专利名称：能够产生聚乳酸或聚乳酸共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌和使用其制备聚乳酸或聚乳酸 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)和使用该重组富氧罗尔斯通氏菌制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。
背景技术：
聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解的聚合物，其非常适用于一般用途或医学聚合物的合成。目前，由微生物发酵制得的乳酸酯的聚合法是一种合成PLA 的方法。但是，这种乳酸酯的直接聚合只能制备具有低分子量(1000 5000道尔顿)的 PLA。具有100，000道尔顿或高于100，000道尔顿分子量的PLA可以使用链偶联剂由乳酸酯的直接聚合制得的较小PLA分子聚合得到。但是，该方法由于难以除去的溶剂或链偶联剂的加入而给该工艺带来了一些复杂化。最广泛使用的制备高分子量PLA的方法包括将乳酸酯转化为丙交酯和使用丙交酯环的开环加成聚合反应来合成PLA。当由乳酸酯合成PLA时，制备PLA均聚物是容易的。但是，具有多种单体组成的 PLA共聚物难以合成，且在商业上非常没有效果。聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种在碳过量但如磷、氮、镁和氧的其它营养物缺乏时在微生物中用作能量或碳储存分子的聚酯。由于PHA与来源于石油的常规合成聚合物的相似性和其完全的生物可降解性，所以PHA被公认作为常规合成塑料的替代品。为了由微生物制备PHA，必须提供将微生物的代谢产物转化为PHA单体的酶和然后由PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。为了使用微生物合成PLA和PLA共聚物，需要如上所述的体系，以及一种能够提供乳酰辅酶A(Iactyl-CoA)和羟酰辅酶A的酶，该酶最初是用于PHA合酶的底物。此外，为了经济地制备生物可降解的聚合物，在细胞中有效地累积PLA和PLA共聚物是至关重要的。特别是，需要通过高浓度培养制备高浓度的PLA和PLA共聚物。因此，需要允许有效制备适合上述条件的重组微生物的技术。
发明内容
技术问题本发明的目的是开发一种能够产生高浓度聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌(R. eutropha)和一种使用该重组富氧罗尔斯通氏菌制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。技术方案本发明的一个方面是一种能够产生高浓度聚乳酸酯聚合物或共聚物的富氧罗尔斯通氏菌重组菌株和一种使用该菌株制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。
本发明人成功地使用源自丙酸梭菌(Clostridium propionicum(C. propionicum))的丙酰辅酶A转移酶(其产生乳酰辅酶Α)和源自假单胞菌 6-19 (Pseudomonas sp. 6-19)的使用新合成的乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯合酶的突变体(第10-2006-0116234号韩国专利申请)来合成聚乳酸酯聚合物和共聚物。此外，为了经济地制备生物可降解的聚合物，本发明人想要制备能够有效产生聚乳酸酯聚合物的富氧罗尔斯通氏菌的重组菌株。为了该目的，本发明人制备了具有失去 PHA生产能力的重组富氧罗尔斯通氏菌，和转化的重组富氧罗尔斯通氏菌，该转化的重组富氧罗尔斯通氏菌通过如下步骤得到用表达源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶和假单胞菌 6-19的聚羟基链烷酸酯合酶的质粒转化重组富氧罗尔斯通氏菌，或者将表达源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的基因和表达假单胞菌6-19的聚羟基链烷酸酯合酶的基因引入到具有失去PHA生产能力的重组富氧罗尔斯通氏菌中。本发明人发现使用如上制得的重组富氧罗尔斯通氏菌可以由葡萄糖有效地制备聚乳酸酯聚合物和共聚物。这带来了本发明。有益效果 本发明包括一种能够有效地产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的富氧罗尔斯通氏菌(R.eutr0pha)的重组菌株和一种通过培养该菌株制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法。附图简述
图1和2说明制备一种包含源自假单胞菌6-19的聚羟基链烷酸酯合酶的突变基因、源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变基因和源自富氧罗尔斯通氏菌的phaAB基因的重组表达载体的过程。图3说明大肠杆菌S17-1 (Escherichia coli S17-1)与富氧罗尔斯通氏菌之间的交配和将目的基因插入到富氧罗尔斯通氏菌染色体中以制备重组富氧罗尔斯通氏菌的过程。
