专利名称：含有心肌细胞的装置及其制造和使用方法
技术领域：
本发明涉及测定化学化合物的心脏毒性(cardiotoxicity)的装置。本发明进一步涉及制造这种装置的方法。本发明还进一步涉及使用这种装置测定化学化合物的心脏毒性的方法。本发明进一步涉及所述装置用于药物靶标发现和/或药物开发的应用。本发明进一步涉及为由细胞的拉伸所导致或改变的疾病开发疾病模型的方法，特别是心脏疾病模型。
背景技术：
许多药物具有心脏毒性副作用，例如心律失常或对心肌收缩能力的负面影响。在过去的几年中已明显得知许多药物的一个常见副作用是对心动周期中QT间期的延长影响，这是药物诱发的危及生命的心律失常的重要原因。例如，在过去，数种药物的研发由于对体表心电图(ECG)的QT间期的不希望影响已经中止于临床前试验或临床试验的后期，甚至上市后。该间期延长至超过440至460毫秒可能会导致危及生命的心律失常的发生，例如尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes，TdP)，并且与多种药物相关。1998年当Food and Drug Administration (FDA)认定QT间期的延长为重大药物安全问题时，该现象得到公认。因此，QT延长和临床尖端扭转型室性心动过速的确认导致一些药物从美国市场的清除，包括特非那定、阿司咪唑、硫利达嗪和格帕沙星，同时许多其它药物被FDA要求携带警告潜在风险的附加安全标签。目前，延迟的心室复极化和QT间期延长的风险评估是被FDA和EMEA采用的用于所有研发中药物的NCE标准非临床评价的一部分。不幸的是，目前可得到的检测心脏毒性的临床前体外细胞基模型系统对于检测这些副作用的大多数是不足的，同时预测性体内动物试验非常昂贵，并且受到道德上的挑战。 另外，从动物研究获得的心脏毒性结果不能容易地推及到人类。检测过程由于以下事实被进一步复杂化药物的这些心脏毒性影响可能只在发生在体内跳动心脏中的实际心肌拉伸和收缩期间，特别是在(剧烈)体育运动期间；以及在心脏疾病中，例如与心脏超负荷相关的疾病，如心脏衰竭，和以炎症为特征的疾病中，如在流感感染过程中，才变得明显。目前没有模拟，在生理状态，即拉伸-收缩周期，或者与心脏衰竭相关的病理生理状态，例如针对增加的压力的过度拉伸/收缩，的正常跳动心脏的检测模型系统存在。此外，不同的药物对心脏功能可能有不同的负面影响。一些基于人类细胞的模型系统可获得而用于心脏毒性检测。这些模型系统典型地可由在标准的多电极阵列(MEA)上的心肌细胞(动物的或人的，原代心肌细胞(primary cardiomyocytes)或干细胞衍生的心肌细胞)组成，在“Pluripotent stem cell lines”J. Yu和JA. Thomson, Genes Dev. 2008，22，p. 1987-1997中公开。然而这些系统的有效性受到以下事实的限制这些是静态模型系统，没有考虑跳动心脏的动态特性。^ iAn Electro-Tensile Bioreactor for 3-D Culturing of Cardiomyocytes^,Zhonggang Feng^. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine, July/August 2005，第73-79页中，公开了一种生物反应器，其允许布置在可拉伸硅酮板上的含有心肌细胞的凝胶层的面内拉伸以模拟体内心肌的机械和电响应。这一装置的一个缺点是其相当复杂并且由于心肌细胞包埋在凝胶中的事实而不是特别适合心脏毒性检测。
发明内容
本发明寻求提供一种改进的用于测定化学化合物的心脏毒性的装置。本发明进一步寻求提供一种制造这种改进的装置的方法。本发明还进一步寻求提供一种使用这种改进的装置测定化学化合物的心脏毒性的方法。本发明进一步寻求提供一种使用这种改进的装置开发(心脏)疾病模型的方法。根据本发明的第一方面，提供了用于测定化学化合物的心脏毒性的装置，包括承载有可变形叠层(stack)的基板(substrate)，所述叠层通过允许所述叠层的面外 (out-of-plane)变形的空腔(cavity)从基板部分分离，所述叠层包括第一可变形层，第二可变形层及夹在所述第一可变形层和第二可变形层间的多电极结构，所述第二可变形层承载有粘附其上的心肌细胞(cardiomyocytes)图案，以及安装在基板上的用于使心肌细胞暴露于所述化学化合物的液体容器。所述空腔的存在确保第一可变形层例如弹性体层的至少中心区域不连接到基板， 从而该区域可以自由移动，例如被心肌细胞的收缩引发。所述空腔的提供确保了可以以相对简单的方式方便心肌细胞收缩引起的移动，从而与现有技术的装置相比减少本发明装置的成本。在一实施方式中，所述可变形叠层的一端从基板分离以方便心肌细胞收缩时的面外变形，例如卷曲。这具有的优势是心肌细胞收缩可以通过电极设置以电学方式监控，以及可以通过卷曲量以光学方式监控。另外，卷曲原理确保叠层对收缩心肌细胞的变形力的内在抵抗性低，从而收缩没被该抵抗性明显阻碍。