专利名称：甘蔗的着丝粒序列和微型染色体的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘蔗微型染色体和包含甘蔗着丝粒序列的重组染色体以及含有这些物质的甘蔗细胞及植株。背景将新遗传信息导入细胞(基因转化)的常规方法有两种。一种方法是把新遗传信息导入到另一个被称为“非整合型附着体载体”或者“微型染色体”的DNA分子中，这些DNA 分子可以离开宿主染色体DNA分子并作为独立个体(游离基因)而存活。非整合型附着体载体包含了细胞中DNA复制和维持附着体载体存活的所有必需的DNA序列片段。很多非整合型附着体载体可用于细菌细胞中(例如，参阅Maniatis等，《分子克隆实验手册》，纽约冷泉港实验室出版社1982年出版)。然而，目前只有少数一些能在高等真核细胞中使用的非整合型附着体载体是成熟的。高等真核细胞的非整合型附着体载体主要来自于自然界中存在的病毒。高等植物系统的双生病毒是双链DNA病毒，尽管双生病毒的DNA被限制在800bp 左右，这些双链DNA病毒还是通过基于非整合型附着体载体的双链媒介进行复制。虽然基于椰菜花叶病毒的非整合型附着体载体是成熟的，但是它携带新遗传信息的能力仍然有限 (Brisson 等人，《自然》310 :511，1984.)。遗传转化的另一种常规方法是将DNA序列嵌入到受体细胞染色体中，使得新的遗传信息可以作为天然染色体的一部分复制并分配到子代细胞中。在导入基因随机的嵌入到细胞染色体之前，可能会被分解并重新形成多种不同组合(参阅Wigler等人，细胞，11 223，1977)。此过程中常见的问题包括导入的DNA序列的重组，以及因转基因在宿主基因组中的插入位点不同而造成的基因表达水平的不可预测性，亦称“位点效应多样性”(参阅 Siing0等，分子细胞生物学.，6 1787，1986)。而且，被嵌入的DNA通常不能像游离DNA那样被准确的切除。整合转化的更精简的形式可通过开发出自然界存在的病毒导入到宿主染色体中，成为其生命循环的一部分来实现，比如逆转录酶病毒(参阅Chepko等人，细胞学， 37 :1053,1984)。常用的针对高等植物的遗传转化方法，是在植株被致病土壤细菌即土壤杆菌感染的过程中，将细菌DNA导入到植株染色体中(参阅Nester，Ann. Rev. Plant Phys. ,35 387-413,1984)。通过将目的基因代替一部分自然转移的细菌序列(转移DNA，即T-DNA) 的方法，研究人员可以将新DNA导入植株细胞中。然而，即便是这个更精简的整合转化体系也要受到以下三个方面的限制。第一，使用土壤杆菌T-DNA系统导入在植株细胞里的DNA 序列经常被重新排列(参阅Jones等人，Mol Gen. Genet.，207 :478，1987)。第二，被导入的DNA序列的基因表达在不同转化株之间存在个体差异(参阅Jones等人，Embo J. ,4 2411-2418,1985) 0这种个体差异可能是由重组序列以及植株染色体中处在其周围的序列的影响(例如位置效应)引起的，也有可能是受转基因甲基化作用的影响。最后，导入到染色体组中的外源分子可能会破坏基因、启动子或者使植物正常生长和功能所必需的其他遗传分子。另一种广泛用于植株的基因转化的方法是使用微粒轰击法把将NA序列嵌入到染色体组中。在这个过程中，将要导入到植株原始染色体中的含有需遗传分子的核酸被覆被在小金属颗粒(例如钨、钼、或重金属)的表面或者里面，这些小金属颗粒以高速度传递到植株组织或细胞中。然而，与土壤杆菌介导的基因转移中的类似问题又出现了，如上文中提到一样，嵌入的DNA的表达可能会无法预测，并且将外源分子嵌入到基因组中可能会破坏植株生长或对其生长产生负面影响。另一种更有吸引力的常用转化方法是使用人工染色体。人工染色体是独立存在于宿主基因组原始染色体中的游离的核酸分子。它们可呈线性DNA分子或者环状DNA分子， 这些分子含有顺式核酸序列，使其能够进行复制和分配。(参阅Murray等人，《自然》，305 189-193，1983)。所需的分子包括(1)复制起点一DNA复制起始的位点，(2)着丝粒一动粒装配的位置，它在有丝分裂和减数分裂过程中负责将复制后的染色体均等地分配到子细胞中，(3)若染色体呈线性，则其中存在染色体端粒一这种染色体端粒是存在于线性染色体末端的特殊的DNA结构，其功能是稳定染色体末端结构和促进DNA分子末端的完整复制。 其他的所需分子是染色质组织序列。据文献记载，在几乎所有的真核生物中，着丝粒在稳定染色体遗传中起至关重要的作用(参阅Nicklas 1988)。在有丝分裂和减数分裂过程中，着丝粒通过其结合蛋白质连接到纺锤丝上，从而保证细胞分裂过程中基因的正常分割。人工染色体可以由下两种方法得到。第一种方法是把所需染色体分子识别并整合到一个人造结构中。这被描述为“自下而上”的方法，它利用异源系统(例如细菌、真菌) 来进行整合人工染色体所需的各种克隆步骤。这种形式的人工染色体就是本应用中所提到的“微型染色体”。第二种是通过染色体碎片的方法从现有染色体中提取出人工染色体，随后选择性的加入包括转基因在内的所需分子。例如现有染色体通过诱导而破坏，继而产生染色体片段。在细胞分裂过程中，含有起遗传和分割作用分子的小片段(如着丝粒、复制起点、和/或染色体终端)能够被识别。