具体实施例方式本发明提供一种可以产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的富氧罗尔斯通氏菌的重组菌株，从而去除野生型富氧罗尔斯通氏菌的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物合成基因操纵子，并引入将外来乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因和底物是乳酰辅酶A的 PHA合酶的基因。在本发明中，将乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因可以是丙酰辅酶A转移酶 (pet)的基因。在一个具体的实施方案中，上述pet基因可以源自丙酸梭菌。 在本发明中，上述pet基因可以是编码具有相等或更优异的乳酰辅酶A生产活性的丙酰辅酶A转移酶的突变形式。 在一个具体的实施方案中，所述pet基因可以具有下列核苷酸序列SEQID NO 1 的核苷酸序列(cp-pct)；含有A1200G突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct512)；含有 T78C、T669C、A1125G和 T1158C 突变的 SEQ ID NO :1 的核苷酸序列(cppct522)；含有 A1200G 突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct531)，该核苷酸序列(cppct531)的相应氨基酸序列含有Gly335Asp突变；含有A1200G突变的SEQ ID NO 1的核苷酸序列(cppct532)，该核苷酸序列(cppct532)的相应氨基酸序列含有Ala243Thr突变；含有T669C、A1125G和 T1158C突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct533)，该核苷酸序列(cppct533)的相应氨基酸序列含有Asp65Gly突变；含有A1200G突变的SEQ ID NO 1的核苷酸序列(cppct534)， 该核苷酸序列(cppct534)的相应氨基酸序列含有Asp257Asn突变；含有T669C、A1125G和 T1158C突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct535)，该核苷酸序列(cppct535)的相应氨基酸序列含有Asp65Asn突变；含有T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID N0:1的核苷酸序列(cppct537)，该核苷酸序列(cppct537)的相应氨基酸序列含有Thrl99Ile突变； 和含有 T78C、T669C、A1125G 和 T1158C 突变的 SEQ ID N0:1 的核苷酸序列(cppct540)，该核苷酸序列(cppct540)的相应氨基酸序列含有Vall93Ala突变。
pet基因突变体可以由第10-2007-0081855号韩国专利申请所公开的方法制备。 在一个具体的实施方案中，Pct基因优选具有含有T78C、T669C、A1125G和T1158C突变的 SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct540)，该核苷酸序列(cppct540)的相应氨基酸序列含有 Vall93Ala 突变。同时，在本发明中，使用乳酰辅酶A作为其底物的PHA合酶的基因可以是假单胞菌 6-19的PHA合酶基因。在本发明中，使用乳酰辅酶A作为其底物的PHA合酶的基因包括编码具有相等或更优异的PHA合成能力的PHA合酶的突变体。在一个具体的实施方案中，使用乳酰辅酶A作为其底物的PHA合酶的基因可以具有但不限于对应于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的核苷酸序列，或者对应于具有至少一个下列突变的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的核苷酸序列:E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、 S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K 和 Q481R。编码使用乳酰辅酶A作为其底物的PHA合酶的基因的突变可以采用第 10-2008-0068607号韩国专利申请所公开的方法进行。在一个具体的实施方案中，PHA 合酶基因具有对应于选自以下氨基酸序列中的至少一个氨基酸序列的核苷酸序列含有 E130D、S325T、L412M、S477G 和 Q481M 突变的 SEQID NO :2 的氨基酸序列(C1335)；含有 E130D、S477F 和 Q481K 突变的 SEQ IDNO 2 的氨基酸序列(C1310)；和含有 E130D、S477F 和 Q481R突变的SEQ IDNO 2的氨基酸序列(C1312)。在本发明中，富氧罗尔斯通氏菌的重组菌株可以进一步包括编码3HB_CoA合酶的基因。即使在培养基中不存在羟基链烷酸酯时，该编码3HB-CoA合酶的基因也能制备具有高摩尔分数的羟基链烷酸酯的羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物。在一个具体的实施方案中，所述编码3HB_CoA合酶的基因可以包括酮硫解酶基因和乙酰乙酰辅酶Abcetoacetyl-CoA)还原酶基因，这两种基因均可以由富氧罗尔斯通氏菌得到，但不限于此。在本发明中，重组富氧罗尔斯通氏菌可以另外包括PhaG基因。在一个具体的实施方案中，上述PhaG基因可以由恶臭假单胞菌KT2440 (P. Putida KT2440)得到。当重组富氧罗尔斯通氏菌中还包括PhaG基因时，该重组富氧罗尔斯通氏菌变得能够制备MCL的羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。编码将乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因、使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因、编码3HB-CoA合酶的基因和/或重组富氧罗尔斯通氏菌的PhaG基因的引入可以按照现有技术中提到的常规方法来进行。