin N, Anfosso F, MasseJM, Cramer Ε, Sabatier F, Le Bivic A, Sampol J, Dignat-George F.将⑶146鉴定为参与细胞-细胞内聚控制的内皮连接的组分 (Identification of CD146 as a component of the endothelial junction involved in the control of cell-cell cohesion.)Blood. 2001 ;98 :3677-84)。作为该家族的成员，它由5个Ig结构域、一个跨膜结构域和一个细胞质区组成。已知CD146主要以两种不同形式出现，其差别在于它们的细胞质结构域的长度长同工型(在本文中鉴定为“长⑶146”)和短同工型(在本文中鉴定为“短⑶146”)，二者都存在于细胞、主要是内皮细胞的膜中。⑶146参与细胞和组织体系结构的控制，正如通过在内皮单层形成过程中其表达的调控、其参与细胞旁通透性的控制(Bardin N, Anfosso F, MasseJM, Cramer Ε, Sabatier F，Le Bivic A, Sampol J, Dignat-George F.将CD146鉴定为参与细胞-细胞内聚控制白勺 1 ] 白勺(Identification of CD 146 as a component of the endothelial junction involved in the control of cell-cell cohesion.)Blood. 2001 ；98 :3677-84) 及其与肌动蛋白细胞骨架的共定位(Anfosso F, Bardin N, Vivier E，Sabatier F, Sampol J, Dignat-George F.与人类内皮细胞中⑶146结合相关的由外至内的信号传导途径 (Outside-in signaling pathway linked to CD146 engagement in human endothelial cells.) J Biol Chem. 2001 ；276 :1564-9)所证实的。已报道，膜⑶146在人类黑素瘤中促进肿瘤生长、血管发生和转移。在人类恶性黑素瘤中，膜CD146的表达水平和分布与肿瘤发展和转移的发生密切相关。已描述了抗膜 ⑶146抗体能够在裸鼠中显著抑制人类黑素瘤细胞的生长和转移性质(Mills L,Tellez C， Huang S, Baker C, McCarty Μ, Green L, Gudas JM, Feng X，Bar-Eli Μ.针对 MCAM/MUC18 的全人类抗体抑制人类黑素瘤的肿瘤生长和转移(Fully human antibodies to MCAM/ MUC18 inhibit tumor growth and metastasis of human melanoma.) Cancer Res. 2002 ； 62 =5106-14.)。已经显示，在人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外模型(Kang Y，Wang F,Feng J, Yang D, Yang X，Yan X. CD146的抑制降低了人类内皮细胞的迁移和增殖(Knockdown of CD146 reduces the migration and proliferation of human endothelial cells.)Cell Res. 2006 ；16(3) :313-8)和鸡绒毛尿囊膜(CAM)测定与小鼠肿瘤生长的体内模型(Yan X，Lin Y, Yang D, Shen Y, Yuan Μ, Zhang Ζ, Li P, Xia H, Li L, Luo D, Liu Q, Mann K, Bader BL.新的抗CD146单克隆抗体AA98抑制血管发生和肿瘤生长(A novel anti_CD146 monoclonal antibody, AA98, inhibits angiogenesis and tumor growth)Blood. 2003 ； 102 :184-91)两者中，膜⑶146表现出血管生成性质。Yan等已经显示，mAb AA98表现出与正常组织的血管相比，抗肿瘤内血管系统的明显受限的免疫反应性。最后，本发明人最近显示了⑶146参与单核细胞跨内皮迁移的调控(⑶146及其可溶性形式调控单核细胞跨内皮迁移(CD146 and its soluble form regulate monocytes transendothelial migration)Arteriosclerosis, thrombosis and Vascular Biology, 2009；29 :746-53)。对于鸡⑶146的两种膜同工型来说，在文献中已鉴定到不同的定位和功能差异。 在一项研究中，作者使用⑶146-GFP嵌合体分析鸡⑶146在极化的上皮Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中的定向，以鉴定每种同工型的对应功能。他们通过共聚焦显微术显示， 短CD146和长CD146分别定位于顶端和底外侧膜(Guezguez B, Vigneron P，Alais S， Jaffredo T, Gavard J, Mege RM，Dunon D.在 MDCK 细胞中双亮氨酸基序将 MCAM-1 细胞粘附分子革巴向底外侧膜(A dileucine motif targets MCAM-I cell adhesion molecule to the basolateral membrane in MDCK cells)FEBS Lett. 2006 ；580 :3649-56) 在另一项研究中，同一个研究组显示了长CD146通过在淋巴细胞中微绒毛诱导促进滚动并显示出粘附受体活性，表明它参与活化的T细胞向炎性位点的募集(Guezguez B, Vigneron P，Lamerant N, Kieda C, Jaffredo T, Dunon D.黑素瘤细胞粘附分子(MCAM)/CD146 在淋巴细胞内皮相互作用中的双重功能:MCAM/CD146通过在淋巴细胞中微绒毛诱导促进滚动并且是内皮粘附受体(Dual role of melanoma cell adhesion molecule (MCAM) /CD 146 in lymphocyte endothelium interaction :MCAM/CD146 promotes rolling via microvilli induction in lymphocyte and is an endothelial adhesion receptor)J Immunol. 2007 ； 179 :6673-85)。可溶形式的⑶146的存在最初是从western印迹发现的，并提出了其作为⑶146 膜结合形式的竞争性抑制剂的可能功能(Bardin N, Frances V, Combes V，Sampol J, Dignat-George F.⑶146 可溶形式在人类培养内皮细胞中的生物合成和生产(⑶146 biosynthesis and production of a soluble form in human culturedendothelial cells.)FEBS Lett. 1998 ；421 :12-4)。然而，到目前为止，可溶形式还没有在结构或功能上表征。突破来自于本发明人的发现，即人类CD146的生物活性形式不仅以膜结合形式、 而且以可溶形式存在于人类血清中。本发明人首先提出SCD146水平的变化可能与伴有内皮屏障完整性例如通透性的变化、白细胞移居或血管发生的生理病理状况相关(N. Bardin, F. Anfosso, V. Combes, J. Nedelec, I. Besson—Faure, P. Brunet, V. Moal, J. Sampol, and F. Dignat-George. 一种连接内皮粘附分子可溶性CD146，在血管障碍中增加(Soluble CD146, a junctional endothelial adhesion molecule, is increased in vascular disorders)内皮细胞专题讨论会 K ;DK，vol. 55，no. SUPPL. 01，2000 年 1 月 1 日，第 63 页， ISSN :0340-6245)，然后描述了在患有慢性肾衰的患者血浆中sCD146水平的增加(Bardin N, Moal V, Anfosso F, Daniel L, Brunet P, Sampol J, Dignat-George F.—禾中的内 1 标志物可溶性⑶146，在与内皮连接改变相关的生理病理背景下增加(Soluble⑶146，a novel endothelial marker，is increased in physiopathological settings linked to endothelial junctional alteration)Thromb Haemost· 2003 ;90 :915-20)。本发明人现在在本文中第一次描述了所述可溶形式的结构，并证实了(具体参见本文中提供的体内实验结果)人类可溶性CD146的治疗性质、特别是其血管生成性质，与本技术领域的建议以及特别是mi Guang-JER等以前的观察相矛盾(参见mi Guang-JER 等“可溶性METCAM/MUC 18在人类前列腺癌LNCaP细胞的体内肿瘤形成过程中阻断血管发生，，(Soluble METCAM/MUC 18 blocks angiogenesis during the in vivo tumor formation of human prostate cancer LNCaP cells.)美国癌症研究联合会年会会议录 (Proceedings of the American Association for cancer research annual meetings)， vol. 47，2006 年 4 月，page 59n 以及《AACR 第 97 届年会》(97 annual meeting of the AACR) ；Washington DC, USA, 2006 年 4 月 01-05 日，ISSN :0197_016X)。在文献中，已经显示了不同可溶性受体如可溶性EphB4或可溶性Notchl作为血管发生的内源抑制剂起作用，起到它们的配体的捕集器的作用。