这些获得的人工染色体可在随后的一个或多个转基因的再复制中用作靶子。这被描述为“自上而下”的方法，因为不需要使用试管克隆，故不需要异源系统(例如细菌、真菌)。这类的人工染色体是本文所提到的“重组染色体”。低等真核生物中构成人工染色体的主要染色体分子早已完成特征描述，近期也已经完成对于老鼠和人类染色体的特征描述。自主复制序列(ARSs)也已经从包括酿酒酵母 (啤酒酵母)和裂殖酵母等单细胞真菌中分离出来(参阅Minchcomb等人，1979和Hsiao 等人，1979)。ARS起复制起点的作用，即将含有ARS的DNA分子和引入到真菌细胞核中随其他基因组一起复制。虽然缺少着丝粒，包含了这些序列的DNA分子仍然可以复制，但是这种复制不能保证染色体以可控方式将染色体分配到子细胞中。人工染色体在酵母中通过三种必需的克隆染色体分子来组建(参阅Murray等人， 《自然》，305:189-193，1983)。然而在单细胞生物中并没有发现可以在真核系统中作用的必需遗传分子。例如酵母菌着丝粒序列在转化到真核细胞里以后，并不会出现稳定的遗传。比起过去对酵母菌的详细研究，高等真核细胞的功能性着丝粒DNA的研究少之甚少。超微结构研究表明高等真核细胞的着丝点是包含很多微管附着位点的大型结构，而这些着丝点是在细胞分裂晚前期形成在着丝点上的特异蛋白复合体(哺乳动物动粒板的直径大约是0. 3微米)(参阅Rieder，1982)。因此，虽然少量着丝粒所需的DNA功能会小很多，但是这些生物的着丝粒DNA区域相应地大一些。以上研究有助于阐明着丝粒的结构和功能，但是目前还尚不明确到底是来源于低等真核生物或者哺乳类高等真核生物的遗传信息适用于甘蔗。所以，有必要克隆甘蔗着丝粒，因为这将会成为甘蔗人工染色体成果或者识别甘蔗染色体重组的第一步。接下来还需要包含功能稳定的自主型人工染色体或重组染色体的甘蔗细胞、作物和子代来携带不同基因和遗传物质。
发明摘要本发明一方面着重介绍甘蔗的染色体包含一个甘蔗的着丝粒，而甘蔗着丝粒又由一个或者多个核苷酸重复序列组成。这种情况在此会作进一步详细描述。在一些实验案例中，这种微型染色体包含一个着丝粒，这个着丝粒又包含一个或者多个随机组合的重复核苷酸序列。这些核苷酸序列来源于甘蔗，包括从重复序列的甘蔗基因组DNA分离出来的物质以及合成序列。而在其他的实验案例中，本发明声称甘蔗重组了染色体。另一方面，本发明准备了改良的甘蔗植株或者“加强型染色体的”甘蔗植株。这些甘蔗植株包括功能稳定的、自主型人工微型染色体或重组染色体。本发明准备了已分离的甘蔗微型染色体。微型染色体包含一个着丝粒。着丝粒其中含有两份以上核苷酸重复序列，它起着分离子细胞的作用。核苷酸重复序列可能是短的甘蔗卫星序列(如SEQ ID NOS :1-201)、甘蔗卫星共有序列(如SEQ ID NO :202)或甘蔗卫星序列嵌段(如SEQ ID NO :204)。核苷酸重复序列也可以是较长的序列，如甘蔗逆转录转座子序列 CRS (如 SEQ ID NO :203)。本发明还准备了本发明中的含有多核苷酸、核酸、载体、甘蔗着丝粒的细胞，甘蔗人工微型染色体和/或甘蔗重组基因。一些实施例中用的是独立细胞。而其他具有代表性的实施例中用的是甘蔗细胞。因此，一方面本发明准备了一个多核苷酸，此多核苷酸中含有一个核苷酸序列，而这个核苷酸序列是从以下几组中筛选出来的(a) SEQ ID NOS :1-204中的任意核苷酸序列， (b)与 SEQ ID NOS :1-204 中任意序列至少 80%，85%，90%，95%，97%，98% or 99%相似的核苷酸序列，任选的核苷酸序列功能与甘蔗着丝粒相似(例如起分裂到子细胞的作用)，和/或(c)在严格条件(65°C的温度，在65°C时用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，时间为15分钟)下与SEQ ID NOS :1-204中任意核苷酸序列杂交的序列，任选的核苷酸序列功能与甘蔗着丝粒相似。另一方面，本发明准备了含有一个排列的核酸。此排列包括大约2个以上，大约10
个以上，大约100个以上......直到大约1000个的多核苷酸，或者从大约5个直到250份
多核苷酸。在代表性实施例中，此排列的长度在从大约11Λ到2001Λ之间，也可在151Λ到 28kb之间。在典型实施例中，核苷酸的功能与甘蔗着丝粒相似。此项发明进一步包含了一个甘蔗着丝粒，此甘蔗着丝粒由一个多核苷酸或者核酸组成。此项发明还准备了一个甘蔗人工染色体，此甘蔗人工染色体包含一个多核苷酸、核酸或者着丝粒。在一些实施例中，甘蔗人工染色体进一步由一个外源核酸(例如至少三个外源核酸)组成，其中至少一个可以随机地连接到甘蔗植株细胞的异源调控序列上。在一些更有代表性的实施例中，此发明展示了甘蔗人工染色体在甘蔗植株细胞的有丝分裂有效性至少为60 %，70 %，80 %，85 %，90 %，95 %或者更多。现有发明包括了一个载体，此载体由多核苷酸、核酸或甘蔗着丝粒、或者甘蔗人工染色体组成。另一方面，此项发明准备了一个含有多核苷酸、核酸或甘蔗着丝粒、甘蔗人工染色体或者载体的细胞。代表性实施例中用的是甘蔗植株细胞。