例如，所述方法可以包括制备包含编码将乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因和/或使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因的载体， 和转化富氧罗尔斯通氏菌，其中从重组载体中除去野生型PHA合酶操纵子。 术语“载体”是指一种DNA构件(DNA construct)，该DNA构件含有DNA序列，该 DNA序列可操作地连接至能够在适合的宿主内表达DNA的控制序列。在本发明中，所述载体可以是质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体或酵母人工染色体(YAC)载体，而通常使用质粒载体。例如，本发明所用的典型质粒载体可以具有(a)用于每个宿主细胞有效复制为几百个质粒载体的复制起点，(b)用于筛选质粒载体转化了的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(C) 其中可插入外源DNA片段的限制性内切酶酶切位点。即使没有合适的限制性内切酶酶切位点，该载体也可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸接头或连接体容易地与外源DNA连接。如现有技术所示，为了提高转化基因的表达，可以将相应基因可操作地连接至在选定的表达宿主中参与转录和翻译的表达控制序列。优选地，表达控制序列和相应基因包括在含有细菌选择性标记和复制起点的单个表达载体中。当表达宿主是真核细胞时，该表达载体应进一步包括有用的表达标记。术语“表达控制序列”是指对可操作地连接的编码序列在特定宿主中表达必要的 DNA序列。所述控制序列包括用于启动转录的启动子、用于控制转录的随机操纵基因序列、 用于编码适合的mRNA核糖体结合位点(RBS)的序列和用于控制转录和翻译的终止的序列。 例如，适合于原核生物细胞的控制序列包括启动子、随机操纵基因序列和mRNA RBS。适合于真核生物细胞的控制序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。启动子是影响基因在质粒中表达的最关键的因素。因此，可以使用高表达启动子，例如SRa启动子或源自巨噬细胞病毒的启动子。为了使用本发明表达DNA序列，各种表达控制序列中的任一种可以用于载体中。 可用的表达控制序列的实例包括SV40或腺病毒的早期和后期启动子、Iac系统、trp系统、 TAC系统、TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fD外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶基因的启动子或不同糖酵解酶基因的启动子、磷酸酶基因的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配体系的启动子、具有已知用于控制原核或真核细胞或其病毒的表达的结构或衍生物的其它序列和上述的各种组合。当核酸和核苷酸序列处于功能关系时，核酸会与核苷酸序列“可操作地连接”。适当的分子(例如转录激活蛋白)可以是以能够使基因表达的这种方式连接的基因和控制序列的产物。例如，当编码前序列或分泌性前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时，其与编码多肽的DNA可操作地连接；影响编码序列的转录的启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接；以及影响编码序列的转录或翻译的PBS与所述编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指被连接在一起的DNA序列是连续的。具体而言，对于分泌性前导，“可操作地连接”是指DNA序列是连续的并且在阅读框中。但是，增强子不必接触编码序列。序列之间的连接可以通过在方便的限制性内切酶位点处的连接来进行。但是，在没有限制性内切酶位点的情况下，根据常规方法可以使用合成的寡核苷酸接头或连接体。应注意，不是所有的载体和表达控制序列在表达根据本发明的DNA序列中发挥同等的作用。类似地，不是所有的宿主在相同的表达系统中发挥同等的作用。但是，本领域技术人员在不偏离本发明的范围或不增加实验误差的情况下，能够在各种载体、表达控制序列和宿主中进行选择。例如，选择载体必须考虑宿主。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和由相应载体编码的其它蛋白(例如抗生素标记)的表达。考虑上述变量， 本领域技术人员能够确定载体、表达控制序列和宿主的适合组合。
本发明还提供一种制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法，包括 在含有碳源和乳酸酯的培养基或含有碳源、乳酸酯和羟基链烷酸酯的培养基中培养重组富氧罗尔斯通氏菌，和从重组富氧罗尔斯通氏菌中回收聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。例如，当在含有葡萄糖的培养基或含有葡萄糖和羟基链烷酸酯的培养基中培养重组富氧罗尔斯通氏菌时，重组富氧罗尔斯通氏菌将分别产生聚乳酸酯或者羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物。但是，当重组富氧罗尔斯通氏菌表达编码3HB-CoA合酶的基因时，即使培养基缺乏羟基链烷酸酯，也可以以高摩尔分数的羟基链烷酸酯制备羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物。