在一个优选的实施方式中，所述基板包含所述空腔，所述叠层在所述空腔上方延伸，其中叠层的相对端连接到基板上，从而方便由外部施加的力引起的叠层的面外变形。这具有的优势是该装置也可以用于通过在可变形叠层的面外变形期间拉伸细胞来培养未成熟的心肌细胞，从而活心肌细胞的分化和成熟过程被加速。另外，心肌细胞的收缩由于以下事实仍然是便利化的叠层的可拉伸(Stretchable)性质允许面内的心肌细胞诱导的可变形层的拉伸，这样分别在心脏舒张期和收缩期期间的心肌细胞拉伸和收缩都可以用该装置在适当的拉伸-收缩周期频率以定量方式模拟。这可进一步促进干细胞衍生的心肌细胞的分化和成熟。所述装置可包含用于用流体填充空腔的进口。在一实施方式中，所述流体是气体 (例如空气)，从而叠层的面外变形可以通过控制空腔内的气体(例如空气)压力进行控制，从而模拟心脏的跳动。这具有的优势是不需要与叠层接触而引起面外变形，从而减少污染或损坏心肌细胞的风险。在一个可选的实施方式中，所述流体是液体，并且所述叠层包含所述进口。叠层中进口的提供进一步方便了心肌细胞收缩周期期间叠层的拉伸，从而例如使得能够使用线形电极阵列。在该实施方式中，任何置于容器中的流体都将包围叠层的两个表面，使得流体在叠层上的载荷将有效地为零。在这种情况下，叠层的面外变形可以是以机械方式产生的。可得到100%或更大的叠层的面外变形。在一实施方式中，所述叠层是波纹状的以使得其可变形。波纹进一步降低了叠层对心肌细胞收缩力的内在抵抗性，从而改善所述装置的心肌细胞收缩行为。按照本发明的另一方面，提供了本发明装置的制造方法。该方法包括生长所述基板的氧化物层；在氧化物层上沉积第一可变形层；在第一可变形层上沉积并图案化导电层 (conductive layer)，从而形成多电极结构，在第一可变形层上沉积第二可变形层，图案化第二可变形层以提供至多电极结构的通路(to provide access to the multi-electrode structure)，在图案化的第二可变形层上沉积粘性图案，将心肌细胞粘附于所述粘性图案， 将液体容器粘附到第二可变形层上并形成在第一可变形层下面的空腔。这种方法的优势在于本发明的装置可以以低成本形成，从而使该方法对大规模生产目的具有吸引力。这种方法的步骤执行的顺序可以改变而不超出本发明的范围。例如，在图案化的第二可变形层上沉积粘性图案和将心肌细胞粘附于所述粘性图案的步骤可以在形成在第一变形层下面的空腔后进行。这具有的优势在于心肌细胞可以在即将使用前施加到第二可变形层，从而确保在使用期间心肌细胞处于良好的状况。在一实施方式中，形成所述空腔包括在沉积第一可变形层前在氧化物层上沉积牺牲层，所述牺牲层限定空腔容积并且在沉积第二可变形层后移除所述牺牲层。这具有的优势在于叠层可以在牺牲层上而不是在所述空腔上形成，从而由于不需要复杂步骤以在空洞上形成叠层而简化制造工艺。在一个可选的实施方式中，形成所述空腔包括在基板背面上施加掩模；图案化所述掩模以限定空腔区域；蚀刻基板的背面以暴露第一可变形层；和从基板背面移除图案化的掩模。这具有的优势在于叠层可以在基板上而不是空腔上形成，从而如以上解释的那样简化制造工艺。有利地，所述方法进一步包括在形成氧化物层前在基板中形成波纹状图案。这具有的优势在于变形能力可通过波纹(corrugations)的柔韧性(flexibility)实现，如前面解释的那样其有助于心肌细胞的收缩周期。在一实施方式中，所述波纹状图案通过轧压(milling)形成。在一个可选的实施方式中，形成所述波纹状图案(corrugated pattern)包括在基板上沉积氧化硅层；在氧化硅层上沉积氮化硅层；图案化氧化硅和氮化硅层，从而暴露基板的选定部分；将所述选定部分暴露于一系列蚀刻步骤以形成所述波纹状图案；和移除氧化硅和氮化硅层。这具有以下优势波纹状图案可以使用容易得到的半导体加工技术形成，从而限制了装置制造的复杂性和成本。可选择地，所述波纹状图案可以通过L0C0S氧化步骤、随后进行其中移除L0C0S氧化物的蚀刻步骤而形成。这同样有以下优势波纹状图案可以使用容易得到的半导体加工技术形成，从而限制装置制造的复杂性和成本。根据本发明的又另一方面，提供了测定化学化合物的心脏毒性的方法，包括提供根据本发明的一个实施方式的装置；用含有化学化合物的介质填充所述容器以使心肌细胞暴露于所述化合物；并且测量心肌细胞对所述暴露的反应。
在这种方法中本发明装置的使用提供了化学化合物例如试验药物的心脏毒性测定的准确性改进。本发明进一步涉及为由细胞的拉伸导致或改变的疾病开发疾病模型的方法，所述方法包括步骤将至少一个细胞附着至粘性表面图案通过外部施加的力拉伸所述至少一个细胞以电学方式和/或光学方式测量所述至少一个细胞的动作电位，随时间监控和/ 或解析所述动作电位。所述方法特别适用于建立心脏疾病模型(除了其中细胞拉伸与测量离子通道活性(activity)和电势(electric potential)相关的疾病模型之外)。心脏细胞毒性可以在模拟体育锻炼期间增加的心脏负荷(压力)的情况下或与增加的心脏输出相关的其他情况下测量是一个很大的优点。心脏细胞毒性可以在心脏疾病，例如心力衰竭、心肌症等情况下测定是一个进一步的优势。在所述方法中可以考虑特定遗传变量(genetic variable) 对心脏毒性(cardiotoxicity)的影响。在一个有利的方法中，所述至少一个细胞的拉伸可以相对于所述粘性表面图案是面内和/或面外的。面内细胞拉伸百分比超过30 %并且拉伸时间是不同的。优选地，在测量过程中添加化学或生物化合物。根据本发明的装置的使用允许用于药物发现和开发的精确心脏疾病模型的开发， 以及在个体化的基础上，考虑人类遗传变量。