对于阻断VEGF的血管生成效应的可溶形式的VEGFR2来说，情况也是如此(Holash J，Davis S，Papadopoulos N，等， VEGF捕集器具有强抗肿瘤效应的VEGF阻断剂(VEGF-Trap :a VEGF blocker with potent antitumor effects.), Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 ;99 :11393-8.)。相反，已经显示其他可溶性分子起到血管发生活化剂的作用，例如可溶性N-钙粘蛋白片段(Derycke L，Morbidelli L, Ziche M等，可溶性N-钙粘蛋白片段促进血管发生(Soluble N-cadherin fragment promotes angiogenesis.) ,Clin Exp Metastasis. 2006 ;23 :187-201)或可溶性 CD40配体(Melter Μ, Reinders ME, Sho M等，CD40的连接诱导内皮细胞和单核细胞的血管内皮生长因子表达并在体内促进血管发生(Ligation of CD40 induces the expression of vascular endothelial growth factor by endothelial cells and monocytes and promotes angiogenesis in vivo.)，Blood. 2000 ;96 :3801-8.)。所观察到的可溶性分子作为抑制剂或激活剂的相反效应的原因未知，但可能是由于不同的信号传导途径。因此，人们可以假设受体分子的可溶形式可能捕集配体并抑制效应。相反，其他可溶性分子例如可溶性CD146由膜蛋白脱落产生，并可能用作活化其受体的配体。具体来说，发明人在本文中提供了新工具，使用可溶形式的CD146改进了组织局部缺血的治疗，同时降低了使用经典使用的疗法时观察到的有害副作用。他们在本文中证明了可溶形式的CD146在新生血管化过程中发挥关键功能。发明人在本文中对人类可溶形式的CD146(在本文中称为“可溶性CD146”)进行了性质研究，鉴定了其可用于治疗情形中的氨基酸序列。具体来说，发明人描述了其对内皮细胞、特别是内皮祖细胞(EPC)的有利的趋化和血管生成效应。人类可溶形式的CD146能够在哺乳动物对象、特别是人类对象中促进治疗性血管生成和/或血管发生。本文描述的产物和组合物的其他优点将在下面进一步指出。发明概述发明人在本文中第一次证明了人类可溶性CD146诱导内皮细胞特别是内皮祖细胞、平滑肌细胞和造血细胞的迁移能力或移动性(趋化活性)和活化，并证明了该分子能够在体内促进血管生成和/或血管发生。该分子可以单独或与另一种促血管生成因子和/或与成熟或未成熟内皮细胞组合给药，是在表现出组织局部缺血或具有发生这种组织局部缺血的风险的患者中用于治疗性血管发生的有利工具。具体来说，本发明提供了新的蛋白，即人类可溶性CD146，其在本文中被称为“可溶性CD146”。该蛋白天然存在于人类血清中，并且其生物活性形式已被本发明人分离并提供在本文中。一方面，本发明描述了分离的人类可溶性CD146蛋白，其含有约558个氨基酸，优选约552至约558个氨基酸，更优选557、556、555、554、553或552个氨基酸。在具体实施方案中，本发明提供了本文所述的可用于哺乳动物治疗、特别是人类治疗情形中的人类可溶性⑶146蛋白，其包含由选自SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的序列构成的氨基酸序列。另一方面，本发明提供了包含本文描述的可溶性⑶146蛋白和可药用载体的组合物。另一方面，该组合物还包含成熟或未成熟的内皮细胞、特别是内皮祖细胞，和/或另一种促血管生成因子。本发明的药物组合物还可以包含已经与人类可溶性⑶146蛋白接触过的、和/或已经进行遗传修饰以表达人类短的或可溶性CD146蛋白的成熟或未成熟内皮细胞作为唯一生物活性剂。另一方面，本发明涉及本文描述的蛋白或组合物，其用于引起组织局部缺血，或以⑶146、特别是可溶性⑶146的受体的活化降低，或以选自编码e-N0S、uPa、MMP-2和KDR 的基因的基因的表达与标准表达相比降低为特征的疾病、障碍或机能障碍状态的治疗或诊断，或用于局部缺血的预防。具体来说，本发明涉及使用本文描述的蛋白或组合物制备组合物，用于本文指出的疾病、障碍或机能障碍状态的诊断、预防或治疗。在具体实施方案中，本发明提供了在哺乳动物、优选为人类中诊断、预防或治疗本文指出的疾病、障碍或机能障碍状态的方法，特别是诊断癌症(例如乳腺癌、黑素瘤等)的方法或预防或治疗组织局部缺血的方法。诊断癌症的方法优选包含对哺乳动物血清中可溶性CD146蛋白的量进行定量的步骤。预防或治疗组织局部缺血的方法优选包含向哺乳动物给药有效量的在本文、特别是包含可溶性CD146蛋白的方法中描述的组合物的步骤。另一方面，本发明涉及使用本文描述的蛋白或组合物改进瘢痕的美观性，或预防性地促进瘢痕形成或创伤、伤口或切口的愈合。本发明的目的是将本文描述的蛋白或组合物用于哺乳动物上皮、特别是人类上皮的瘢痕形成，特别是在创伤、伤口或切口出现后或在皮肤移植的情形中。本发明的另一个目的是将本文描述的蛋白或组合物用于在哺乳动物特别是人类中预防或治疗焦痂或褥疮。本发明的另一个目的是将本文描述的蛋白或组合物用于哺乳动物、特别是人类的皮肤移植的情形中。本文还提供了单克隆抗体，其与包含由选自于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3,SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 禾口 SEQ ID NO :7 的序列构成的氨基酸序列的人类可溶性CD146蛋白选择性结合。该抗体优选也中和本发明的人类可溶性CD146蛋白的生物活性。优选情况下，抗体在哺乳动物、优选为人类中降低或抑制新生血管化、血管通透性和/或血管内皮细胞生长。本文公开的抗体或包含所述抗体和可药用载体的药物组合物，可以在哺乳动物、 优选为人类中用于预防或治疗以不希望的过度新生血管化或血管通透性、诸如癌症，以可溶形式的⑶146和/或⑶146、特别是可溶性⑶146的受体的过表达或过度活化、或以选自 e-NOS、uPa、MMP-2和KDR的编码基因的基因与标准表达相比的过度表达为特征的疾病、障碍或机能障碍状态。在其他实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其分别编码本发明的人类可溶性⑶146、人类短形式的⑶146或其重组体形式。核酸分子可以可复制载体的形式提供，所述可复制载体包含与用载体转染或转化的宿主细胞、特别是成熟或未成熟内皮细胞或祖细胞、优选为内皮祖细胞所识别的控制序列可操作连接的核酸分子。本发明还提供了这种包含载体或核酸分子的宿主细胞。另一方面，本公开提供了包含任一种或多种本文描述的蛋白、抗体、细胞或组合物的试剂盒。典型情况下，试剂盒还包含按照所公开的方法使用蛋白、抗体、细胞或组合物的说明书。
图1 重组人类可溶性⑶146在体内和体外的趋化活性。A 在正常小鼠中维持12天的Matrigel胶塞的显微镜检查。将含有1 μ g/μ 1 PBS 或 1 μ g/ μ 1 c-myc 肽的对照 Matrigel 胶塞和含有 1 μ g/ μ 1 rh_sCD146 (可溶性 DC146) 的Matrigel胶塞注射到同一小鼠中。在rh_sCD146存在下在matrigel胶塞中观察到毛细血管样结构(箭头)。显示了在对照或rh-s⑶146 matrigel中用抗⑶31抗体(绿色)和抗⑶117抗体(红色)进行的免疫染色。核用dapi标记(蓝色)。B 在通过penian静脉注射有500，000个EPDC的裸鼠中维持12天的Matrigel 胶塞的免疫染色。将含有lyg/μ C-myc肽的对照Matrigel胶塞和含有1 μ g/μ 1 rh-sCD146的Matrigel胶塞注射到同一小鼠中。matrigel胶塞中的免疫染色使用抗人类 ⑶31抗体(红色)来进行。细胞核用dapi标记(蓝色)。C :rh-sCD146在体外对EPC的趋化效应。将EBM2培养基中的200，000个EPC接种到8 μ m孔径Transwell滤器的上层区室中。将下列试剂以不同浓度添加到Transwell滤器的下层区室中的培养基中rh-sCD146、c-myc肽、免疫贫化的rh_sCD146(Ip rh_sCD146)、 其对照(IpC)或VEGF。将Transwell滤器在37°C下温育过夜。将细胞用荧光染料标记并测量荧光强度。结果是4个不同实验的平均值+/-SEM。*，**，#* 实验与对照相比P <0. 05， P < 0. 01，P < 0. 001。D 使用抗CD45抗体、抗CD34抗体、抗α sma抗体、抗Μ0ΜΑ2抗体、抗CD31抗体和抗 ⑶117抗体，在填充有rh-s⑶146并在正常小鼠中维持了 12天的matrigel胶塞的切片上进行了免疫染色。核用DAPI标记(蓝色)。还使用⑶31/⑶146、⑶117/⑶31、⑶117/⑶146、 ⑶117/⑶33和⑶117/⑶45进行了共标记。给出了合并照片。黄色区域对应于共标记。在一些照片中，这些区域用箭头更好地标出。图2 重组人类可溶性⑶146在体外对内皮祖细胞衍生细胞的促血管生成能力的影响。A 评估了在存在或不存在不同浓度的rh-s⑶146、Fc-⑶146或对照IgGl、c-myc 肽、免疫贫化的rh-sCD146 (Ip rh_sCD146)或其对照(IpC)或VEGF的情况下，EPC在 Matrigel胶塞中制作假毛细血管的能力。在温育5小时后对管的数量进行计数。结果是6 个不同实验的平均值+/-SEM0 *，** 实验与对照相比P < 0. 05，P < 0. 01。B:使用在㈧中描述的实验条件评估了 EPC的增殖能力。结果是5个不同实验的平均值+/-SEM。**，*** 实验与对照相比P < 0. 01，P < 0. 001。C 使用在㈧中描述的实验条件评估了 EPC的迁移能力。结果是4个不同实验的平均值+/-SEM0 *，*** 实验与对照相比P < 0. 05，P < 0. 001。图3 在内皮祖细胞衍生细胞中血管生成基因转录本和产物对重组人类可溶性 ⑶146做出响应而上调A 在用或未用50ng/ml rh_s⑶146处理3小时的EPC中，使用对血管生成途经特异的寡核苷酸阵列监测基因表达情况的改变。基因表达改变通过qPCR验证。结果是4个不同实验的平均值。*，# 实验与对照相比P < 0. 05，P < 0. 01。B 进行了 Western 印迹分析以证实 MMP-2、e_N0S、uPA、KDR(也称为 VEGFR2)的蛋白上调，并建立诱导动力学。对每种蛋白显示了代表性实验。