当重组富氧罗尔斯通氏菌表达PhaG时，可以制备MCL的羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。所述羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物可以包括但不限于聚(3HA-CO-LA) (poly(3HA-co-LA))、聚(3HB-co_LA) (poly (3HB-co_LA))、聚(3HP-co_LA) (poly (3HP-co-LA))、聚(3HB-co-4HB-co_LA) (poIy(3HB-co-4HB-co_LA))、 聚(3HP-co-4HB-co-LA)(poly(3HP-co-4HB-co-LA))、聚(3HB-co-3HV-co_LA) (poly (3HB-co-3HV-co-LA)),聚(4HB-co-LA-co_3HP)(poly(4HB-co-LA-co_3HP))和聚 (MCL 3-HA-co-LA)(poly(MCL 3-HA-co_LA))。特别地，羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物收率可以随着培养基中含有的羟基链烷酸酯的类型而变化。根据本发明，用于合成羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的羟基链烷酸酯底物可以选自3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、含有6 14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、 3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、 6-羟基十二烷酸、3-羟基戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、 3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-6-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-7-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-5， 8-顺式-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸甲酯、3-羟基己二酸甲酯、3-羟基辛二酸甲酯、3-羟基壬二酸甲酯、3-羟基癸二酸甲酯、3-羟基辛二酸乙酯、3-羟基癸二酸乙酯、3-羟基庚二酸丙酯、3-羟基癸二酸苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、 对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12- 二羟基十二烷酸、3，8- 二羟基-5-顺式_十四碳烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9环氧_5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2- 丁烯酸、6-羟基-3-十二碳烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基2，6- 二甲基庚烯酸中的至少一种。本 发明提供一种使用富氧罗尔斯通氏菌的重组菌株制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的新方法。本文公开了本发明的示例性实施方案。尽管采用了特定术语，但是它们应仅以通常和描述性含义来解释，而不应为了限制性的目的来解释。因此，本领域技术人员应理解， 在不偏离下文权利要求中阐述的本发明精神和范围的情况下各种形式和细节的变化是可能的。[实施例]<实施例1>具有失去PHA生产能力的富氧罗尔斯通氏菌的制备为了除去富氧罗尔斯通氏菌(R.eUtr0pha)中参与聚(3_羟基丁酸酯)[P (3HB)] 合成的PHA生物合成基因操纵子，如下制备重组载体。用BamHI/EcoRI 从 pSYL105 载体(Lee 等人，Biotech. Bioeng.，1994，44 1337-1347)酶切含有源自富氧罗尔斯通氏菌H16的产生PHB的操纵子的DNA片段，并插入到 pBluescript II (Stratagene)的 BamHI/EcoRI 识别位点，从而制得 pReCAB 重组载体。在PHB操纵子启动子作用下，PHA合酶(phaCKE)和单体供应酶(phaAKE&phaBKE)在 PReCAB载体中不断表达。已知该载体也可以在大肠杆菌(E.coli)中有效地操作(Lee等人，Biotech. Bioeng.，1994,44 :1337_1347)。用 BstBI/Ndel 酶切新的 pReCAB 载体以除去编码富氧罗尔斯通氏菌H16PHA合酶(phaCKE)、b-酮硫解酶(phaAKE)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaBKE)的基因。然后将通过PCR由pEGFP质粒(BD Biosciences Clontech)扩增的 GFP基因插入到载体(pACAB-GFP)中。EGFP_F_BstBI aaaaattcgaaac aggaaacagaat atggtgagcaag(SEQ ID NO 3)EGFP_R_NdeI ggaattcCATATGttacttgtacagctcgtcca(SEQ ID NO 4)接下来用BamHI/XhoI酶切ρ Δ CAB-GFP载体，从而制得以5’方向连接了富氧罗尔斯通氏菌PHA合酶启动子和以3’方向连接了转录终止子基因的基因片段。