本发明的实施方式被更详细地且通过参考附图的非限制性实例进行了描述，其中图1 (a)-(g)示意性描绘了依照本发明的一个实施方式制造测定化学化合物心脏毒性的装置的方法；图2示意性描绘了通过图1的方法得到的测定化学化合物心脏毒性的装置的顶视图；图3(a)_(c)示意性描绘了依照本发明另一实施方式的测定化学化合物心脏毒性的装置；图4示意性描绘了用于本发明的测定化学化合物心脏毒性的装置的一个示例电极设置；图5示意性描绘了用于本发明的测定化学化合物心脏毒性的装置的一个可选示例电极设置；图6(a)_(j)示意性描绘了依照本发明的一个可选实施方式制造测定化学化合物心脏毒性的装置的方法；图7 (a)-(h)示意性描绘了依照本发明又一实施方式制造测定化学化合物心脏毒性的装置的方法；以及图8-10显示了图7方法的一部分的可选方式。
具体实施方式
应该理解附图仅仅是示意性的并且不是依照比例绘制的。还应该理解贯穿附图使用同样的附图标记代表相同或相似的部件。本发明测定化学化合物心脏毒性的装置是基于下述一般结构原理。将基于弹性体的叠层设置在基板中的空腔之上。该空腔有效地将基于弹性体的叠层的一部分从基板分离，这样该部分的弹性特性被便利化以移出基板的表面平面。设计了这种装置的几个实施方式，如下面将更详细地描述的那样。在图1中，描绘了制造本发明装置的第一实施方式的方法。在第一步骤(a)中，提供基板10例如硅片、玻璃基板或任何其它合适的基板材料以及在基板10表面上形成介电层12例如氧化硅层。基板10上的介电层12的形成是本领域技术人员公知的，并且仅由于简洁原因而不再进一步解释。在下一步骤(b)中，牺牲材料14沉积在介电层12上并且随后图案化。图案化的牺牲材料14限定了将形成的空腔。可使用任何适宜的牺牲材料，例如可溶的或可分解的聚合物。这种聚合物的适宜的非限制性例子是聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。在步骤(c)中，在图案化的牺牲材料14和介电层12上形成基于弹性体的叠层。该叠层包含第一弹性体层16，在第一弹性体层16上形成的图案化的金属层18以及覆盖图案化的导电层18使得导电层被夹在第一弹性体层16和第二弹性体层20之间的第二弹性体层20。可以使用任何适宜的弹性体层。在一实施方式中，第一弹性体层16是聚二甲基硅氧烷(PDMS)层，其可通过旋涂施加。可以在该层上施加任何适宜的导电材料，例如金属。例如，TiN层或Ti/Au层叠层可沉积在PDMS层16上并且随后图案化。第二 PDMS层20可以旋涂在图案化的导电层18上。该图案化的导电层典型地包含电极、焊盘以及焊盘和电极之间的连接。后面将对此进行更详细地解释。在步骤(d)中，以任何适宜的方式形成到图案化的导电层18中的电极和焊盘 (bond pads)的接触(contacts) 22，例如通过RIE蚀刻。在这之后，如步骤(e)中所示，将固定层对施加于图案化的导电层18中的电极上的第二弹性体层20的区域，用于将活的心肌细胞固定至基于弹性体的叠层。所述活的心肌细胞可以是任何适宜类型的心肌细胞，例如人或动物原代细胞(primary cells)，或人干细胞衍生的细胞。用于固定层M的适宜的材料的一个实例是纤连蛋白(fibronectin)，其可以通过压印印刷(stamp-printing)、丝网印刷或喷墨印刷施加。所述心肌细胞可以随后粘附到该层上。对于本领域技术人员来说显而易见的是，纤连蛋白是这种固定层的一个非限制性实例，并且也可以考虑其它适宜的粘附材料。限定电极阵列箔(foil)的基于弹性体的叠层的尺寸可以通过(激光)切割叠层和牺牲材料层确定，从而提供切口 25，其也充当至牺牲材料14的通路。该步骤之后是步骤(f)，其中液体容器25以任何适宜的方式连接到所述装置，例如通过胶合。最后，如步骤(f)中所示，牺牲材料被移除。例如，在牺牲材料是PIPMAAm的情况下，其可以通过在 Tyrode' s溶液中溶解该层而移除。其具有心肌细胞可以早已经位于固定层M上的优势， 由于Tyrode' s溶液的等渗特性。在可热分解的材料的情况下，移除可以通过将该装置暴露到高于所述材料的分解温度的温度来实现。在该实施方式中，需要注意选择在足够低的温度分解的材料以避免损坏装置的其它层。为此，可以在移除可热分解的材料后将固定层24和心肌细胞两者施加于基于弹性体的叠层。在一个实施方式中，基于弹性体的叠层或箔的厚度在3-10微米的范围。