C:在B中描述的3-5个实验的定量。*，**，*# 实验与对照相比P < 0.05，P
<0. 01，P < 0. 001。图4 在大鼠局部缺血后肢模型中局部注射重组人类可溶性⑶146的效应A 对大鼠进行手术以在后肢中诱导局部缺血。在随后的天中，对大鼠进行含有 10 μ g/ml c-myc肽或10 μ g/ml rh_s⑶146的溶液的每日局部注射，注射5或12天。在手术后每5天对动物的自断离水平和血液灌注速率(激光多普勒分析)进行分析，共进行20 天。结果是每组中的9只不同动物的平均值。*:实验与对照相比P <0.05。B 在手术后12天，在来自于对照未处理的、c-myc肽处理的或rh_s⑶146处理的大鼠的后肢肌肉切片上进行组织化学检查。C 在对照动物、c-myc处理或rh_s⑶146处理的大鼠(12天)中，通过组织化学检查观察到的对炎症和纤维变性水平、坏死纤维的量、血管发生和肌肉情况的影响的估算。给出了半定量，定义为_(不存在)，+/_(低表达)，+(中等表达)，++(高表达)。D:使用抗CD117抗体(绿色)和抗CD146抗体(红色)，在用或未用(对照) rh-s⑶146处理两天的局部缺血大鼠的肌肉切片中进行了共免疫染色。核用DAPI标记(蓝色)。给出了合并照片。黄色区域对应于共标记(用箭头标出)。图5 :rh_s⑶146和VEGF在体外对内皮祖细胞的血管生成能力的累加效应A 评估了当 rh-sCD146(50ng/ml)和 VEGFQOng/ml) —起添加时晚期 EPC 的增殖能力，并与每种生长因子单独添加时的效应进行比较。结果是4个不同实验的平均值 +/-SEM。B 使用伤口愈合测定法评估了当rh-sCD146(50ng/ml)和VEGFQOng/ml) —起添加时晚期EPC的迁移能力，并与每种生长因子单独添加时的效应进行比较。结果是4个不同实验的平均值+/-SEM。C 在不同条件下评估了 EPC在matrigel胶塞中制造假毛细血管的能力。评估了当 rh-sCD146(50ng/ml)和VEGFQOng/ml) —起添加时毛细血管样结构的数量，并与每种生长因子单独添加时的效应进行比较。此外，在对照条件(Ab)、存在rh-s⑶146 (Ab+rh-s⑶146)、 存在VEGF (Ab+VEGF)和存在两种生长因子(Ab+rh_sCD146+VEGF)的情况下，测试了在添加生长因子前预温育抗VEGFR2抗体(Ab)的影响。在最后一种条件(清洗过的 Ab+rh-s⑶146+VEGF)下，将抗体预温育，然后清洗，再添加两种生长因子。在温育5小时后，对管的数量进行计数。结果是6个不同实验的平均值+/-SEM。**:p<0.01，***:P
<0. 001，实验与对照相比。图6 抗SCD146抗体的表征。在与G蛋白珠偶联的s⑶146和Huvec上，通过流式细胞术分析分别测试了抗体与可溶性⑶146结合(A)但不与膜⑶146结合(B)的能力。显示了在s⑶146上但不在膜 ⑶146上表现出结合的6种不同抗体。*** :p < 0. 001 ；$，$$ :p < 0. 01，ρ < 0. 001，Ab+sCD146 与 sCD146 相比。图7 抗s⑶146抗体对s⑶146诱导的EPC增殖的增加的阻断效应。对于能够结合可溶性⑶146但是不结合膜⑶146的抗体，测试了它们抑制s⑶146 对EPC增殖的效应的能力。在这些抗体中，6种抗体显著阻断了 s⑶146诱导的EPC增殖。 *** :p < 0. 001 ；$，$$ :p < 0. 01，ρ < 0. 001，Ab+sCD146 与 sCD146 相比。
图8 重组人类可溶性⑶146对人类角质形成细胞的增殖能力的影响测试了不同浓度的可溶性CD146对人类角质形成细胞的增殖能力的影响。结果是4个不同实验的平均值 +/-SEM。* :P < 0. 05，实验与对照(C)相比。发明详述在下述本发明的描述中，将使用下列术语，它们打算如下指出的进行定义。“人类长⑶146蛋白”或“长⑶146”是指主要存在于内皮细胞的膜中，并具有对应于下列SEQ ID NO 8的氨基酸序列的人类蛋白、肽或氨基酸分子MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEITLPPSRKTEL WEVKSDKLPEEMGLLQGSSGDKRAP⑶QGEKYIDLRH“人类短⑶146蛋白”或“短⑶146”是指主要存在于内皮细胞的膜中，并具有对应于下列SEQ ID NO 9的氨基酸序列的人类蛋白、肽或氨基酸分子MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEMERNTSI“人类可溶性⑶146蛋白”或“可溶性⑶146”是指含有约552至约558个氨基酸、 优选558个氨基酸、更优选557、556、555、554、553或552个氨基酸的人类蛋白、肽或氨基酸分子。本发明的人类可溶性⑶146蛋白的实例包含氨基酸序列SEQ ID NO 8的至少1至 522位(含522位)残基，优选至少1至557位(含557位)残基。在具体实施方案中，本发明提供了包含由SEQ ID NO :1构成的氨基酸序列的蛋白MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKE匪VLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKL，其对应于本文中所述的可用于哺乳动物治疗、特别是人类治疗情形中的优选的人类可溶性CD146蛋白。另一种可用在哺乳动物治疗情形中的人类可溶性CD146蛋白具有由下列已鉴定的序列之一构成的氨基酸序列SEQ ID NO 2 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPSEQ ID NO 3 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPESEQ ID NO 4 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKE匪VLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPSEQ ID NO 5 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKE匪VLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESEQ ID NO 6 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESSEQ ID NO 7 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESR在上述序列中，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 6是特别优选的。可溶性CD146存在于人类血清中并从其中提取或人工再生。在优选实施方案中， 可溶性⑶146含有由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6构成的氨基酸序列。优选情况下，本文公开的人类可溶性CD146是生物活性人类可溶性CD146，即它在体外、离体或体内引发、促进、增加或刺激血管生成和/或血管发生。优选情况下，可溶性CD146显示出趋化活性，即可溶性CD146能够诱导内源或外源细胞向其中将发生血管生成和/或血管发生的位点的调动或迁移，所述细胞优选为内皮来源的细胞(KDR+和/或CD31+细胞)，优选选自未成熟的内皮细胞(特别是CD117+细胞)、成熟的内皮细胞(特别是KDR+细胞)、内皮祖细胞(EPC) 例如干细胞(典型为骨髓衍生的干细胞)及其混合物，和/或允许或有利于这种细胞组织成血管样结构。生物活性人类可溶性CD146也能活化前面定义的内皮细胞，即增加它们增殖的能力和/或促进假毛细血管发生。本文公开的人类可溶性CD146还优选能够在优选选自上面指出的细胞上，与 ⑶146的短同工型(“短⑶146”)、⑶146受体特别是可溶性⑶146受体、和/或与包含这种⑶146的短同工型和可溶性⑶146受体的复合物相互作用。正如前面解释的，本发明的典型的人类可溶性CD146蛋白是可用于治疗情形中 (治疗性或预防性蛋白)或诊断情形中，并与向人类给药、特别是通过注射到血流中和/或通过皮下和/或肌肉内给药相容的蛋白。术语“治疗”是指治疗性和预防性或防止性治疗或措施两者，其能够减轻或治愈疾病、障碍或机能障碍状态。这样的治疗打算用于需要它的哺乳动物对象，优选为人类对象。 就此而言，考虑到的是患有导致组织局部缺血的疾病、障碍或机能障碍状态的对象，或被认为处于发生这种疾病、障碍或机能障碍状态的“风险”之中，因此必须进行预防的对象。导致组织局部缺血的疾病、障碍或机能障碍状态是导致异常血管生成和/或血管发生的疾病、障碍或机能障碍状态，特别是导致不想要的过度新生血管化、血管通透性(内皮细胞的细胞间连接的改变)和/或血管内皮细胞生长的疾病、障碍或机能障碍状态。这种疾病的实例包括癌症、糖尿病、衰老相关的黄斑变性、类风湿性关节炎、牛皮癣、任何已知的血管疾病包括动脉粥样硬化血管病、心血管病例如冠状动脉病、局部缺血性心脏病和中风、 脑血管局部缺血、外周血管病例如外周动脉闭塞性疾病。在这些导致不想要的新生血管化的病症中，新的血管补给患病组织，破坏正常组织，并且在癌症的情况下，新血管允许肿瘤细胞逃逸到循环中并驻留在其他器官中(肿瘤转移)。障碍可能是如上所述的疾病或创伤的结果。典型的障碍是例如炎症、浮肿、纤维变性或坏死。机能障碍状态的实例的特征在于至少一种特定形式的CD146或CD146受体、特别是可溶性CD146受体的缺乏，或正好相反，即它们与标准表达相比的过度表达。机能障碍状态的其他实例以选自e-N0S、uPa、MMP-2和KDR的编码基因的基因与正常表达相比的表达降低或过量为特征。有利情况下，以表达的缺乏为特征的机能障碍状态通过本发明的人类可溶性 ⑶146或包含这种可溶性⑶146的治疗性组合物或细胞来治疗(如下所述)。有利情况下，以过量表达为特征的机能障碍状态例如癌症，通过本文所述的针对人类可溶性CD146的抗体或针对这种人类可溶性CD146的任何其他拮抗剂来治疗。在具体实施方案中，机能障碍状态例如癌症可以通过将针对人类可溶性CD146的抗体与针对促血管生成因子例如VEGF的抗体合在一起来治疗。因此，本说明书鉴定了分离的人类可溶性⑶146蛋白，其包含约552至558个氨基酸、优选552至557个氨基酸、更优选552或557个氨基酸。“分离的”是指从其在人类对象中的天然来源或环境的组分中，特别是从所述对象的骨髓或血液中鉴定并分离或回收。