将上述基因片段插入到用 BamHI/Sall 酶切的 pK18mobSacB 载体(Schafer 等人 Gene (1994) 145 :69_73) 中，从而制得ρΚ18-Δ CAB-GFP载体。因为pK18mobSacB载体可以表达sacB，所以使用蔗糖通过将外源基因插入到染色体中而制得重组微生物。在将ρΚ18-Δ CAB-GFP载体转化至大肠杆菌S17-1之后，该 S17-1 (pK18-ACAB-GFP)在含有25mg/l卡那霉素的LB液体培养基中在37 °C下培养24 小时。富氧罗尔斯通氏菌NCIMB11599也在LB液体培养基中在30°C下培养24小时。将这些培养溶液彼此混合，以具有3 1的S17-l(pK18-ACAB-GFP)与富氧罗尔斯通氏菌 NCIMBl 1599体积比，并以100 μ 1逐滴加入到LB固体培养基。得到的平板在静态培养箱中在 30°C下培养18小时。在培养期间，发生了交配，其中S17-1的ρΚ18-Δ CAB-GFP载体转移至富氧罗尔斯通氏菌，从而如图3所示，导致富氧罗尔斯通氏菌的染色体DNA的同源位点处第一交叉。因为PK18- Δ CAB-GFP无法在富氧罗尔斯通氏菌中复制，所以当ρΚ18_ Δ CAB-GFP 通过基因之间的第一交叉正常插入到富氧罗尔斯通氏菌的染色体中时，富氧罗尔斯通氏菌对含有500mg/L卡那霉素的平板表现出抗性。通过如下步骤选择ρΚ18-Δ CAB-GFP通过第一交叉插入到富氧罗尔斯通氏菌的染色体中的菌落将在LB平板中交配的细胞悬浮在LB液体培养基中，以及将该悬浮液涂布在含有500mg/L卡那霉素和35mg/l氯霉素的平板上。对于第二交叉，将已完成第一交叉的重组富氧罗尔斯通氏菌在LB液体培养基中在30°C下培养24小时，然后将100 μ 1培养溶液涂布在含有70g/L蔗糖的LB平板上。通过PCR选择通过sacB基因发生第二交叉的富氧罗尔斯通氏菌作为重组富氧罗尔斯通氏菌(见图3)。第二交叉正常完成后，重组富氧罗尔斯通氏菌失去PHA生物合成操纵子(phaCAB)，但GFP基因保留在染色体中。通过菌落PCR，发现了 GFP正常插入到染色体中的重组富氧罗尔斯通氏菌，并称为富氧罗尔斯通氏菌GFP。<实施例2>插入有来自假单胞菌6-19 (KCTC 11027BP)的PHA合酶和来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CPPCT)的重组富氧罗尔斯通氏菌的制备用BamHI/Nde I酶切实施例1中制得的ρΚ18_ Δ CAB-GFP载体以除去GFP，并将用BamHI/Ndel酶切pPs619C1335CPPCT540载体得到的基因片段插入其中，从而制备 ρΚ18- Δ CAB-335540载体。通过使用上述载体，制得重 组富氧罗尔斯通氏菌335540，其中除去了 phaCAB且将来自假单胞菌6-19 (KCTC 11027BP)的phaClPs6_19335和来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CPPCT540)插入到染色体中(见表1)。使用大肠杆菌S17-1按照与实施例1相同的方式进行制备过程(见图3)。[表 1]
重组富氧罗尔斯通氏菌本文所用的重组质粒
富氧罗尔斯通氏菌NCIMBl 1599 富氧罗尔斯通氏菌GFPρΚ18- Δ CAB-GFP
富氧罗尔斯通氏菌335540ρΚ18- Δ CAB-335540
富氧罗尔斯通氏菌335ReABρΚ18- Δ CAB-335ReAB
富氧罗尔斯通氏菌 310540ReAB pK18-八 CAB-310540ReAB 富氧罗尔斯通氏菌 312540ReAB pK18-八 CAB-312540ReAB<实施例3>插入有来自假单胞菌6-19 (KCTC 11027BP)的PHA合酶和来自富氧罗尔斯通氏菌H16的酮硫解酶(phaAKE)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaBKE)的重组富氧罗尔斯通氏菌的制备用BamHI/Ndel酶切实施例1中制得的ρΚ18_ Δ CAB-GFP载体以除去GFP， 并将用BamHI/Ndel酶切PPs619C1335ReAB载体得到的基因片段插入其中，从而制备 ρΚ18- Δ CAB-335ReAB载体。通过使用上述载体，制得重组富氧罗尔斯通氏菌335ReAB，其中除去了 phaCAB且将来自假单胞菌6-19 (KCTC 11027BP)的phaClPs6_19335和来自富氧罗尔斯通氏菌H16的PHB单体供应酶(phaAKE & phaBKE)插入到染色体中(见表1)。使用大肠杆菌S17-1按照与实施例1相同的方式进行制备过程(见图3)。〈实施例4>插入有来自假单胞菌6-19(KCTC11027BP)的PHA合酶、来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CPPCT)和来自富氧罗尔斯通氏菌H16的酮硫解酶(phaAKE)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaBKE)的重组富氧罗尔斯通氏菌的制备