在该范围内，基于弹性体的叠层或箔具有特别好的柔韧性。图1 (g)展示了操作中的依照本发明这一实施方式的装置。液体容器沈填充有包含准备在心肌细胞28上检测的化学化合物的溶液30。包埋心肌细胞的溶液30可以含有不同浓度的被测化学化合物以及模拟不同体内(病理)生理状况，例如由剧烈运动引起的状态，所需的不同浓度的分子，例如电解质，如钾、钠、钙、葡萄糖、氧气、C02。在承载心肌细胞28的基于弹性体的叠层下的空腔32允许该叠层的由心肌细胞 28的收缩触发的面外卷曲。在心肌细胞观的拉伸-收缩周期期间通过图案化的金属层 18中的电极纪录的场电位可以用于测定化学化合物对心肌细胞观的离子通道中的传导性 (conductivity)的影响。在本发明的上下文中，应该理解短语“化学化合物”并不意在限于准备用作药物的化合物或只限于单一化合物。通常，任何物质，例如含有一种或多种化合物的化合物混合物、乳液和溶液，都可以使用本发明的装置检测。移除牺牲层14前图1(f)中显示的装置的电极阵列的顶视图显示于图2中。图案化的导电层18包含许多通过导电连接器(connectors) 112连接到相应电极144的焊盘 110。成型液体容器沈从而其围起所有电极114。也显示了切口 25，如前面解释的那样，其限定了可以卷起的叠层部分。切口 25延伸至下面的牺牲层14。如前面解释的那样，这促进了该层的移除。固定层对，例如蛋白纤连蛋白，优选在叠层的长度方向以条带(未显示) 的形式图案化。这使得当粘附在这些条带上的心肌细胞观收缩时引起的叠层卷曲最大化。在本发明的一个可选的实施方式中，空腔32在基板10中形成，可变形叠层覆盖到空腔32的通路，从而基于弹性体的叠层上压力的改变将允许叠层进入或远离空腔32的变形。在第一实施方式中，可以使用基于弹性体的叠层，其操作原理在图3中示出。如图3(a) 中显示，基板10包含延伸穿过基板的空腔32，其被基于弹性体的叠层34覆盖。叠层34可以由第一弹性体层16、图案化的导电层18和第二弹性体层20形成并且典型地承载由液体容器26围起的心肌细胞观的图案，如前面解释的那样。仅仅由于清楚的原因，这些特征没有明确地显示在图3(a)中。叠层或箔34典型地保持为非常薄以优化其可拉伸性。如图3(b)所示，所述装置可进一步包含具有入口 36的腔室32'。腔室32与空腔 32连通接触，从而空腔32中的压力可以被调节，例如通过经由入口 36抽出或加入气体例如空气来降低或增加。这迫使叠层34在基板10面外的方向拉伸，例如当降低空腔32中的压力时向空腔32中拉伸或当增加其中的压力时远离空腔32。因此，粘附在叠层34上活的心肌细胞在该过程中也被拉伸。在图3(c)中，心肌细胞的自主收缩引发叠层34的面内变形， 其包括心肌细胞下的叠层34的增厚(收缩)和在心肌细胞所位于的区域外叠层32的变薄 (拉伸)。图3(a)_(c)中所示的装置具有可以拉伸的叠层34的事实具有两个主要优势。第一，重复的拉伸可以施用于未成熟的干细胞以将这些干细胞分化为心肌细胞，从而产生包含完全分化的心肌细胞的用于测定化学化合物心脏毒性的装置，这改善了用该装置获得的临床数据的相关性。第二，叠层34可以与心肌细胞的收缩节奏同步被拉伸以模仿跳动的心脏。这例如允许附着的心肌细胞被动拉伸以允许在模拟静息(at rest)和在受控(病理)生理应力下心脏的动态心肌细胞模型体系中离子通道的测量。心肌细胞收缩节奏可以是自主的或电诱导的。叠层34中的电极设置可以采取任何适当的形状。在图4显示的一个实施方式中， 电极设置包含环形设置，被圆柱状液体容器沈覆盖，液体容器沈用于盛放包含营养物和/ 或一种或多种化学化合物即药物的液体。容器沈围起粘性条带M例如纤连蛋白条带(心肌细胞固定，例如粘附，在其上)的放射状图案。条带的放射状图案促进放射状图案的心肌细胞的收缩，如前面解释的那样，导致叠层34中心部分的增厚。出于清楚的原因仅仅示出了四条条带。叠层34可以承载任何适宜数目的条带。电极114的图案与这些条带对齐。如先前所解释的那样，电极114经由连接器112连接到焊盘110。焊盘110可以以任何适宜的图案，例如矩形或方形图案设置。关于这一点，要强调的是叠层34的可拉伸特性并不必须通过使用弹性材料实现。 可选择地，叠层34可以是波纹状的，这样必需的可拉伸性通过波纹实现，如在下面将更详细地说明的那样。对于这种实施方式，可以使用除了弹性体之外的材料。图5显示了这种波纹状叠层的一个示例电极设置。从焊盘110到电极114的连接112是基本上线性性质的并且沿垂直于叠层中波纹140的方向。心肌细胞条带典型地也沿垂直于叠层中波纹140的方向。为便于图5的叠层设置的拉伸，沿着叠层提供开口 120。因此，含有营养物和待测化学化合物例如药物的液体将围起叠层的两面，即也填充空腔32，作为液体重量的结果而导致叠层上“零”加载。在这种情况下，叠层的面外拉伸可以以机械方式引发。应该指出的是包含图4的环状电极设置的叠层也可以包含开口 120以降低叠层上的“零”加载。在一个优选的实施方式中，在基于弹性体的叠层中的图案化的导电层18包含Ti/ Au作为导电材料，因为已显示薄的钛和金层可以拉伸达100%，因此允许导电图案无损坏地拉伸。