优选的人类可溶性⑶146蛋白包含由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :6构成的氨基酸序列，并对应于可用于本文所述的哺乳动物治疗、特别是人类治疗情形中的蛋白。本发明还提供了分别编码本文描述的发明的蛋白的核酸分子。这样的核酸分子是RNA或DNA，其优选各自编码生物活性人类⑶146、特别是本发明的人类可溶性⑶146、人类⑶146的短形式及其重组体形式。核酸序列的实例提供如下SEQ ID NO :17(短 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTACCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGAGCCGGGGCGTGGTCATC GTGGCTGTGATTGTGTGCATCCTGGTCCTGGCGGTGCTGGGCGCTGTCCTCTATTTCCTCTATAAGAAGGGCAAGCT GCCGTGCAGGAGCTCAGGGAAGCAGGAGATGGAGAGAAATACATCGATCTGASEQ ID NO :10(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAATGTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGSEQ ID NO :11(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGSEQ ID NO :12(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGGTGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGSEQ ID NO 13 (可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGSEQ ID NO 14(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTACCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGSEQ ID NO 15 (可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTGCCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGAGCSEQ ID NO 16(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCC CTGTGAACAGTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAG TCATCTGGTACAAGAATGGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAG TCGAGTGGTTTGTACACCTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTG TGAGCTCAACTACCGGCTGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGA CAGAAAAAGTGTGGCTGGAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCT GATGGCAACCCTCCACCACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAA CGACAACGGGGTCCTGGTGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGG ACACCATGATATCGCTGCTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCA GCCCCTGAGAGACAGGAAGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTG GCTGAGAGAAGAGACAGGCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAG GCGGCTATCGCTGCGTGGCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTT GGCCCCCCTTGGATGGCATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGC GTCAGGGCACCCCCGGCCCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAG TCCTGAGCACCCTGAATGTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTG GGCAAAAACACCAGCATCCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGG CCTCAGCACTTCCACTGCCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGA GCCGG天然(非重组)分子可以从例如核酸文库分离，所述核酸文库从已知表达目标蛋白的组织、例如血液特别是血清或骨髓制备，将文库用适合的探针筛选，或者可以从组织样品(骨髓、血液、血清等)、优选为待治疗对象的样品分离(参见例如Hoskins RA, Stapleton M, George RA, Yu C, Wan KH, Carlson Jff, Celniker SE.通过反向 PCR 产物的自连(SLIP)进行快速有效的 cDNA 筛选(Rapid and efficient cDNA library screening by self-ligation of inverse PCR products(SLIP))Nucleic Acids Research 2005 ；33 185-197)。此外，核酸分子可以人工产生，例如通过寡核苷酸合成(参见例如Michaels ML, Hsiao HM,Miller JH.使用PCR扩展寡核苷酸合成的限度(Using PCR to extend the limit of oligonucleotide synthesis. )Biotechniques. 1992 ； 12 :44-48)。本发明的优选人类可溶性CD146蛋白可以使用包含下列步骤的方法来获得用表达人类可溶性CD146蛋白的适合载体转染哺乳动物细胞，并分离表达的人类CD146蛋白。本文描述了与另一个多肽例如标签多肽序列融合的重组人类可溶性 ⑶146(rh-s⑶146)蛋白(参见实验部分中带有c-myc标签的人类可溶性⑶146，其中可溶性 CD146 的序列是 SEQ ID NO 7)。核酸分子可以提供在可复制载体中，所述可复制载体包含与用载体转染或转化的宿主细胞、特别是成熟或未成熟内皮细胞或祖细胞、优选为内皮祖细胞(EPC，在本文中也称为EPDC)、典型为前文中描述的细胞所识别的控制序列可操作连接的核酸分子。本发明还提供了这种包含载体或核酸分子的宿主细胞，正如下文中进一步解释的。本发明的氨基酸分子可以被设计成与在哺乳动物、优选为人类中的诊断、治疗或预防应用相容。它们可以被例如糖基化、甲基化、乙酰化、磷酸化，用于靶向不同类型的组织，特别是病理组织例如典型为局部缺血组织，优选在人类中。适合用于表达糖基化可溶性人类⑶146的宿主细胞可以选自哺乳动物细胞系，例如CHO细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了可用于促进血管细胞生长、典型为内皮细胞生长的组合物，特别是药物组合物，其在可药用载体或赋形剂中优选以治疗有效量包含本文所述的可溶性CD146蛋白。可溶性CD146蛋白的“治疗有效量”是允许对哺乳动物进行前文所定义的治疗的量。可用于本发明情形中的可药用赋形剂、介质或载体，是例如盐水、等渗缓冲溶液例如20%甘露糖醇，任选与稳定剂例如同基因的白蛋白或任何其他稳定化蛋白、甘油等组合， 并且也与佐剂例如聚凝胺或DEAE葡聚糖等组合。在特定情况下，本文描述的包含可溶性⑶46、优选为人类可溶性⑶146的组合，还可以包含至少一种其他血管生成因子。在本发明的上下文中，血管生成因子是有利于血管发育的因子。可用于本发明的情形中的血管生成因子可以选自血管生成素、血管新生蛋白因子-l、Del-l、成纤维细胞生长因子酸性(aFGF)和碱性(bFGF)、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)/扩散因子(SF)、白介素-8(IL-8)、瘦素、midkine、胎盘生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF-BB)、多效生长因子(PTN)、 促红细胞生成素(EPO)、内皮一氧化氮合酶(e-NOS)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、转化生长因子-α (TGF-α)、转化生长因子-β (TGF-β )、肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、血管内皮生长因子(VEGF)、血管通透性因子(VPF)、促血管新生蛋白因子-I(Angl)、血纤维溶酶原激活剂尿激酶(PLAU/u-Pa)、基质金属肽酶MMP-2、VEGF受体2 (KDR)、基质细胞衍生因子_1 (SDF-I) 等，及其混合物。优选的促血管生成因子可以选自血管内皮生长因子(VEGF-参见实验部分和图5)、基质细胞衍生因子-1 (SDF-I)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、促红细胞生成素 (EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、白介素-8(IL-8)及其混合物。在另一种特定情况下，本文描述的包含针对可溶性⑶146的抗体的组合物，还可以包含针对上面指出的血管生成因子之一的至少一种其他抗体。