在一些特殊实施例中，此项发明准备了一个甘蔗植株细胞，这个甘蔗植株细胞包括一个甘蔗人工染色体，其中甘蔗人工染色体并未融入甘蔗植株细胞的染色体组中。甘蔗植株细胞包含任意一个甘蔗人工染色体，而这个甘蔗人工染色体包含一个外源核酸，其中甘蔗植株细胞展示出一个与外源核酸表达连在一起的变异表型。这个变异表型可以做任何可观察和测量到的表型兴趣迁移。在典型实施例中，变异表型由本土基因的变异表达(如 增加或减少的表达)组成。在其他的一些实施例中，变异表型由外源基因的变异表达组成。在深层次上，此项发明准备了一个甘蔗植株组织、甘蔗植株、和/或一个含有甘蔗植株细胞的甘蔗植株部分。此项发明还准备了一个从此发明中的甘蔗植株获得的种子。此发明还研究了甘蔗植株子代。甘蔗植株子代包括甘蔗人工染色体，其中植株子代是此发明中含有甘蔗人工染色体的甘蔗植株繁殖的。另一方面，此发明准备了用本发明中甘蔗植株的方法。其中甘蔗植株含有甘蔗人工染色体，而甘蔗人工染色体又含有一个编码重组蛋白的外源核酸。此方法囊括了从植株生长到产生重组蛋白质的整个过程。此外，此方法还可以选择性地进一步包括收获和/或加工甘蔗作物。 在典型实施例中，此发明为甘蔗植物细胞提供了一个甘蔗微型染色体。此染色体包括一个甘蔗着丝粒。而甘蔗着丝粒中又包含了至少两份核苷酸重复序列。这些核苷酸重复序列在一定条件(65°C杂交，65°C的温度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，时间为15 分钟)下杂交到SEQ ID NOS :1-204包含的核苷酸序列中。其中着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。或者，杂交条件是在65°C恒温，650C的温度下用0. 25x SSC, 0. 1 % SDS清洗三次， 时间为15分钟。在其他一些典型实施例中，此发明准备了一个含有甘蔗微型染色体的甘蔗植株细胞。这个甘蔗微型染色体包括一个甘蔗着丝粒。其中着丝粒至少两份核苷酸重复序列。这个序列与SEQ ID NOS :1-204中选取的一个核苷酸序列至少80%相同。其中着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。此发明还提供一个含有甘蔗微型染色体的甘蔗植株细胞，其中重复的核苷酸序列包含了一段与SEQ ID NOS :1-204中选取的一段核苷酸序列至少85%、90%、 95%、98% 相同。在另一些实施例中，此发明准备了一个甘蔗植株细胞。它包含一个甘蔗应用微型染色体。而这个甘蔗应用微型染色体又由至少两份核苷酸重复序列组成。此核苷酸重复序列要与SEQ ID NOS :1-204中任意一段核苷酸序列至少80%相似，或者在严格条件(65°C恒温，在65°C的条件下用0. 25x SSC, 0. 1 % SDS清洗三次，时间为15分钟)下与SEQ ID NOS 1-204中的任意一段核苷酸序列杂交。此甘蔗应用微型染色体还包括一个转基因表达盒。在更进一步的实施例中，此发明准备了一个含有甘蔗微型染色体的甘蔗植株细胞。这个甘蔗微型染色体包括一个甘蔗着丝粒。其中，着丝粒包括(a)至少两份甘蔗卫星核苷酸序列(如SEQ ID NO 204), (b)至少两份甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO :203)。 其中着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。在其他一些实施例中，此发明准备了一个含有甘蔗微型染色体的甘蔗植株细胞。此甘蔗微型染色体含有一个甘蔗着丝粒。其中着丝粒包括 (a)甘蔗卫星核苷酸序列的至少一个阵列，(b)甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO :203)的至少一个阵列。其中着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。甘蔗卫星核苷酸序列可能会是SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204中的一段序列，也可能是一定条件(65°C杂交，65°C温度下用0. 25x SSC，0. SDS清洗三次，共十五分钟)下杂交的序列，还可能是与SEQ ID NOS 1-202和SEQ ID NO :204中选取的核苷酸序列80%相似的序列。另外，此项目准备了一个含有甘蔗应用微型染色体的甘蔗植株细胞。此甘蔗应用微型染色体包含一个甘蔗着丝粒，其中甘蔗着丝粒包含了(a)在11Λ核苷酸序列范围内的至少五份核苷酸重复序列，其中核苷酸重复序列与SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204中的任意一段核苷酸序列有80%相同，或是与SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204中任一段核苷酸序列在严格条件(65°C杂交，65°C温度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分钟)下杂交；(b)至少两份核苷酸重复序列在长度上与SEQ ID NO 203中一段核苷酸序列至少80%相同，或是与SEQ ID而203中任一段核苷酸序列在严格条件(651杂交，651 温度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分钟)下杂交。