可选择地，可考虑TiN或其它适当的可拉伸导体。图6示意性地描绘了根据图3的装置的一种制造方法，其中叠层34是基于弹性体的。在步骤(a)中，提供厚度在大约300-400微米的硅基板10并且其背面提供有合适的硬-蚀刻掩模(hard-etch mask) 50，例如LPCVD生长的氮化硅(Si3N4)。蚀刻掩模50被图案化以限定将在基板10中形成的空腔。换句话说，蚀刻掩模图案限定了可拉伸区域的位置和大小。在下一步骤(b)中，在基板10的前侧生长介电层12，例如热氧化物层，至1微米或更小，例如0. 5微米的厚度。在这之后是第一弹性体层16，例如第一 PDMS层的沉积和图案化，如步骤(c)所示。该层可以以任何适宜的方式沉积，例如通过旋涂。PDMS是特别适宜的材料，因为其是生物相容的和可以拉伸达100%。在步骤(d)中，在第一弹性体层16上形成图案化的导电层18。这可以以任何适宜的方式实现。例如，Ti/Au叠层或TiN可以作为导电材料使用，并且可以溅射涂覆并图案化以形成电极和互连图案，例如图4中显示的图案。注意，第一弹性体16已经被图案化，这样焊盘下不存在弹性体以允许可靠的引线接合。在步骤(e)中完成基于弹性体的叠层，其中以任何适宜的方式沉积第二弹性体层 20，例如第二 PDMS层以密封互连图案112并且被图案化以暴露例如图4中示出的电极114 和焊盘110。
接下来，如步骤(f)中所示通过用任意适宜的蚀刻剂湿-蚀刻暴露的基板10的背面，其中HF/HN03/乙酸(HNA)蚀刻剂是一个非限制性实例，形成基板10中的空腔(图 6(f))。在步骤(g)中移除硬-蚀刻掩模之后，基板10，其典型地是承载多个传感器装置的晶片(wafer)，在步骤(h)中被切块，从而分开独立的传感器装置。在介电层12还没有被湿-蚀刻步骤完全移除的情况下，可以施加进一步的湿蚀刻步骤以移除剩余的介电层材料。最后，在步骤(i)中将容器沈胶合到装置的前侧。用于将心肌细胞粘附至基于弹性体的叠层的粘性层图案，例如纤连蛋白图案，可以在容器26内施加，例如通过压印，之后心肌细胞被施加至该粘性图案。这优选在即将使用该装置前进行以保证心肌细胞当使用时是 “新鲜的”。图6(j)示出了导电层18的焊盘110和电极114间的互连112的一个实施方式。 所述互连112被设计成蜿蜒的形状以进一步方便基于弹性体的叠层的拉伸。图7显示了形成具有可以依靠包含波纹的叠层进行变形的叠层的装置的方法的第一实施方式，如前面在图6的描述中讨论的那样。在步骤(a)中，提供厚度大约300-400 微米的硅基板10并且其背面提供有适宜的硬-蚀刻掩模50，例如LPCVD生长的氮化硅 (Si3N4) 0蚀刻掩模50被图案化以限定将在基板10中形成的空腔。该步骤基本上与图6中步骤(a) —样。接下来，如步骤(b)所示，以任意适宜的方式在基板10中形成波纹10'，例如通过轧压或蚀刻。需要注意的是，虽然波纹显示为具有三角形的形状，但是这只作为非限制性实例。优选地，波纹剖面具有更圆化(rounded)或波状(wavy)的形状。如何可以实现这种波状的波纹图案将在下面进行更详细地讨论。在步骤(c)中，生长热氧化物蚀刻阻挡层，随后在步骤(d)中沉积共形的第一层16。所述共形的材料可以是任意适宜的材料。一种优选的候选材料是聚对二甲苯(parylene)，因为其是生物相容性材料，具有可以在室温CVD沉积的特别阶跃式覆盖 (exceptional st印-coverage)。在焊盘的位置，在层16中蚀刻开口。在步骤(e)中，形成图案化的导电层18，例如溅射涂覆并图案化TiN层以形成电极和互连图案。如步骤(f)中所示，沉积第二弹性体层20，例如第二聚对二甲苯层以密封互连 112并且图案化以暴露电极114和焊盘110。在步骤(g)中，通过用HNA湿-蚀刻基板的暴露背面在可延伸区下面形成空腔32。 如果必要的话，可以施加额外的湿蚀刻步骤以移除任何残余热氧化物蚀刻阻挡层。在步骤 (h)中移除硬-蚀刻掩模50之后，通过在步骤⑴中将基板晶片切块分离单独的装置，之后在步骤(j)中将容器26粘附到基板10的前侧。用于将心肌细胞粘附至可拉伸区域的粘性层图案，例如纤连蛋白图案，可以在容器26内施加，例如通过压印，之后心肌细胞被施加至该粘性图案。需要重申的是，优选提供带有具有圆化的或波状形状的波纹10'的基板10。这样做的其中一个原因是将在波纹上形成的后续层，例如弹性体层16和20，由于这些层连续性的减小的中断风险，可以更容易地形成，由于用这些随后的层适当地镶衬这些拐角的困难性，所述中断可能在三角形波纹底部的锐角拐角中发生。图8显示形成圆化的波纹10'的方法的第一实施方式，其利用当暴露至各向同性湿蚀刻步骤时硅的蚀刻行为。在步骤(a)中，提供带有适合的图案化的硬掩模50'的硅基板10，该图案反映了希望的波纹10'的凹进处的位置。可以使用适宜的硬-蚀刻掩模例如LPCVD生长的Si3N4层。在步骤(b)中，基板10正面的暴露的部分暴露于各向同性湿蚀刻混合物，例如HNA 或HF/HN03/H20混合物。