用BamHI/Nde I酶切实施例1中制得的pK 18_ Δ CAB-GFP载体以除去GFP，并将用 BamHI/Ndel 酶切 pPs619C1310CPPCT540ReAB 和 pPs619C1312CPPCT540ReAB 载体得至Ij 的基因片段插入其中，从而分别制备pK18-ACAB-310540ReAB和ρΚ18_ Δ CAB_312540ReAB 载体。通过使用上述载体，制得重组富氧罗尔斯通氏菌310540ReAB和富氧罗尔斯通氏菌312540ReABphaCAB,其中除去了 phaCAB且将来自假单胞菌6-19 (KCTC11027BP)的 phaClPs6_19310或phaClPs6_19312、来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CPPCT540)和来自富氧罗尔斯通氏菌H16的PHB单体供应酶(phaAKE &phaBEE)插入到染色体中(见表1)。使用大肠杆菌S17-1按照与实施例1相同的方式进行制备过程(见图3)。<实施例5>通过培养重组富氧罗尔斯通氏菌生物合成P (3HB-co-LA)共聚物表1中所示的重组富氧罗尔斯通氏菌在含有葡萄糖作为基本底物和34μ g/mL氯霉素的基本培养基中培养，引起P(3HB-co-LA)共聚物的生物合成。基本培养基的组成如下，每 L :ΚΗ2Ρ04，2· 65g ；Na2HPO4, 3. 8g ；NH4Cl, 0. 72g ；MgS047H20,0. 4g ；示踪剂，ImL0 此外，示踪剂的组成如下，每 L =FeSO4 · 7H20，IOg ；ZnSO4 · 7H20，2. 25g ；CuSO4 · 5H20，Ig ；MnSO4 · 5H20， 0. 5g ；CaCl2 .2H20，2g ；Na2B4O7 ·7Η20，0· 23g ； (NH4)6Mo7O24jO. Ig ；35% HCl, IOmL0 在主要培养前，在含有抗生素的LB培养基中进行种菌培养30小时。将上述种菌培养溶液接种到含有底物和抗生素的基本培养基中，以具有的浓度进行4天的主要培养。所有的培养在30°C、 200rpm的速度下进行。培养完成后，通过离心收集细胞裂解物。收集的细胞裂解物在干燥器中在80°C下干燥48小时，通过气相色谱法分析，测量细胞裂解物中所累积的P (3HB-co-LA) 共聚物的含量。结果示于表2中。分析中所用的参比物质是P(3HB-C0-12m0l% 3HV)共聚物和PLA聚合物。[表2]通过培养重组富氧罗尔斯通氏菌生物合成P(3HB-co-LA)共聚物
权利要求
1.一种能够产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌 (R. eutropha)，其中，去除了野生型富氧罗尔斯通氏菌的聚羟基链烷酸酯(PHA)生物合成基因操纵子，并引入了将乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述将乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因是丙酰辅酶A转移酶(pet)基因。
3.根据权利要求2所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述pet基因源自丙酸梭菌。
4.根据权利要求2所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述pet基因具有与选自以下中的一个序列对应的核苷酸序列SEQ ID NO 1的核苷酸序列(cp-pct)；含有A1200G突变的SEQ ID NO 1的核苷酸序列(cppct512)；含有 T78C、T669C、A1125G 和 T1158C 突变的 SEQ ID NO :1 的核苷酸序列(cppct522)； 含有A1200G突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct531)，该核苷酸序列(cppct531) 的相应氨基酸序列含有Gly335Asp突变；含有A1200G突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct532)，该核苷酸序列(cppct532) 的相应氨基酸序列含有Ala243Thr突变；含有T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct533)，该核苷酸序列(cppct533)的相应氨基酸序列含有Asp65Gly突变；含有A1200G突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct534)，该核苷酸序列(cppct534) 的相应氨基酸序列含有Asp257Asn突变；含有T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct535)，该核苷酸序列(cppct535)的相应氨基酸序列含有Asp65Asn突变；含有T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID NO :1的核苷酸序列(cppct537)，该核苷酸序列(cppct537)的相应氨基酸序列含有Thrl99Ile突变；和含有 T78C、T669C、A1125G 和 T1158C 突变的 SEQ ID NO 1 的核苷酸序列(cppct540)， 该核苷酸序列(cppct540)的相应氨基酸序列含有Vall93Ala突变。
5.根据权利要求4所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述pet基因具有含有T78C、 T669C、A1125G和T1158C突变的SEQ ID NO 1的核苷酸序列(cppct540)，该核苷酸序列 (cppct540)的相应氨基酸序列含有Vall93Ala突变。
6.根据权利要求1所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因源自假单胞菌6-19。
7.根据权利要求1所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因具有对应于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的核苷酸序列，或者具有对应于包含至少一个下列突变的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的核苷酸序列E130D、S325T、L412M、 S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K 和 Q481R。