在另一些实施例中，此项目准备了一个甘蔗植株细胞。它含有(a) —个转录为核糖核酸I的多核苷酸序列、(b) 一个转录为核糖核酸II的多核苷酸序列、(c) 一个转录为核糖核酸III的多核苷酸序列。其中多核苷酸序列的转录会导致甘蔗植株的生物量增加。在附加的实施例中，此发明准备了一个含有转基因表达盒的甘蔗植株细胞。这个转基因表达盒不融入在植株细胞基因组里面。其中转基因表达盒包含了(a) (a) 一个转录为核糖核酸I的多核苷酸序列、(b) —个转录为核糖核酸II的多核苷酸序列、(c) 一个转录为核糖核酸III的多核苷酸序列。其中多核苷酸序列的转录会导致甘蔗植株的生物量增加。此项发明准备了一个包含有重组染色体的甘蔗植株细胞。此重组染色体由至少两份核苷酸重复序列组成。其中着丝粒起分离子代的作用。核苷酸重复序列可能是短小的甘蔗卫星序列(如SEQ ID NOS :1-201)，也可能是甘蔗卫星共有序列(如SEQ ID NO :202)或者甘蔗卫星序列块(如SEQ ID NO :204)。核苷酸重复序列也有可能是较长的序列，例如甘蔗逆转录转座子序列CRS (如SEQ ID NO :203)。在典型的实施例中，此项发明准备了一个包含有重组染色体的甘蔗植株细胞。此重组染色体包含一个甘蔗着丝粒，而甘蔗着丝粒又包含了至少两段核苷酸重复序列。这个核苷酸重复序列中至少有一段序列是与SEQ ID NOS :1-204中挑选出来的任意一段核苷酸序列在一定条件(65°C杂交，65°C温度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分钟) 下杂交而得到的。其中，着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。或者杂交条件可替代为65°C杂交，65°C温度下用0. 25x SSC,0. 1% SDS SDS清洗三次，共十五分钟。在另一个典型的实施例中，此项发明准备了一个包含有重组染色体的甘蔗植株细胞。此重组染色体包含至少两段核苷酸重复序列。这个重复核苷酸序列中至少有一段序列要与SEQ ID NOS :1-204挑选出来的核苷酸序列至少80%相同。这个核苷酸重复序列还包括含有至少三个外源核酸的转基因表达盒。此项发明还提供了甘蔗重组染色体，其中核苷酸重复序列包括一段与SEQ ID NOS :1-204中挑选出的核苷酸序列至少有85^^90^^95% 或者98%相似的序列。在另外的实施例中，此项发明准备了一个包含有重组染色体的甘蔗植株细胞。这个重组染色体由一个甘蔗着丝粒组成。其中此着丝粒包括(a)至少两份复制的甘蔗卫星核苷酸序列(b)，至少两份复制的甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO :203)，其中着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。在另一实施例中，此项发明准备了包含有甘蔗着丝粒的甘蔗重组染色体。其中着丝粒包括(a)甘蔗卫星核苷酸序列中的至少一组排列，(b)甘蔗CRS核苷酸序列(SEQ ID NO 203)中的至少一组排列，其中着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。甘蔗卫星核苷酸序列可能是SEQ ID NOS :1-202或SEQ ID NO :204所示的任一序列，也可以是在一定条件(65°C杂交，65°C温度下用0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分钟)下与SEQ ID NOS :1-202 和 SEQ ID NO :204 杂交出来的序列，还可能是 SEQ ID NOS 1-202 与 SEQ ID NO: 204中筛选出来的核苷酸序列80%相同的序列。另外，此项还发明准备了由重组染色体组成的甘蔗植株细胞。此重组染色体中不供养在外源有机体的细胞里。在另一实施例中，此项发明准备了一个甘蔗植株细胞。它包含(a)至少两份复制的重复核苷酸序列，此序列应与SEQ ID NOS :1-204中任一核苷酸序列至少80%相同，或与 SEQ ID而5:1-204中任一核苷酸序列在严格条件(651杂交，651温度下用0.251 SSC, 0. 1% SDS清洗三次，共十五分钟)下杂交而获得的序列；(b)含有至少三个异源核酸的转基因表达盒，其中核苷酸序列和转基因表达盒不融入到甘蔗植株细胞的基因组中。此项发明还准备了含有甘蔗微型染色体的甘蔗植株细胞。此甘蔗微型染色体含有一个甘蔗着丝点，其中着丝点包含重复核苷酸序列的两个以上的人工合成重复序列或一个人工合成的排列。这个排列中又包含了两份复制的重复核苷酸序列。其中着丝粒起分离甘蔗子细胞的作用。