该各向同性蚀刻步骤导致向下蚀刻(under-etch)，其横向扩展至蚀刻深度的约0.7倍。可选择地，可使用干法蚀刻，例如CF4/02等离子体。最后，硬蚀刻-掩模50'在步骤(c)中移除。这产生波纹图案，其中在基板10中的“谷” 10'是圆化的，而分隔相邻“谷”的“峰”是平坦的。在第二实施方式中，这些“峰”也是圆化的，从而实现更加波浪状的，即波状波纹图案。这显示在图9中。在步骤(a)中，在沉积硬-蚀刻掩模50'之前，在基板10上生长氧化物层12'。氧化物层12'和硬-蚀刻掩模50'被图案化以暴露基板10的在其中将蚀刻波纹“谷” 10'的区域。接下来，如步骤(b)中所示，硅基板10被各向同性蚀刻至小于最终所需深度的中间深度。该蚀刻不影响硬-蚀刻掩模50'，例如Si3N4掩模50'，并且仅轻微影响氧化物层 12'。在随后的蚀刻步骤(c)中，硬-掩模层50'下面的氧化物12'被蚀刻，例如通过由 NH4F/HF的混合物组成的缓冲的氧化物蚀刻。注意将需要一定量的“过蚀刻”。接下来，在蚀刻步骤(d)中硅再次被各向同性蚀刻。由于各向同性蚀刻优先攻击尖锐的硅拐角，该步骤将导致波状的硅图案。在步骤(e)中移除硬掩模50'和残存的氧化物层12'后，装置制造可以如图7及其详细解释中的描述继续进行。所述波状图案可以通过调节图案间的间距(Pitch)和氧化物层12'的厚度进行优化。如图10中所示，通过使用LOCOS可以得到具有更细间距的“波状”波纹结构。仅由于LOCOS技术为本领域技术人员所公知，所以这将进行简要描述。在步骤(a)中，提供承载有适宜的由垫氧化物12 ‘和LPCVD沉积的Si3N4硬掩模层50 ‘组成的LOCOS叠层的硅基板10。该叠层被图案化以暴露基板10的将形成波纹10'的区域。在步骤(b)中，硅基板的暴露区域被热氧化以形成热氧化物层52。Si3N4硬掩模层50'将不会被氧化；然而在Si3N4 硬掩模层50'的边缘，热氧化物层52将在氮化物下面延伸，即形成与LOCOS氧化相关的公知的鸟嘴(birds beaks)。所述鸟嘴的大小和形状由垫氧化物(pad-oxide)层12'、Si3N4硬掩模层50'的厚度以及氧化条件决定。通过优化这些条件和波间的间距，在步骤(c)中移除Si3N4硬掩模层50'以及在步骤(d)中移除氧化物后将得到波纹结构。可选择地，波纹硅图案可使用灰度光刻(gray-scale lithography)或使用抗蚀剂流动(resist flow)得到。应该提及的是，纤连蛋白或任何其它适合的粘合剂，可以通过压印、结合光刻的喷涂施加。在一个优选的实施方式中，纤连蛋白通过喷墨印刷施加。粘性纤连蛋白图案优选地在可拉伸叠层上放置容器后施加，之后心肌细胞被施加于该粘性图案。进一步指出的是，除了电极之外电极阵列可以补充有许多传感器。这种传感器的非限制性实例包括可以测量由心肌细胞收缩导致的力的量的应变计，和可以测量这些细胞产生的热的量的微热量计。最后应该指出的是，虽然本发明装置的实施方式被显示为仅在图案化的导电层18 中包含无源器件(passive device)，在其中形成的电极阵列作为选择可以包含用于形成电路的有源器件(active device)，其例如可以执行信号放大和信号整形功能。
应该理解的是，本发明的装置使得能够测量心肌细胞离子通道活性以检测QT延长，即代表心室去极化和随后复极化持续时间的间期的延长，从QRS复合波的开始到心律T 波的结束测量，以及心脏细胞中的其它电生理异常。相比于在稳态系统中进行的电生理测量，其中没有考虑由于在心脏舒张期期间左心室填充引起的被动心肌细胞拉伸的影响，本发明的装置可以用于开发能够准确模拟多种心律不齐的心脏细胞模型，例如由以下引起的心律不齐在体力消耗(physical exertion) 期间发生的长QT综合症，或者与增加的心输出量相关的病理生理状况(像发烧、贫血)， (当心率、舒张末期心室容积和填充压力均增加引起所需的心输出量增加时)。心室壁心肌细胞的拉伸水平和心肌细胞收缩力之间的直接关系在 Frank-Marling定律中描述。随着增加的拉伸，收缩力增加直到达到进一步的拉伸引起心输出量减少的点。这已被描述为机电反馈(electromechanical feedback)。心肌细胞的这种(病理)生理拉伸在离子通道活性和易发心律不齐中起作用。本发明的可拉伸装置使得在心肌细胞拉伸和收缩的受控(病理)生理条件下测量离子通道活性成为可能。如上所述的离子通道活性的这种测量可以在特定的心脏病模型中执行，例如用于肥厚型心肌病和心力衰竭的疾病模型。心脏心室壁中的心肌细胞的长时间的过度拉伸(与增加的心脏负荷相关)导致肥大，潜在地导致心力衰竭。施加于粘附在本发明装置可拉伸叠层上的心肌细胞的受控拉伸-收缩循环的较长周期(施加了过度的被动拉伸)，预期引起心肌细胞肥大并且模拟心力衰竭，并且离子通道活性和收缩力的连续纪录可以显示关于潜在的发病机制的信息。上述肥厚型心肌病的模型系统可以用于药物靶标发现，即鉴定在疾病过程中起原因作用的特定药物靶标分子以及可用于治疗所述疾病的化合物的发现，以及用于药物研发。