在另一种特定情况下，本文描述的包含人类可溶性⑶146的组合物还可以另外包含成熟或未成熟的内皮细胞或祖细胞，典型为人类来源的，优选为体外扩增的祖细胞，特别是干细胞或内皮祖细胞，典型为源自血液或骨髓的细胞，例如选自于表达CD34、CD133、 CD31、VE-钙粘蛋白、VEGFR2、c-Kit、CD45 和 / 或 Tie_2 的细胞。正如下面进一步解释的，本发明的一个实施方案是将包含前面提到的细胞的组合物与本文定义的可溶性CD146相接触，然后任选掺入到可药用赋形剂中。这样的组合物不包含添加的可溶性⑶146。在优选实施方案中，祖细胞是重组祖细胞。这样的重组细胞可以使用适合的载体进行遗传修饰，所述载体包含表达、优选能够过表达特定生物活性形式的CD146、优选为如上所定义的人类短形式的CD146或人类可溶形式的CD146的遗传或核酸构建物，或由这些构建物构成。有许多可用载体。优选的载体可以选自质粒、反转录病毒、慢病毒和腺病毒。载体组分一般包括但不限于下列一种或多种信号序列，复制原点，一个或多个标志物基因，增强子元件，启动子和转录终止序列，可以由本领域技术人员容易地选择(参见例如Liu Jff, Pernod G, Dunoyer-Geindre S, Fish RJ, Yang H, Bounameaux H, Kruithof ΕΚ.慢病毒转导的人类血液来源的内皮祖细胞的转基因表达的启动子依赖性(Promoter dependence of transgene expression by lentivirus-transduced human blood-derived endothelial progenitor cells.) Stem Cells. 2006 ；24 :199-208)。这样的祖细胞可以按照已知流程、优选为适合于内皮祖细胞的流程例如电穿孔或使用脂质体，用适合的载体、优选用上面描述的质粒进行转染，然后在任何已知的适合培养基(例如包含EGM-2的培养基)中培养，所述培养基任选增补有下列一种或多种物质适合的激素、生长因子、缓冲液等。然后可以使用本领域技术人员已知的任何技术将祖细胞在体外扩增(参见例如Delorme B等，在人类CD146+血液细胞中存在与成熟的内皮细胞不同的内皮祖细胞(Presence of endothelial progenitor cells, distinct from mature endothelial cells, within human CD146+blood cells)Thromb Haemost. 2005 ； 94 :1270-9)。本发明还涉及了使用本发明的人类可溶性CD146蛋白离体制备如上所定义的表现出治疗或预防性质、特别是能够在人体中刺激血管发生的成熟或未成熟内皮细胞或祖细胞。事实上，本发明人发现，这样的细胞一旦给药到对象，能够靠其自身与本发明的人类可溶性⑶146蛋白接触、“预处理”或“引发”，以诱导或刺激血管生成和/或血管发生。“预处理过”或“引发过”的细胞在任选掺入到可药用载体中以前，已经与本发明的人类可溶性 CD146蛋白接触或在其存在下进行培养。这样的细胞以及优选在可药用载体中包含所述细胞的药物组合物，是本发明的另一个目的。在制备这样的药物组合物时，任选进一步添加人类可溶性⑶146。优选的“预处理过”或“引发过”的细胞，是已经过如前所解释的遗传修饰，以过表达短形式⑶146或可溶性⑶146的细胞。另一方面，本发明涉及本文所述的蛋白或组合物，其用于导致组织局部缺血，或以 ⑶146、特别是可溶性⑶146的受体的活化降低、或以选自e-N0S、uPa、MMP-2和KDR的编码基因的基因的表达与标准值相比降低为特征的疾病、障碍或机能障碍状态的治疗。本发明涉及本文所述的蛋白或组合物，其用于预防局部缺血。具体来说，本发明涉及使用本文所述的蛋白或组合物制备组合物，用于预防或治疗前文中所指出的疾病、障碍或机能障碍状态。在另一个具体实施方案中，本发明提供了在哺乳动物、优选为人类中预防或治疗本文所指出的疾病、障碍或机能障碍状态的方法，特别是预防或治疗组织局部缺血的方法， 包含向哺乳动物给药有效量的本文所述的包含可溶性CD146蛋白的组合物。另一方面，本发明涉及使用本文描述的蛋白或组合物改进瘢痕的美观性，或预防性地促进瘢痕形成或创伤、伤口或切口的愈合。本发明的目的是将本文描述的蛋白或组合物用于哺乳动物上皮、特别是人类上皮的瘢痕形成，特别是在创伤、伤口或切口出现后或在皮肤移植的情形中。本发明的另一个目的是将本文描述的蛋白或组合物用于在哺乳动物特别是人类中预防或治疗焦痂或褥疮。有利情况下，用于瘢痕形成情形中的优选组合物将按照本领域技术人员已知的方法配制成用于表面施用。在另一个实施方案中，本发明还提供了单克隆抗体，其与本发明的人类可溶性 CD146蛋白、优选与包含由SEQ ID NO :1或SEQ NO :6构成的氨基酸序列的蛋白选择性结合。该抗体优选也中和本发明的人类可溶性CD146蛋白的生物活性。优选情况下，单克隆抗体在本文所定义的对象、典型为哺乳动物、优选为人类中降低或抑制新生血管化、血管通透性和/或血管内皮细胞生长。单克隆抗体优选也能降低或抑制可溶性CD146受体的过量表达(与标准表达相比)或选自e-N0S、uPa、MMP-2和KDR的编码基因的基因的过量表达(与标准表达相比)。与人类可溶性⑶146蛋白和⑶146或可溶性⑶146蛋白受体(或⑶146蛋白受体亚基)两者结合的抗体，也在本发明的范围内。制造这些抗体的方法在本技术领域中是己知的(参见例如 Despoix N, Walzer T, Jouve N, Blot-Chabaud M, Bardin N, Paul P, Lyonnet L, Vivier Ε, Dignat-George F, Vely F.小鼠 CD146/MCAM 是自然杀伤细胞成熟白勺t示志· (Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation)Eur J Immunol. 2008；38 :2855-64)。在本发明的情形中，由本发明人选择的能够选择性结合可溶性CD146(与膜CD146 相比)的优选抗体,在图 7 上标出(2B9-4、2B9-5、26D12-6、26D12-7、26D12-8 和 15E8-1)。本文描述的抗体可以相应的适合剂量掺入到还包含可药用载体的组合物中。在特定情况下，本文描述的包含本文所述的抗体、特别是特异性针对本文所述的优选由SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 6构成的人类可溶性⑶146的抗体的组合物，还可以包含至少一种其他抗血管生成因子。在本发明的情形中，抗血管生成因子是抑制或干扰血管发生的因子。可用于本发明情形中的抗血管生成因子可以选自针对如上定义的血管生成因子的抗体、angioarrestin、血管生成抑制素(血纤维溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III、 软骨衍生的抑制剂(CDI)、CD59补体片段、内皮抑素(胶原蛋白XVIII片段)、纤连蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素六糖片段、人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、干扰素α/β/γ、干扰素诱导的蛋白(IP-IO)、白介素-12，kringle 5 (血纤维溶酶原片段)、金属蛋白酶抑制剂 (TIMP)、2_甲氧基雌二醇、胎盘核糖核酸酶抑制剂、血纤维溶酶原激活物抑制剂、血小板因子_4(PF4)、催乳素16kD片段、增殖蛋白相关蛋白(PRP)、类视色素、四氢皮质醇-S、血小板反应蛋白-I(TSP-I)、转化生长因子-β (TGF-b)、血管抑制素、血管抑制因子(钙网蛋白片段)等，及其混合物。本文公开的抗体或包含至少所述抗体和可药用载体的药物组合物，可以使用在哺乳动物、优选为人类中，用于预防或治疗以不想要的过度新生血管化或血管通透性为特征的疾病、障碍或机能障碍状态，例如癌症特别是乳腺癌或黑素瘤，或以CD146、特别是可溶性 ⑶146的受体的过表达或过度活化、或以选自e-NOS、uPa、MMP-2和KDR的编码基因的基因与标准表达相比的过量表达为特征的疾病、障碍或机能障碍状态。诊断或药物组合物的剂量，可以由本领域技术人员根据待治疗对象、给药途径、靶向组织、生物活性化合物(如本文所公开的)等进行调整。可以使用各种不同方案进行给药，例如同时或顺序给药人类可溶性CD146和上文定义的任何其他化合物(例如上文描述的“预处理过的”、“引发过的”和/或遗传修饰过的细胞)、单次或重复给药等，其可以由本领域技术人员进行调整。含有本发明的产品的药物组合物可以例如系统地、皮下、脊椎内、脑内给药给患者，只要靶向病理组织或区域即可。优选的注射方式是系统注射，特别是静脉内或动脉内注射或皮下注射。本发明的分子还可用于诊断方法中。术语诊断是指任何体内、离体或体外诊断，包括分子检测、监测、定量、比较等。具体来说，人类可溶性CD146蛋白可用作生物标志物，为哺乳动物、优选为人类中的疾病、特别是局部缺血或癌症的存在、肿瘤的转移或这些疾病状态的进展提供指示。具体来说，人类可溶性CD146蛋白的血清浓度在这种情况下可能指示为高的值。事实上，可以将测量值同与对象健康状态相关的标准值进行比较。具体来说，可溶形式的CD146的过表达可能指示了癌症的存在。术语诊断还包括使用分子筛选在体外、离体或体内引起或增加细胞凋亡的化合物或治疗。本文还提供了试剂盒，其包含至少一种本文所述的生物活性产物例如人类可溶性 ⑶146，针对所述人类可溶性⑶146的抗体、特别是单克隆抗体，“预处理过”或“引发过”(用所述人类可溶性CD146刺激过)和/或遗传修饰过(以过表达短形式的CD146或可溶性 CD146)的细胞，以及任选的(ii)提供指导的说明书。本发明的其他特点和优点将在下面的实施例中描述，所述实施例应该被视为说明性的而不是限制性的。所有在本申请中引用的参考文献在此引为参考。
实施例实施例1 可溶性⑶146显示出血管生成性质并在实验性后肢局部缺血中促进新
生血管化。材料和方法重组人类可溶性⑶146对应于可溶形式人类⑶146的带有c-myc标签的重组蛋白从 Biocytex (Marseille，法国)获得。⑶146在其N-端的表位标签能使我们使用抗c-myc肽抗体(Abeam)特异性检测重组分子并将其与内源⑶146区分开。体内 Matrigel 胶塞