这些人工合成的重复核苷酸序列基于天然甘蔗着丝粒序列的序列信息、 天然甘蔗着丝粒序列的组合或片段，包括不等长序列重复的组合、不同序列的组合、不等长及不同序列重复的组合、不同人工合成序列的组合或天然甘蔗着丝粒序列与人工合成序列的组合。甘蔗重复序列及其合成排列中的含有合成排列的多核苷酸可能会通过已知的技术 (包括PCR)而从甘蔗基因组DNA (或它的克隆)或特定的寡核苷酸合成而产生。此项发明准备了甘蔗微型染色体或者重组染色体。其中任一染色体包含一个着丝粒，而着丝粒中又包含长度大约在11Λ到2001Λ、11Λ到IOOWk 11Λ到101Λ、21Λ到121Λ、51Λ 到、101Λ到501Λ、251Λ到1001Λ范围内的重复核苷酸序列。此项发明深思了本发明中任一甘蔗微型染色体或者重组染色体的着丝粒，这些着丝粒至少有 300bp, 400bp, 500bp, 600bp, 700bp, 750bp, Ikb, 1. 5kb，2kb，2. 5kb，3kb，3. 5kb, 4kb，4. 5kb，5kb，5. 5kb，6kb，6. 5kb，7kb，7. 5kb，8kb，8. 5kb，9kb，9. 5kb, IOkb, 10. 5kb, llkb, 11. 5kb, 12kb,12. 5kb,13kb,13. 5kb,14kb,14. 5kb,15kb,16kb,17kb,18kb,19kb,20kb, 25kb,30kb,35kb,40kb,45kb,50kb,60kb,70kb,80kb,90kb,IOOkb,IlOkb,120kb,130kb, 140kb,150kb,160kb,170kb,180kb,190kb,200kb,225kb,250kb,275kb,300kb,325kb,350kbor 375kb.另一实施案例中，本发明中的所有甘蔗微型染色体或重组染色体的着丝粒都包括 η个重复核苷酸序列副本，其中η小于2000、小于1000、小于500、小于400、小于300、小于 250、小于200、小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于 24、小于20、小于15、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6或者小于5。某一具代表性的实施案例中，本发明中的甘蔗微型染色体的着丝粒都包括η个重复核苷酸序列副本，其中η至少为 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、 600、650、700、750、800、850、900或者1000。在另一具代表性的实施案例中，本发明中的所有甘蔗微型染色体或重组染色体着丝粒都包括η个重复核苷酸序列副本其中η的范围为2 到 10、2 到 20、2 到 50、2 到 100,2 到 250,2 到 500,2 到 1000,5 到 15、5 到 25、5 到 50、5 到 100,5 到 250,5 到 500,5 到 1000、15 到 25、15 到 50、15 到 100、15 到 250、15 到 500、15 到 1000、25 到 50、25 到 100、25 到 250、25 到 500、25 到 1000、50 到 100、50 到 250、50 到 500、 50 到 1000、100 到 250、100 到 500、100 到 1000、250 到 500、250 到 1000、或者 500 到 1000。本发明的某一实施案例中，本发明中的任何甘蔗微型染色体或重组染色体均含有一个着丝粒，该着丝粒包括至少5个“头尾相接”连续重复的核苷酸序列(比如.，SEQ ID NO :204)。本发明的某一实施案例中，本发明中的所有甘蔗微型染色体或重组染色体均包括一个着丝粒，着丝粒含有5个以串联形式存在的连续重复的核苷酸序列副本，其中任何重复序列在各个方向上与其他重复序列紧邻，比如从头到尾、从尾到尾、从头到头。本发明中还提出了所有甘蔗微型染色体或重组染色体都包含一个着丝粒，着丝粒都包括至少5个连续重复的核苷酸序列。其中，“连续”是指相同或相近的重复核苷酸序列(比如至少70%完全相似)一个接一个，不会因其他重要的序列元素而中断。连续重复的核苷酸序列全方位相互紧邻，如头尾相接、尾尾相接、头头相接(比如间距可能为l_50bp)。本发明进一步指出，本发明中的所有甘蔗微型染色体或重组染色体都含有一个着丝粒，着丝粒包括至少5个连续重复核苷酸序列，这些序列被少于η个的核苷酸分隔开(如 SEQ ID NO :204)，其中η的范围从1到10、或者1到20、或者1到30、或者1到40、或者1 到50、或者其中的η少于10bp、或者η少于20bp、或者η少于30bp、或者η少于40bp、或η 少于50bp。本发明提出本发明中的所有甘蔗微型染色体或重组染色体都包括一个着丝粒，着丝粒包括至少2列连续重复的核苷酸序列(比如，SEQIDNO :204)，其中列包括至少2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、 500、600、700、800、900、1000或者2000个重复核苷酸序列。一个序列中的重复可能全方位相互连接，如头尾相接、尾尾相接、头头相接。