显然，化学化合物的心脏毒性也可以在这种疾病状态中检测。上述疾病模型可以通过将活的心肌细胞暴露于以指示所模拟的疾病的浓度含有血液中存在的溶质例如电解质、02、CO2、葡萄糖等等的溶液来实施。因此，心肌细胞对这些溶质的反应可以用于获得模拟的疾病对这些细胞的影响的更好的理解。为由细胞拉伸引起或改变的疾病开发疾病模型的方法包括以下步骤-将至少一个细胞连接至粘性表面图案04)-通过外部施加的力拉伸所述至少一个细胞-以电学方式和/或以光学方式测量所述至少一个细胞的动作电位，随时间监控和/或解析所述动作电位。为发展并构建用于药物靶标发现和药物研发和药物毒性测量的疾病模型，执行一些试验步骤1.根据已有方案，生产/培养代表患病组织的所需活细胞。它们可以直接从细胞系或从动物或人类组织源获得，并且准备用于培养。它们也可以从已被诱导分化成所需的细胞类型的动物或人类干细胞获得。2.在上面描述的装置的表面上，可以沉积或印刷纤连蛋白或其它细胞外基质或其它粘性层，以使细胞连接至所述表面并保持存活。3.所需要数量的细胞(根据表面积和细胞种类)被安放在前面描述的基板上，并且在正确的培养基中维持在健康的存活条件，以测定某些细胞特异性变量，像离子通道活性或电动作电位(electric action potential)。
4.有时可能需要额外的或重复的动作/程序以进一步发展所述疾病模型，有时这可能需要一次、连续或重复拉伸细胞至它们原始长度的100-200%或更长，在面内或以(通常)拉伸到面外的方式，模仿所需的疾病状况。有时更短或更长的拉伸周期后接着规定的松弛期。在该过程中，测量细胞的动作电位，并且关于涉及产生了生成电势改变的离子流 (ion fluxes)的一个或多个膜离子通道的活性进行解析。5. 一个或多个疾病-特异性变量被测量以证实疾病模型类似于实际疾病到其可以用于药物靶标发现、药物研发和药物毒性的程度。6.为了药物靶标发现、药物研发或药物毒性的目的，细胞将以与中的描述相同的方式被拉伸，以至拉伸发生在面内或(大部分)在面外并且连续监测并解析动作电位。 在该过程中可以添加需要研究的化学或生物化学化合物。7.完成试验的拉伸部分后，可以在细胞上执行一些其它的测量，像DNA/RNA/蛋白 /代谢物分析，以研究加入的化合物或其它细胞环境的改变，像PH或电解质、葡萄糖、氧气或营养补充物或代谢物浓度改变，对细胞功能/活性/成活力的影响。可以以这样的方式创建的疾病模型可根据以下被分为一些类型-所需的拉伸百分比，其或者通过体内发生的生理拉伸决定，例如在心脏跳动过程中，当心肌细胞和内皮细胞被拉伸至生理水平，取决于每次跳动的心输出量/血压；或者通过病理生理拉伸决定，像例如发生在肿瘤或脑内出血或硬膜下血肿中。-拉伸发生在面外的水平。例如对于模拟跳动心脏的模型，心肌细胞层在拉伸过程中必须被推出面外，并且在心跳舒张期返回面内。如果模型例如模拟心力衰竭，则心肌细胞将更加广泛地拉伸出面外以模拟增加的血液对心室的填充，超过Frank-Marling曲线的顶点。对于生长的肿瘤模型中的拉伸，拉伸将更加在面外。-随时间施加拉伸的方式一次短的、连续较长时间的或重复的。在心脏或内皮模型中拉伸被重复施加。例如，在肿瘤模型中拉伸是连续并增加的。例如，在脑内出血模型中， 拉伸是短的并且迅速增加到高/最大水平。-施用拉伸的时间周期例如具有在不同情况下心跳频率的间歇(拉伸-收缩周期)；或者在脑中硬膜下血肿模型的情况下，在几个小时期间拉伸缓慢增加；在脑内出血模型的情况下，几小时内拉伸快速增加，在脑肿瘤模型的情况下非常缓慢。-个体细胞之间粘附的类型。拉伸降低细胞间粘附的程度取决于粘附分子连接的强度和调节这些连接的细胞过程。例如在癌模型的情况下，模拟癌细胞中特定致病改变需要的拉伸水平将被调节到细胞间粘附的强度，其对于不同的肿瘤可能是特异性的，这样细胞层上的电阻被降低。上面描述的开发疾病模型的方法非常适合于那些由细胞拉伸引发或改变的疾病， 导致异常的动作电位或离子通道功能。实例是内皮疾病(endothelial diseases)如动脉粥样硬化和高血压和偏头痛；神经系统疾病(neurological diseases)如挥鞭伤、震荡、脑肿瘤、脑内出血和硬膜下血肿；肌肉疾病如Ducherme，和胃肠疾病如肠易激综合症。需要注意的是，上面提及的实施方式说明而不限制本发明，并且本领域技术人员能够设计许多可选的实施方式而不偏离附加的权利要求的范围。在权利要求中，任何置于括号中的附图标记将不解释为限制权利要求。词语“包含”不排除列于权利要求中的那些之外的要素或步骤的存在。在要素前的词语“a”或“an”不排除存在多个这种要素。某些措施在相互不同的从属权利要求中被描述的简单事实并不表示不能有利地使用这些措施的组合。
权利要求
1.用于测定化学化合物的心脏毒性的装置，包含-承载有可变形叠层(34)的基板(10)，所述叠层通过空腔(3 从所述基板部分地分离以允许所述叠层的面外变形，所述叠层包含第一可变形层(16)、第二可变形层00)和夹在所述第一和第二可变形层间的多电极结构(18)，所述第二可变形层承载有粘附到其上的心肌细胞08)的图案；以及-安装在所述基板上的液体容器(26)，用于使所述心肌细胞暴露于所述化学化合物。