将非免疫受损小鼠或裸鼠麻醉，并将含有0. 1 μ g/μ 1 c-myc肽或0. 1 μ g/μ 1 rh-s⑶146的400 μ 1冰冷的matrigel分别注射到每只动物的左侧和右侧腹股沟区域中。 然后根据实验向动物注射或不注射500，000个晚期EPC。12天后，取出matrigel胶塞并冷冻。上述过程在学术委员会批准的动物使用规程下进行。在大鼠中诱导后肢局部缺血通过完全切除整个左侧股动脉然后进行微珠注射，对雄性大鼠进行了单侧后肢局部缺血。激光多普勒组织成像显示，左侧总股动脉的阻塞在第一日将血液灌注减少了约 90%。手术后，将动物分成四个处理组两个对照组每日在局部缺血的内收肌中注射IOyg c-myc肽5日或12日；两个实验组与对照组相同处理，只是将c-myc肽替换成重组人类可溶性⑶146 (rh-s⑶146)。上述过程在学术委员会批准的动物使用规程下进行。激光多普勒血液流动分析使用激光多普勒血流分析仪测量局部缺血与正常后肢相比的血液流动比。在不同时间点(手术后第1、5、10、15和21日)，在目标区域(腿和脚)上对动物进行2次连续的激光扫描。血液流动被表示成局部缺血与正常后肢相比的比。形态学、组织学和免疫化学评估在局部缺血诱导或启动后第20日，使用致死剂量的戊巴比妥(Clin Midy, Gentilly，法国)将动物处死，并通过用4%磷酸盐缓冲的聚甲醛(Sigma-Aldrich)进行跨心脏灌注将肌肉固定。使用滑动式切片机(CM1900，Leica，France SA)切出冷冻切片，并储存在-20°C。所有切片由对实验条件未知的研究人员使用装备有数字相机(DXM1200，Nikon France SA)的光学显微镜(Eclipse TE 2000-U, Nikon France SA)进行检查。在局部缺血诱导20天后，通过在用曙红-苏木精染色的连续肌肉切片上对局部缺血区域的核心和边界区中诱导的细胞变化进行显微镜检查，执行了组织学分析。切片检查在光学显微镜下、在两个连续切片上进行。使用从无(_)到强(++)的四点标度进行了细胞变化的半定量评估。毛细血管密度通过肌肉冷冻切片的显微镜分析来确定。在体内matrigel胶塞实验或对肌肉进行的实验中，使用5 μ m厚的切片用来染色。 在正常血清中阻断后，将切片在4°C下用抗⑶31抗体(1/50)、抗⑶117抗体(1/50)、抗⑶34 抗体(1/40)、抗 CD45 抗体(1/200)、抗 M0MA2 抗体(1/200)、抗 α sma 抗体(1/80)、抗 CD33 抗体(1/100)或抗CD146抗体(1/100)处理。当未结合时，信号放大使用荧光染料(Alexa 488 或 Alexa 647)偶联的第二抗体(1/250 ； Invitrogen)。将切片用 DAPI(1 1000， Sigma-Aldrich)复染、漂洗并固定。为了评估非特异性染色，每隔一张切片在不含第一抗体的情况下温育。循环中的内皮祖细胞的分离和细胞培养将在同意后从供体收获的人类脐带血样品收集在肝素化的试管中。通过密度梯度离心分离单核细胞(MNC)。然后将脐带血MNC在塑料三角瓶中在RPMI/10%胎牛血清 (FCS)中预铺板M小时。将非黏附细胞铺板在0.2%明胶包被的M孔板上(每个孔IO5个细胞)，并维持在增补有EGM-2 SingleQuots的内皮基本培养基_2 (EBM-2) (EGM-2培养基， Clonetics, ffalkersville, MD, USA)中。为了扩增内皮祖细胞衍生细胞(EPDC)、也称为晚内皮祖细胞(EPC)，将集落用胰蛋白酶处理，并根据实验将细胞重新铺在平板或Iabtek载片上。将细胞维持在标准条件下(加湿气氛，5% C02，37°C )。
对于EPDC刺激实验来说，将细胞在EBM2中维持3小时，然后根据实验用 50ng/ml 重组人类可溶性 CD146 (rh-sCD146) (biocytex)、20ng/ml VEGF (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)或适合的溶液刺激1至M小时。体外趋化活性实验在半透性Transwell滤器(8 μ m孔径；24孔；B&D)上在EGM2培养基中进行。 将500，000个事先用钙黄绿素在37°C下标记30分钟的EPDC接种到上层区室中。然后在下层区室中加入不同浓度的rh-s⑶146，在37°C温育过夜后测量EPDC跨过滤器的迁移。使用 cytofluor 装置(Cytofluor Series 4000 ；PerSeptive Biosystems)测量荧光强度。Matrigel中内皮细胞管的形成将 96 孑L板用冷的 Matrigel Basement Membrane (10mg/ml, BD Biosciences, Bedford, MA, USA) :EBM_2培养基的1 : 1的混合物预包被。在37°C下聚合45分钟后，将 EPDC以IO4个细胞/孔的密度铺于增补或未增补rh-s⑶146或VEGF的EBM中。5小时后， 在倒置显微镜下以400x的放大倍数对每种条件获取代表性视野的照片。通过用Lucia 软件(Nikon)测量血管总长度和每个视野中的血管数量来评估毛细血管形成。细胞增殖测定方法将EPDC接种在96孔板上(5. IO3/孔)，并在EGM-2培养基中培养3天。然后将细胞在EBM-2培养基中预温育2小时。细胞增殖使用来自Roche Corporation的BrdU标记和检测试剂盒III，通过5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)在细胞DNA中的掺入来测定。简单来说，将细胞在不存在或存在rh-sCD146或VEGF的情况下，在EBM-2培养基中与BrdU标记溶液温育12小时。将细胞DNA通过核酸酶处理进行部分消化，并使用过氧化物酶偶联的第一抗体检测掺入的BrdU。使用Uvmc2微孔板读板器(Mfas,Monaco)测量405nm处的吸光度。 结果用任意单位表示。实验进行一式三份。伤口愈合测定方法使用移液管尖头在M孔板上培养的EPDC合生单层上制造可重现的伤口。使用 Olympus倒置显微镜以400x放大倍数测量伤口表面，并用Biocom Visiolab图像分析软件 (Les Ulis, France)获取。除去培养基，将EPDC与含有或不含不同浓度rh_sCD146的EBM-2 温育6小时。通过从原始伤口面积中减去温育6小时后测量到的伤口面积，来计算细胞伤口修复。结果被表示成百分率，以原始伤口的面积作为100%。Western 印迹分析Western印迹分析如下执行。简单来说，将细胞在用或未用rh_s⑶146处理的板上，然后在PBS中清洗，从板上刮下，并用300 μ 1冰冷的裂解缓冲液(150mM NaCl, 50mM Tris HCl (pH 7. 4), 2. 4mM EDTA, 1% Nonidet P40，0. 5mM 苯甲基磺酰氟)在 4°C下提取 30 分钟。在离心(12，000g，10min，4°C )除去细胞碎片和核之后，通过蛋白测定法(Biorad)对蛋白定量。将30 μ g蛋白重悬浮在40 μ 1 NuPage LDS样品缓冲液(Invitrogen)中。然后对样品进行4-12% NuPage SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Invitrogen)，并转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen)。使用特异性第一抗体(抗KDR抗体、抗ul^a抗体、抗MMP-2抗体、抗e_N0S 抗体(参见下文))，然后用与过氧化物酶偶联的第二抗体对膜进行探测，并使用ECL试剂盒 (Amersham)检测。膜在剥脱后使用各种抗体进行探测。基因表达情况分析
从用或未用50ng/ml rh_sCD146处理3小时的培养的EPDC分离总细胞RNA。这使用RNeasy试剂盒Oliagen GmbH，Hilden，德国)，按照制造商的说明书包括DNase消化步骤来进行。寡核苷酸阵列杂交使用血管发生寡核苷酸阵列(Tebu-Bio)按照制造商的说明书来进行。使用软件对斑点进行定量。对于测试和参比DNA斑点两者的信号平均强度来说， 进行了背景的差减。针对所有比率的平均值进行计算比率的归一化。杂交进行三次，并从一次代表性实验获取数据。RNA分离、cDNA合成和实时PCR按照制造商的说明书包括DNase消化步骤，使用RNeasy试剂盒Oliagen GmbH, Hilden，德国)从EPDC分离总细胞RNA。将5 μ g总RNA在50 μ 1反应中进行反转录，所述反应含 40U RNaseOUT(Invitrogen, Frederick, Maryland, USA)、150ng 随机六聚物引物 (Roche Manheim,德国)、10mM dNTP (Invitrogen)禾口 200U Superscript II (Invitrogen)。 在0. 4 μ M的优化寡核苷酸浓度下，使用对各种基因或对照基因特异的引物组对cDNA样品 (0. 2 μ 1)进行qPCR.正向(F)和反向(R)特异性引物序列是UPA-F :TTTGCGGCCATCTACAGGAG(SEQ ID NO :18)UPA-R :AGTTAAGCCTTGAGCGACCCA (SEQ ID NO :19)KDR-F :TGTGGGTTTGCCTAGTGTTTCT(SEQ ID NO :20)KDR-R :CACTCAGTCACCTCCACCCTT(SEQ ID NO :21)eNOS-F :CTCATGGGCACGGTGATG(SEQ ID NO :22)eNOS-R :ACCACGTCATACTCATCCATACAC(SEQ ID NO :23)MMP2-F TGATCTTGACCAGAATACCATCGA (SEQ ID NO :24)MMP2-R :GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT (SEQ ID NO :25)反应在20 μ 1总体积中使用FastMart DNA Master 5 SYBR GreenI试剂盒按照制造商的说明书(Roche)进行。扩增循环如下95°C下IOmin (热启动PCR)，然后进行40个循环的95°C下10sec、62°C下IOsec和72°C下20sec (产物扩增)。在扩增循环结束时，通过将温度缓慢增加(0. rC/sec)到高达95°C，进行了解链温度分析。扩增、数据获取和分析使用Light Cycler仪器和LightCycler 3. 5. 2软件(Roche)进行。将每个基因的临界循环数(Ct)针对GAPDH的临界循环数进行归一化。给出的值是指针对IO6个GAPDH转录本拷贝的给定基因的转录本拷贝数。肽、抗体和抑制剂制备了重组人类可溶形式的⑶146 (rh-s⑶146)及其FITC偶联版本。该肽对应于 N-端带有c-myc表位标签的人类CD146的细胞外结构域(EQKLISEEDL (SEQ ID NO :26))。