序列可能会被少于η个的核苷酸分隔开，其中 η范围是1到10、或者1到20、或者1到30、或者1到40、或者1到50、或者1到60、或者1 到70、或者1到80、或者1到90、或者1到100、或者其中η少于10bp、或者η少于20bp、或者η少于30bp、或者η少于40bp、或η少于50bp。两组序列包括相同的重复核苷酸序列或者两个不同的重复核苷酸序列(比如第一组序列由重复类型1组成，第二组阵列由重复类型2组成，其中“类型1，，和“类型2”可以任意指定)。 本发明的某一实施案例中，本发明中的任何甘蔗微型染色体或重组染色体的长度等于或小于IOOOWk等于或小于9001Λ、等于或小于8001Λ、或等于或小于7001Λ。在某一具代表性的实施案例中，甘蔗微型染色体长度等于或小于6001Λ、长度等于或小于5001Λ、长度等于或小于2501Λ、长度等于或小于IOOWk长度等于或小于501Λ、长度等于或小于IOWK 长度等于或小于51Λ、抑或长度等于或小于11Λ。比如，本发明中的甘蔗微型染色体长度为 50到2501Λ、长度为50到1001Λ、长度为50到751Λ、长度为50到1001Λ、长度为60kb到 851Λ、长度为70到901Λ、长度为75到1001Λ、长度为100到2501Λ、长度为250到500kb、 长度为500到10001Λ。某一具代表性的实施案例中，甘蔗微型染色体长度为观吐、长度为 421Λ、长度为821Λ、长度为871Λ、长度为881Λ、长度为971Λ、长度为1301Λ、长度为1501Λ、长度为2001Λ或者长度范围为观-200吐。在本发明中，在有丝分裂过程中，微型染色体的隔离效率最好不低于60%，不低于80%，不低于90%或不低于95%，以及/或者在减数分裂过程中，传播效率最好不低于60 %，不低于80 %，不低于85 %，不低于90 %或者不低于95 %。在有丝分裂过程中，本发明中的甘蔗微型染色体或重组染色体的隔离效率至少不低于60 %、80 %、90 %或者95 %，并且/或者在减数分裂过程中的传输效率最好不低于比如 60%，80%，85%，90% 或者 95%。另一实施案例中，本发明中的甘蔗微型染色体或重组染色体包括一个特定的重组
点ο本发明还提出了一种甘蔗微型染色体，其中微型染色体来自于供体克隆或着丝粒克隆。相比核苷酸序列的供体克隆或着丝粒克隆，微型染色体可以将一个或多个核苷酸进行替换、删除、插入、复制或者排列。某一实施案例中，甘蔗微型染色体是通过一个或者多个母体的甘蔗微型染色体传代得到的。另一实施案例中，微型染色体是通过两个或者多个不同母体的甘蔗微型染色体传代得到的。母体可从特定组中，这个组包括病毒、细菌以及酵母。另一实施案例中，甘蔗微型染色体通过体外培养的方法从供体克隆中获得，，具体过程是将序列异变或它的互补序列导入基于模板的供体克隆复制过程。另一实施案例中，序列异变通过一种依赖于DNA的DNA聚合酶导入。又另一个实施案例中，通过体外培养方法得到的甘蔗微型染色体将通过一个或多个母体的微型染色体传代进一步改变微型染色体。本发明还提供了至少包括一个外源性核酸的微型染色体的甘蔗微型染色体或重组染色体。某具代表性的实施案例中，甘蔗微型染色体或重组染色体包括不少于2个、不少于3个、不少于4个、不少于5、不少于10个、不少于20个、不少于30、不少于40、不少于50 个外源性核酸。某一实施案例中，本发明中的所有甘蔗微型染色体或者重组染色体中的至少一个外源性核酸可连接到一个植物细胞中的异源调控功能序列，该序列可以是植物调控序列或其它序列。本发明提供提供了连接到一个非植物，比如节肢动物、病毒、细菌、脊椎动物或者酵母的调控序列的外源性核酸。此外，本发明还提供提供了一个连接到一个来自甘蔗调控序列的外源性核酸。本发明还提供了包括了一个或一组基因的微型染色体或者重组染色体，以提高总的甘蔗产糖量。这些基因可用于增加蔗糖中茎汁糖浓度、蔗汁总量、茎强度、产量、以及植物生物物质总量。这种基因来自于细菌序列，如蔗糖异构酶，也可以来自动物、植物真菌、或原生生物序列。这些基因可能包括参与糖类代谢或糖类运输的基因、或参与到糖类代谢和运输中发挥作用未知，但是已被证明是可增加总产糖量的基因。它还可能包括影响植物高度、茎秆直径、水代谢或者生物质总量的基因及可能平衡淀粉和糖量的基因。通过多个这种基因实验证明它们能提高糖积累。比如，一种细菌蔗糖异构酶能将蔗糖含量提高两倍之多 (Birch,R. G. , and Wu，L (2007). Doubled sugar content in Sugarcane plants modified to produce a sucrose isomer. Plant Biotechnology Journal 5:109-117)。木质素欠缺的“褐色叶中脉”突变通过对木质素的作用能提高高粱含糖量，这是由高粱基因组中肉桂醇脱氢酶(CAD)突变、及高粱基因组中包含的类似14CAD的基因所造成的(Saballos， Α.，Ejeta，G.，Sanchez,Ε.，Kang, C.，and Vermerris，W. (2008). A Genome-Wide Analysis of the Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Family in Sorghum(Sorghum bicolor(L.) Moench)Identifies SbCAD2 as the Brown midrib6 Gene. Genetics)。