2.权利要求1所述的装置，其中所述可变形叠层(34)的一端从所述基板(10)分离以方便当所述心肌细胞(28)收缩时所述叠层的面外变形。
3.权利要求1所述的装置，其中 -在所述基板(10)中形成所述空腔(32)； -所述叠层(34)在所述空腔上方延伸，并且-所述叠层的相对端连接到所述基板(10)，从而方便所述叠层(34)的由外部施加的力导致的面外变形。
4.权利要求3所述的装置，进一步包含用于用流体填充所述空腔(32)的进口(36， 120)。
5.权利要求4所述的装置，其中所述叠层(34)包含进口(120)。
6.权利要求3所述的装置，其中所述心肌细胞08)的图案是放射状图案。
7.权利要求3所述的装置，其中所述叠层(34)是波纹状的。
8.根据上述任一项权利要求所述的装置，其中所述叠层(34)的面外变形大于30%。
9.制造根据权利要求1的装置的方法，包括在所述基板(10)上生长氧化物层(12)； -在所述氧化物层上沉积所述第一可变形层(16)；-在所述第一可变形层上沉积并图案化导电层(18)，从而形成所述多电极结构；-在所述第一可变形层上沉积第二可变形层00)；-图案化所述第二可变形层以提供到所述多电极结构的通路；-在图案化的第二可变形层上沉积粘性图案04)；-将心肌细胞08)粘附至所述粘性图案；-将所述液体容器06)粘附至所述第二可变形层；以及-在所述第一可变形层下面形成所述空腔(32)。
10.权利要求9所述的方法，其中在所述图案化的第二可变形层上沉积粘性图案04) 和将心肌细胞08)粘附至所述粘性图案的步骤在所述空腔(3 在所述第一可变形层下面形成之后进行。
11.权利要求10所述的方法，其中形成所述空腔(32)包括-在所述第一可变形层(16)的沉积前，在所述氧化物层(1 上沉积牺牲层(14)，所述牺牲层限定空腔体积；以及-在所述第二可变形层OO)的沉积后除去所述牺牲层。
12.权利要求10所述的方法，其中形成所述空腔(32)包括 -在所述基板(10)的背面上生长掩模(50)；-图案化所述掩模以限定空腔区域；-蚀刻所述基板的背面以暴露所述第一可变形层(14)；以及-从所述基板的背面移除所述图案化的掩模。
13.权利要求12所述的方法，进一步包括在形成所述氧化物层(1 前在所述基板 (10)中形成波纹状图案(10')。
14.权利要求13所述的方法，其中形成所述波纹状图案包括 -在所述基板(10)上沉积氧化硅层(12')；-在所述氧化硅层上沉积氮化硅层(50')； -图案化所述氧化硅层和氮化硅层，从而暴露所述基板的选定部分； -将所述选定的部分暴露至一系列蚀刻步骤以形成所述波纹状图案；以及 -移除所述氧化硅层和氮化硅层。
15.权利要求13所述的方法，其中所述波纹状图案通过以下方式形成L0C0S氧化步骤，随后是其中移除LOCOS氧化物的蚀刻步骤。
16.测定化学化合物的心脏毒性的方法，包括 -提供权利要求1-8中任一项所述的装置；-用含有所述化学化合物的介质填充所述容器06)以使所述心肌细胞08)暴露于所述化合物；以及-测量所述心肌细胞对所述暴露的反应。
17.根据权利要求1-8任一项所述装置用于药物靶标发现和/或药物开发的用途。
18.为由细胞拉伸导致或改变的疾病开发疾病模型的方法，所述方法包括以下步骤 -将至少一个细胞附着至粘性表面图案04)-通过外部施加的力拉伸所述至少一个细胞-以电学方式和/或光学方式测量所述至少一个细胞的动作电位，随时间监测和/或解析所述动作电位。
19.根据权利要求18的方法，其中所述至少一个细胞的所述拉伸相对于所述粘性表面图案是在面内和/或面外。
20.根据权利要求18-19的方法，其中面内细胞拉伸百分比大于30%并且拉伸时间是变化的。
21.根据权利要求18-20的方法，其中在测量期间添加化学或生物化合物。
22.根据权利要求18-21任一项的方法，其中所述疾病模型是心脏疾病模型。
全文摘要
公开的是用于测定化学化合物心脏毒性的装置，包含承载有可变形叠层(34)的基板(10)，所述叠层通过空腔(32)从所述基板部分分离以允许所述叠层的面外变形，所述叠层包含第一可变形层(16)、第二可变形层(20)和夹在所述第一和第二可变形层间的多电极结构(18)，所述第二可变形层承载有粘附其上的心肌细胞(28)的图案；以及安装在所述基板上的液体容器(26)，用于使所述心肌细胞暴露于所述化学化合物。还公开了制造这样的装置的方法。本发明进一步涉及所述装置用于药物靶标发现和/或药物开发的用途以及为由细胞的拉伸导致或改变的疾病开发疾病模型的方法，特别是心脏疾病模型。
文档编号C12N5/00GK102333856SQ201080007261
公开日2012年1月25日 申请日期2010年2月5日 优先权日2009年2月9日
发明者德 斯托尔佩 A·范, R·德克 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司