标签用于特异性追踪外源重组蛋白并用于对照免疫贫化实验。使用相应的c-myc肽(Abeam) 作为对照。Fc-⑶146通过将人类IgGl的Fc部分与人类⑶146的细胞外部分融合来产生。抗 KDR抗体(Sigma)、抗uPa抗体(American diagnostic inc.)、抗MMP-2 抗体(Calbiochem)、 抗 e-N0S抗体(Santa Cruz Biotechnology)、抗CD146 抗体(克隆 S-Endo-l ；Biocytex)、抗 CD31 抗体(B&D)、抗 CD45 抗体(B&D)、抗 CD33 抗体(B&D)和抗 CD117 抗体(B&D)以 1/500 的稀释度使用。在本研究中使用的抗小鼠抗体是抗CD45抗体、抗CD34抗体、抗asma抗体、抗 M0MA2抗体(Dako Inc. ；Glostrup ；Denmark) >Alexa fluor 488抗CD31 抗体禾口Alexa fluor647 抗 CDl 17 抗体(Biolegend)、抗 CD33 抗体(Santa Cruz)和抗 CD146 抗体。在本研究中使用的抗大鼠抗体是抗⑶117抗体(Neuromics)和抗⑶146抗体。使用了抗VEGFR2 阻断抗体(r212 ；Acris Antibodies GmbH, Herford ；德国)。使用免疫测定法测定培养基中的VEGF浓度。实验按照制造商(Invitrogen)的描述进行。统计分析数据表示成所标明次数的实验的平均值士SEM。统计分析使用Prism软件 (GraphPad Software Inc. , San Diego, USA)进行。显著差异使用非参数性 Mann Whitney 检验确定。P值< 0.05被认为是显著的。MM内皮细胞上的重组人类可溶性⑶146在体内和体外表现出趋化活性本发明人通过在非免疫缺陷小鼠中植入含有rh-s⑶146(0，lyg/μ 1)的三维 matrigel胶塞，研究了内皮细胞上rh_sCD146的趋化性质。因为rh_sCD146带有myc标签 (参见材料和方法)，因此使用c-myc肽(0，1μβ/μ1)作为对照分子。结果显示，在14天后，rh-sCD146 Matrigel胶塞与对照Matrigel胶塞相比含有多约100倍的细胞。这些细胞能够组织成血管样结构，并且它们大部分对CD31染色阳性，表明它们是内皮来源的(图
IA)。为了检查在填充有rh-s⑶146的matrigel胶塞中存在的不同细胞类型，使用 ⑶31、⑶45、⑶34、α-SMA、CD117和M0MA-2进行染色。图IB中呈现的结果显示，造血细胞 (CD45阳性)、单核细胞/巨噬细胞(M0MA-2阳性)、平滑肌细胞和/或周细胞(α -SMA阳性)和内皮细胞(⑶31阳性)可以被rh-s⑶146募集。在整合到血管样结构中的细胞中， 本发明人观察到了 CD34阳性细胞(造血干细胞和祖细胞/成熟内皮细胞的标志物)和被未分化标志物CD117染色的未成熟细胞。为了更好地对这些细胞进行表征，进行了共染色 (图1B)。结果显示，参与血管样结构的⑶31阳性细胞也是⑶146阳性的。有趣的是，血管样结构中存在的约10-15%的⑶31阳性或⑶146阳性细胞与未分化标志物⑶117共染色 (图1B)。最后，双标记⑶117+/⑶33-和⑶117+/⑶45-显示这些未分化细胞不是骨髓或造血来源的。本发明人在注射有人类EPC的裸鼠中进行了相同类型的matrigel胶塞实验(图
IB)。植入到裸鼠中并含有rh-sCD146(lyg/y 1)的Matrigel胶塞与对照胶塞相比能够调动大量细胞，正如已经在正常小鼠中观察到的(参见上文)。一部分这些细胞是人类EPC， 正如由抗人类CD31抗体的阳性标记所证实的，而在相同动物中的对照胶塞中没有观察到人类EPC。有趣的是，EPC还参与结构化血管的塑造(图1B)。在体外证实了 EPC上rh-s⑶146的趋化活性(图1C)。rh_s⑶146的趋化活性从 0增加到50ng/ml，然后保持在高达400ng/ml的平稳状态。使用50ng/ml rh_sCD146观察到的趋化效应与使用20ng/ml VEGF观察到的相似。在rh_s⑶146免疫贫化后，用c-myc肽或缓冲溶液处理的样品中不能检测到趋化活性。合在一起，这些结果证明了 rh-s⑶146能够调动成熟和未成熟内源内皮细胞和外部给药的EPC两者。这是分子的重要性质，因为EPC在血管发生和血管生成中发挥主要作用。
重组人类可溶性⑶146在体外增加内皮祖细胞(EPC)的血管生成能力本发明人检查了 rh-s⑶146对EPC的功能性质的影响。为此目的，他们评估了不同浓度的rh-sCD146对EPC管形成、迁移和增殖的影响，并将这些影响与血管生成细胞因子 VEGF的影响进行比较。在Matrigel胶塞模型中评估了毛细血管的形成，所述胶塞是基于层粘连蛋白的凝胶，其模拟细胞微环境并能够进行三维细胞组织化(图2A)。当将EPC接种到matrigel胶塞上时，发生内皮管的自发形成，管反过来形成毛细血管网。添加rh_s⑶146 增加了该网络的发生，正如通过管的数量(图2A)和长度(数据未显示)的增加所显示的。 在25至100ng/ml rh_sCD146之间，这种效应是剂量依赖性的。使用50ng/ml rh_sCD146 观察到的效应与使用20ng/ml VEGF观察到的相似。当细胞用对照c-myc肽或免疫贫化的 rh-s⑶146处理时，没有观察到效应。还评估了 rh-s⑶146对EPC增殖(图2B)和迁移(图 2C)的影响。在两种情况下，rh-s⑶146的影响是分子特异性的(rh_s⑶146免疫贫化后的缓冲液没有影响)和剂量依赖性的。在这些实验中，50ng/ml rh_s⑶146的影响也与使用 20ng/ml VEGF观察到的影响相似。因此，除了募集EPC之外，rh-s⑶146似乎能够通过增加它们的血管生成活性来活化这些细胞。EPC在Matrigel胶塞中的增殖、迁移和组织成血管样结构的能力，以与使用 VEGF时过观察到的非常相似的程度增加。自从R)lkman及同事在1971年的开创性工作以来，已经对几种血管生成生长因子的治疗潜力进行了广泛研究。在它们之中，VEGF已被反复显示出增加血管发生，并且已经试验了大量基于注射 VEGF 肽或编码 VEGF 的质粒 DNA 的治疗方法(Nomi M, Miyake H, Sugita Y, Fujisawa M，Soker S.生长因子和内皮细胞在治疗性血管发生和组织工程中的作用(Role of growth factors and endothelial cells in therapeutic angiogenesis and tissue engineering.)Curr Stem Cell Res Ther. 2006 ； 1 :333-43)。也已显示bFGF增加小动脉侧枝生长，并且实验表明了 VEGF与bFGF之间的相 51 ! ft (Stavri GT, Zachary IC, Baskerville PA, Martin JF, Erusalimsky JD. M 性成纤维细胞生长因子在血管平滑肌细胞中上调血管内皮生长因子的表达，与缺氧的 ttl、同才百互作用(Basic fibroblast growth factor upregulates the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells. Synergistic interaction with hypoxia.)Circulation. 1995 ；92(1) :11-4)。通过发展血管介导血管平滑肌细胞的募集的血管新生蛋白因子-1、促红细胞生成素(EPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)似乎也参与梗死的心肌中局部缺血后血管的侧枝形成(Vandervelde S, van Luyn MJ, Tio RA, Harmsen MC.干细胞介导的梗死心肌修复中白勺ilf号 1 专导 13子(Signaling factors in stem cell-mediated repair of infarcted myocardium), J Mol Cell Cardiol. 2005 ；39 (2) :363-76)。最后，已显示内皮一氧化氮合酶 e-N0S在缺血组织中表现出强的血管生成效应(Duda DG, Fukumura D，Jain RK.，eNOS在新生血管化中的作用用于内皮祖细胞的N0(Role of eNOS in neovascularization :N0 for endothelial progenitor cells.)Trends Mol Med. 2004 ; 10 :143-5)。现在，可溶形式的⑶146似乎作为一种新的非常相关的促血管生成生长因子， 正如由本发明人在本文中所证实的。事实上，本发明人的体外实验显示，使用50ng/mlrh-sCD146获得的效应与使用20ng/mlVEGF时所观察到的类似(图2)。因为rh-s⑶146和VEGF的效应非常相似，因此本发明人测试了它们的效应是否是累加的、协同的。为此，添加两种因子rh-sCD 146 50ng/ml和VEGF 20ng/ml进行了相同的实验(图5)。结果显示，两种分子对EPC增殖(图5A)、迁移(图5B)和在matrigel中形成毛细血管样结构的能力(图5C)的影响是累加的。为了进一步了解机制，它们在抗VEGFR2 抗体的存在下在matrigel中进行了附加的毛细血管形成实验。将这些抗体与一直用VEGF 和/或rh-s⑶146进行处理以完全阻断VEGFR2的细胞温育，或与细胞进行预温育，然后清洗抗体并用rh-s⑶146加VEGF进一步处理。该后一种条件允许在刺激之前阻断存在于膜上的VEGFR2，但是rh-sCD146最终没有诱导VEGFR2。结果(图5C)显示，抗VEGFR2抗体1/在对照条件下没有效应，2/完全阻断VEGF 的效应，并且3/部分阻断rh-s⑶146的效应。当在抗体存在下添加rh-s⑶146和VEGF时， 与没有抗体的条件相比毛细血管样结构的数量减少，并且管的数量与抗VEGFR2抗体存在下使用rh-sCD146所观察到的相近。最后，当将细胞与抗VEGFR2抗体预温育，然后清洗抗体并用rh-s⑶146和VEGF进一步刺激时，毛细血管样结构的数量与前述条件下相比明显更高，表明rh-sCD146在细胞表面诱导了新的VEGFR2。合在一起，这些实验表明rh_sCD146响应主要参与SCD146特异性途径，但是在较少程度上也通过在细胞表面诱导新的VEGFR2来参与VEGF信号传导途径。还进行了实验以测试rh-sCD146处理是否改变VEGF分泌。