另一实施案例中，甘蔗微型染色体或者重组染色体包括一个具有所需特性的QTL 的外源性核酸。在蔗糖中，影响总产糖量的QTL的基因图谱已经被绘制了出来(Murray， S. C.，Sharma, A.，Rooney, W. L，Klein，P.，Mullet，J. Ε.，Mitchell，S. Ε.，Kresovitch， S. (2008)Genetic Improvement of Sorghum as a Biofuel Feedstock :I.QTL for Stem Sugar and Grain Nonstructural Carbohydrates. Crop Sci. 48 :2165-2179)。另一实施案例中，甘蔗微型染色体或者重组染色体包括一个外源性核酸，核酸使甘蔗具有抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆性等特性。本发明提供了包括一个外源性核酸的甘蔗微型染色体或重组染色体，外源性核酸能甘蔗具有抗草丁琳或者草甘膦除草剂等特性。非限定的例子包括一个外源性核酸，它能起到膦乙酰转移酶、草甘膦乙酰转移酶、乙酰羟基酸合成酶编码或突变的烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶。非限定性的例子还包括能使甘蔗具有抗虫性的外源性核酸，它包含苏云金芽孢杆菌毒素基因或蜡样芽胞杆菌毒素基因。在相关的实施案例中，甘蔗微型染色体或者重组染色体包含一个使甘蔗具有抗除草剂特性的外源性核酸、一个能够使甘蔗具有抗虫性特性的外源性核酸，并至少增选一个外源性核酸。本发明还提供了携带甘蔗基因组中已发现的新增基因副本的甘蔗微型染色体或者重组染色体。本发明还提供了额外甘蔗基因副本，该副本是甘蔗微型染色体或者重组染色体携带，并能连接到它们的原生调控序列或者异源调控序列。本发明还提供了包括一个外源性核酸的甘蔗微型染色体或者重组染色体。该核酸能使甘蔗具有抗旱、抗热、抗冷、抗冻、抗过度湿润、抗紫外线、抗电离辐射、抗毒素、抗污染、 抗机械应力或者抗盐分失调等特性。本发明还提供了一个甘蔗微型染色体，它包括一个能使甘蔗具有抗病毒、抗细菌、抗真菌或线虫特性的外源性核酸。本发明提供了甘蔗微型染色体或者重组染色体，它们包括一个从以下的组中选出的外源性核酸一个固氮基因、一个植物胁迫诱导基因、一个营养利用基因、一个影响植物色素沉着的基因、一个编码一种反义或核酶分子的基因、一个编码一种分泌抗原的基因、一个毒素基因、一个感受基因、一个配体基因、一个种子贮藏基因、一个生长素基因、一个酶基因、一个白细胞介素基因、一个凝血因子基因、一个细胞因子基因、一个抗体基因、一个生长因子基因、一个转录因子基因、一个转录抑制基因、一个DNA结合蛋白基因、一个重组基因、 一个基因复制基因、一个程序性细胞死亡基因、.一个激酶基因、一个磷酸酶基因、一个G蛋白基因、一个细胞周期蛋白基因、一个细胞周期调控基因、一个参与转录的基因、一个参与翻译的基因、一个参与核糖核酸处理的基因、一个参与RNA干扰的基因、一个细胞器基因、一个细胞内转运基因、一个完整的膜蛋白基因、一个转运基因、一个膜通道蛋白基因、一个细胞壁基因、一个参与蛋白质加工的基因、一个参与蛋白质修饰的基因、一个参与蛋白质降解的基因、一个参与新陈代谢的基因、一个参与生物合成的基因、一个参与氮或其他元素或营养素同化的基因、一个参与碳通量控制的基因、一个参与呼吸的基因、一个参与光合作用的基因、一个参与光感应的基因、一个参与器官形成的基因、一个参与胚胎发育的基因、一个参与分异作用的基因、一个参与减数分裂驱动的基因、一个参与自交不亲和性的基因、一个参与发展的基因、一个参与营养、代谢或矿物质转运的基因、一个参与营养、代谢产物或矿物质存储的基因、一个钙结合蛋白基因、或一个胶质结合蛋白基因。本发明还提供了一个甘蔗微型染色体或重组染色体，它们包括一个从以下组中选出的外源性酶基因一个参与代谢生化废物用于生物修复的酶编码基因、一个改性途径生产次生植物代谢物的酶编码基因、一个生产一种药物的酶编码基因、一个改善植物营养成变化的酶编码基因、一个参与维生素合成的酶编码基因、一个参与碳水化合物、多糖或淀粉合成的酶编码基因、一个参与矿物质积累或可用性的酶编码基因、一个肌醇六磷酸酶编码基因、一个参与脂肪酸、脂肪或油分合成的酶编码基因、一个参与化学品或塑料合成的酶编码基因、一个参与燃料合成的酶编码基因、一个参与芬芳合成的酶编码基因、一个参与香料合成的酶编码基因、一个参与颜料或染料合成的酶编码基因、一个参与碳氢化合物合成的酶编码基因、一个参与结构或纤维复合合成的酶编码基因、一个参与一种食品添加剂合成的酶编码基因、一个参与一种化学杀虫剂合成的酶编码基因、一个参与驱蚊剂合成的酶编码基因、或一个控制植物碳通量的基因。本发明的另一实施案例中，本发明中的所有甘蔗微型染色体或者重组染色体都包括了一个端粒。本发明中也提供了所有甘蔗微型染色体或者重组染色体都呈线状或环状的实施案例。一个实施案例中，本发明提供的甘蔗植株或者植物细胞中包括了本发明中的所有甘蔗微型染色体或重组染色体。