8.根据权利要求7所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因具有对应于选自以下的至少一个氨基酸序列的核苷酸序列含有 E130D、S325T、L412M、S477G和 Q481M突变的 SEQ ID NO :2 的氨基酸序列(C1335)； 含有E130D、S477F和Q481K突变的SEQ ID NO 2的氨基酸序列(C1310)；和含有E130D、S477F和Q481R突变的SEQ ID NO 2的氨基酸序列(C1312)。
9.根据权利要求1所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其进一步包含编码3HB-CoA合酶的基因。
10.根据权利要求9所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述编码3HB-CoA合酶的基因包括酮硫解酶基因和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因。
11.根据权利要求10所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述酮硫解酶基因和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因源自富氧罗尔斯通氏菌。
12.根据权利要求1所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其能够产生MCL的羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。
13.根据权利要求1所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其进一步包含PhaG基因。
14.根据权利要求13所述的重组富氧罗尔斯通氏菌，其中，所述PhaG基因源自恶臭假单胞菌KT2440。
15.一种制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的方法，包括在含有碳源和乳酸酯的培养基或含有碳源、乳酸酯和羟基链烷酸酯的培养基中培养根据权利要求1 14中任一项所述的重组富氧罗尔斯通氏菌；和从上述重组富氧罗尔斯通氏菌中回收聚乳酸酯或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物中的羟基链烷酸酯包括选自3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、含有6 14个碳原子的中链长(D) -3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、 3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、 5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式_己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、 3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-6-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-7-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸甲酯、3-羟基己二酸甲酯、3-羟基辛二酸甲酯、3-羟基壬二酸甲酯、3-羟基癸二酸甲酯、3-羟基辛二酸乙酯、3-羟基癸二酸乙酯、3-羟基庚二酸丙酯、3-羟基癸二酸苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12- 二羟基十二烷酸、 3,8- 二羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、 3-羟基_8，9环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴i^一烷酸、3-羟基-2- 丁烯酸、6-羟基-3-十二碳烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3 -羟基-2-甲基戊酸和3-羟基2，6- 二甲基庚烯酸中的至少一种。
全文摘要
本发明提供一种能够产生聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的重组富氧罗尔斯通氏菌和使用该重组富氧罗尔斯通氏菌制备聚乳酸酯或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法。所述重组富氧罗尔斯通氏菌通过向其中引入将乳酸酯转化为乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因来制备，可以对该重组富氧罗尔斯通氏菌进行培养，从而有效地制备乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物。
文档编号C12N15/31GK102307988SQ201080006770
公开日2012年1月4日 申请日期2010年2月3日 优先权日2009年2月5日
发明者姜惠玉, 朴时载, 李恩政, 李相贤, 梁宅镐, 金泰完 申请人:Lg化学株式会社