用50ng/ml rh_sCD146 处理M小时的EPC与未处理过的EPC相比，显示出VEGF分泌的统计学显著的增加 (71. 8+/-6. 1 比 54. 8+/-3. 2pg/ml, η = 6 ;p < 0. 05)。重组人类⑶146在内皮祖细胞中诱导前血管生成基因的转录本发明人假设，在EPC上观察到的rh-s⑶146的功能效应可能部分依赖于基因转录。为了检验这个假说，他们使用特异性针对血管生成基因的寡核苷酸阵列监测了用 rh-s⑶146处理EPC后基因表达的变化。在113个被探测的基因(参见方法)中，一些被上调，其他被下调或没有改变。在被上调的基因中，他们选择了在用50ng/ml rh_s⑶146处理 3小时的EPC中可重复地上调了至少5倍的4个基因。它们包括eNOS、VEGF受体2 (KDR)、 基质金属肽酶MMP-2和血纤维溶酶原激活剂尿激酶(PLAU/u-Pa)(图；3)。在用50ng/ml rh_sCD146处理EPC后这些基因表达的变化通过qPCR和^festern印迹分析进行了验证。 qPCR实验显示，在用50ng/ml rh_s⑶146处理3小时后，所有四个基因的mRNA有效地、显著地增加(图3A)。在蛋白质水平上，在处理后1小时eNOS和u_Pa的表达明显增加，而在处理后3小时观察到了 KDR和MMP-2的增加(图和3C)。增加的蛋白表达维持了 M小时。因此，rh-s⑶146的一种主要效应是增加几种前血管生成蛋白的转录和翻译。在本研究中被rh-sCD146上调的蛋白似乎在血管发生过程中是特别重要的。具体来说，在血管生成期间或肿瘤血管发生期间，KDR的活性急剧增加。它通过诱导几种蛋白例如uPA、uPAR和一些MMP的表达作用于内皮细胞。在我们的研究中被 rh-sCD146诱导的两种其他蛋白是u_PA和MMP-2。它们属于蛋白水解复合物，其在迁移和细胞增殖期间促进基膜和细胞外基质的降解。它们参与生理性和肿瘤性血管发生两者。有趣的是，⑶146的活性通常显得与MMP-2的活性偶联。事实上，已经显示，通过抗MUC18抗体治疗黑素瘤降低了 HUVEC在体外定植于Matrigel胶塞的能力，并且这与MMP-2的胶原酶活性降低相关。eNOS是另一种rh_s⑶146诱导的蛋白，其也似乎在血管发生中发挥关键作用。 eNOS在干细胞调动中的作用似乎是必需的。用eNOS合酶转录增强剂AVE9488对源自于患有缺血性心肌病的患者的骨髓单核细胞进行预处理，能够恢复这些祖细胞诱导新生血管化的能力。局部注射重组人类可溶性⑶146在大鼠局部缺血后肢模型中增加新生血管化根据rh-sCD146的体外和体内性质，本发明人测试了它在大鼠后肢局部缺血的体内模型中的潜在治疗效果。图4A中给出的结果显示，在用10 μ g rh-s⑶146/天处理局部缺血后肢5天后，在开始局部缺血后5天，与用c-myc肽处理的对照动物相比，动物的自断离水平显著降低。相反，在开始局部缺血后10天或20天的处理组之间，它没有显著差异。 激光多普勒组织成像显示，在第一天时，左侧股总动脉的阻塞使血液灌注降低了约90%。在第5天时，与对照组相比，用rh-s⑶146处理显著增加了血液灌注速率，但是在第10和20天时，在两个组之间没有观察到血流的进一步显著变化。当用同样剂量的rh-s⑶146(10yg/ day)处理动物，但是处理更长的时间(12天)时，在第5、10和20天时，与对照大鼠相比，现在自断离水平显著降低。在这些条件下，从第5至第20天，血液灌注速率也显著增加，在第 20天时达到相同动物的对照腿中血液灌注速率的约60% (图4A)。20天后肌肉切片的组织化学检查显示出在没有用rh-sCD146处理的局部缺血后肢中存在炎症、钙化、纤维变性区域和大量坏死的肌纤维(图4B)。相反，在用rh-sCD146处理12天的局部缺血后肢中，几乎没有观察到纤维变性，炎症和坏死的肌纤维大量减少(图4B和图4C)。毛细血管的检查显示，与对照局部缺血肢相比，它们的数量显著增加，并且肌肉状况显著改善，大部分肌纤维完整(图4B和图4C)。有趣和有利的是，本发明人还观察到了 rh-sCD146对断肢愈合的营养效应(数据未显示)。因为在体内，在含有rh-s⑶146 Wmatrigel胶塞中观察到了参与血管样结构的CD117/CD146阳性内皮前体细胞(参见图1B)，本发明人测试了在局部缺血后的大鼠肌肉中是否也能检测到这样的细胞。为此，本发明人在开始处理后两天分析了用或未用 rh-s⑶146处理过的具有后肢局部缺血的大鼠的肌肉，以便检测早期事件。结果显示，可以在rh-s⑶146处理过的动物中检测到⑶117/⑶146阳性细胞，而在对照大鼠中没有发现这些细胞(图4D)。Mrk体内matrigel胶塞实验显示，s⑶146在不同细胞类型上显示出趋化活性，这包括内皮细胞，正如由它们插入到血管样结构中以及它们对内皮标志物例如⑶34、⑶146或 ⑶31的阳性染色所证实的(这些细胞的双重染色显示它们是⑶33和⑶45阴性的，表明它们不是骨髓或造血来源的)，以及造血细胞例如单核细胞、平滑肌细胞和/或周细胞。这些实验进一步显示出SCD146能够募集外源注射的晚期内皮祖细胞(EPC)，在本文中也称为 EPDC0募集的内皮细胞参与血管样结构的形成。在体外，s⑶146增强EPC的血管生成性质，具有增加的细胞迁移、增殖和建立毛细血管样结构的能力。到目前为止，可溶性CD146的受体仍然未知。膜CD146不是该受体，因为在两种分子之间还没有亲同种相互作用的证据。具体来说，观察到的效应是与VEGF的效应累加的。s⑶146增强VEGFR2的表达和 VEGF的分泌。与促血管生成前体的功能相一致，s⑶146刺激的EPC的基因表达情况分析具体揭示了 eNOS、uPa、MMP2和VEGFR2的上调。膜结合⑶146的沉默抑制了这些响应。在后肢局部缺血模型中测试了 s⑶146的潜在治疗价值。本发明证实，局部注射 SCD146显著减少自断离、组织坏死、纤维变性、炎症并增加血流。在本文中确立了在肢体局部缺血模型中s⑶146显示出趋化和血管生成性质，并促进有效的新生血管化。因此，重组人类SCD146支持了在局部缺血疾病和障碍中用于治疗性血管发生的新策略。控制s⑶146的有利效应的完整机制是未知并有待确定的，但是可能涉及几条途径。SCD146能够作用于局部内皮驻留细胞和/或单核细胞浸润，因为本发明人证明了在体内对matrigel胶塞中的单核细胞的趋化效应(Bardin N, Blot-Chabaud M, Despoix N等， CD146及其可溶形式调控单核细胞跨内皮迁移(CD146 and its soluble form regulate monocyte transendothelial migration.)Arterioscler. Thromb Vasc Biol. 2009 ；29 746-53)。可选地或此外，s⑶146可能通过将内皮祖细胞募集到新生血管化区域而在血管生成中发挥作用。与该后一种假说相一致，表现出晚期内皮祖细胞特征的细胞被募集到 matrigel胶塞中，并组织成血管样结构。此外，在用s⑶146处理两天后的肌肉切片中，可以观察到未成熟内皮细胞。实施例2 根据活的人类皮肤外植体上的皮肤愈合动力学研究有效成分的愈合活性本研究的目的是根据由UVB辐照在活的皮肤外植体上诱导的表皮和真皮损伤的愈合动力学证实SCD146的活性。该活性通过观察普通形态学并通过纤连蛋白和整合蛋白 β4的特异性免疫标记物来评估。操作方法外植体的制备制备了来自于42岁女性的腹部整形术(Ρ718ΑΒ42)的三十个外植体，并将其在 BIO-EC外植体培养基(BEM)中保持存活。将外植体在各含有ImL BEM的12孔培养板中如下所述分成两批9个外植体和两批6个外植体
权利要求
1.一种人类可溶性⑶146蛋白，其含有552至558个氨基酸。
2.权利要求1的蛋白，其包含由选自SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的序列构成的氨基酸序列。
3.一种组合物，其包含权利要求1或2的蛋白和可药用载体。
4.权利要求3的组合物，其还包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-I(SDF-I)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、白介素-8(IL-8)的血管生成因子及其混合物。
5.权利要求3或4的组合物，其还包含内皮祖细胞(EPC)，优选为已经与人类可溶性 ⑶146蛋白接触过的细胞。
6.权利要求5的组合物，其中内皮祖细胞是包含表达权利要求2的可溶性CD146蛋白或SEQ ID NO 9的人类短⑶146蛋白的核酸构建物的重组细胞。
7.权利要求6的组合物，其中载体是质粒。
8.一种单克隆抗体，其选择性结合权利要求2的蛋白。
9.一种组合物，其包含权利要求8的抗体和可药用载体。
10.权利要求1至2任一项的蛋白或权利要求3至7任一项的组合物，用于治疗引起哺乳动物组织局部缺血的疾病或障碍。
11.权利要求1至2任一项的蛋白或权利要求3至7任一项的组合物，用于预防哺乳动物局部缺血。
12.权利要求1至2任一项的蛋白或权利要求3至7任一项的组合物，用于哺乳动物上皮的瘢痕形成。
13.权利要求1至2任一项的蛋白或权利要求3至7任一项的组合物，用于预防哺乳动物焦痂或用于哺乳动物皮肤移植的情形中。
14.权利要求1至2任一项的蛋白或权利要求3至7任一项的组合物改进瘢痕的美观性的应用。
15.权利要求1至2任一项的蛋白离体制备能够刺激人体血管发生的成熟或未成熟内皮细胞的应用。
16.权利要求8的单克隆抗体或权利要求9的组合物用于治疗哺乳动物以不希望的过度新生血管化、不希望的血管通透性和/或CD146受体的过度活化为特征的疾病或障碍的应用。
17.一种核酸分子，其编码权利要求1至2任一项的蛋白。
全文摘要
本发明涉及用于在体内、离体或体外调节血管发生的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及可用于人类治疗情形中的可溶性CD146蛋白以及相应的抗体。本发明描述的特定形式的CD146，可用于在体内或离体带动成熟和未成熟内皮细胞两者，以及增加它们对血管发生的影响。本发明还涉及包含这些化合物的组合物，特别是药物或诊断组合物，包括试剂盒等，以及使用所述化合物、组合物和细胞的治疗或诊断方法。
文档编号C12N5/071GK102300983SQ201080006283
公开日2011年12月28日 申请日期2010年1月29日 优先权日2009年1月30日
发明者卡里姆·哈尔霍里, 弗兰克斯·迪格纳特-乔治, 本杰明·吉列特, 纳萨莉·巴丁, 马塞尔·布罗特-查宝德 申请人:地中海大学, 法国国家卫生及研究医学协会