本发明也提供了利用本发明长成的甘蔗植株组织和甘蔗种子。另一实施案例中，本发明提供的甘蔗植株中包含本发明提供的所有甘蔗微型染色体或者重组染色体，这里称之为“近染色体”甘蔗植株。此外，本发明提供了从这些转基因植株中提取的甘蔗植物细胞、组织和种子。一个实施案例中，本发明提供了一个甘蔗植物细胞，它包含了本发明中的所有甘蔗微型染色体或者重组染色体。这些细胞满足(1)并未被融入到甘蔗植物细胞中；(2)赋予甘蔗植物细胞改变表型的特性，甘蔗植物细胞与它与甘蔗微型染色体内至少一个结构基因的表达相关。改变表型包括增加原生基因的表达、减少原生基因的表达或外源基因的表达。另一实施案例中，这些甘蔗植物细胞也包括一个或者多个组合外源结构基因。本发明的另一实施案例是本发明中任一甘蔗植株实施案例的一部分。本发明中的具代表性的甘蔗植株部分包括一荚、根、种根、苗根、原基根、苗、初生苗、次生茎、吊穗、穗、 箭状物、中脉、叶片、叶舌、外耳、赘肉、叶片联合、鞘、节点、节间、芽睦、叶痕、切害I]、块茎、干、 主茎、果实、浆果、坚果、花、叶、茎皮、木质部、表皮、输导组织、器官、原生质体、冠、愈伤组织培养、叶柄、花瓣、萼片、雄蕊、柱头、中柱、花蕾、分生组织、形成层、皮层、木髓、鞘、丝光包裹体、胚珠或胚胎。其他具代表性的甘蔗植株部分包括一性母细胞、或配子、或胚珠、或花粉、 或此处描述的任何植物的内胚乳。其他具代表性的植物部分包括一粒种子、一个种子件、胚胎、原生质体、细胞群，任一植物细胞组合都能构成本发明中任一甘蔗植株的结构和功能单位、再生芽或繁殖体。本发明的一个实施案例是本发明中所有甘蔗植株实施案例的子代。本发明的这些子代可能是自我繁殖、杂交育种、无融合生殖或克隆繁殖的结果。在具代表性的实施案例中，本发明还提供了子代，子代包括一个甘蔗微型染色体或者一个重组染色体，而这两个染色体则源自于包含着丝粒的父本甘蔗微型染色体或者重组染色体，该染色体的长度分别小于约 10001Λ、750kb、600kb、500kb、400kb、300kb、250kb、200kb、150kb、IOOkb、90kb、851Λ、 80kb、75kb、70kb、65kb、60kb、55kb、50kb、45kb、40kb、35kb、30kb、25kb、20kb、15kb、12kb、 10kb、7kb、5kb、或者 2kb。另一方面，本发明提出了提取一个微型甘蔗染色体的方法，该染色体可用于本发明中的所有甘蔗植株。在具代表性的实例中，这些方法包括用各种不同的探针确定一个甘蔗基因组DNA库中一个着丝粒的核酸序列、构建一个含有丝粒核苷酸序列的甘蔗微型染色体，还可能包括使用多种不同的探针在甘蔗基因组核酸库中确定基因组克隆多重杂交的杂交分数、根据至少两种不同探针得出的杂交评分确定甘蔗基因组核酸库的基因组克隆的分类、以及在构建甘蔗微型染色体的一个或多个分类中选择一个或多个基因组克隆。本发明还建立一个用本发明中的任一甘蔗植株生产一种重组蛋白的模板方法。实现这一方法要通过种植一种含有一个甘蔗微型染色体或重组染色体的甘蔗植株，它们都含有可对所需的重组蛋白进行编码的外源性核酸。人们可以有选择性地采集甘蔗植株，并从该植株中分离出所需的蛋白产物。具代表性的蛋白产物包括工业用酶，例如用于生物燃料生产的工业用酶。本发明还创建了一种采用本发明中的任一甘蔗植株来制成一种化工产品的模板方法。这个方法的实现需要通过种植一种含有一个甘蔗微型染色体或重组染色体的甘蔗植株。这两种染色体中含有可对某种酶进行编码的外源性核酸，这种酶能参与化工产品合成。 人们可以有选择地收割甘蔗植株并从中分离出所需的化工产品。具代表性的化工产品包括蔗糖、胶质和可用于生物燃料生产的碳水化合物。另一方面，本发明提供了使用本发明中的任一含有一个甘蔗微型染色体或重组染色体的甘蔗植株生产食品产品、医药产品或者化工产品的方法。这种方法是根据一种适当的外源性核酸，这种核酸存在于种植的甘蔗植株或植物细胞中。植株可将其产物分泌到生长环境中，或植株本身就含有这种产物，在这种情况下，植株就可以进行收割，并且提取出想要的产物。本发明还计划创建一种采用本发明中的任一含有一个甘蔗微型染色体或重组染色体的甘蔗植株生产转基因食品的方法。这种方法是通过比如种植一种含有能改变植物的营养成分的外源性核酸的植株、收割或处理甘蔗植株实现的。本发明还提供了构建一个重复核苷酸序列合成并具有甘蔗着丝粒的功能的阵列的方法。这一方法包括如下步骤(a) PCR扩增一个甘蔗随体序列，(b)将PCR扩增的随体序列克隆入对应克隆载体，(c)对克隆的随体DNA进行排序，(d)使用含有不对称识别序列的限制性内切酶，从克隆载体切除克隆的随体序列，(e)将一个随体序列绑定到另一个随体序列序列上，形成一个合成阵列(f)将合成阵列绑定到甘蔗微型染色体骨干载体上。本发明还提供了一个隔离的甘蔗微型染色体，它包括一个按照本发明方法构建的重复核苷酸序列合成阵列。甘蔗植物细胞和甘蔗植株均含有这种微型染色体。另一实施案例中，本发明还提供了一种将一个甘蔗细胞与一个甘蔗微型染色体接触的方法，步骤如下(a)向一个甘蔗植株茎秆顶端区域的不成熟分异叶释放微型染色体， 其中每个微型染色体包括一个选择标记基因，(b)选择含有标记基因的甘蔗细胞，其中含有标记基因表明了微型染色体的转化。本方法使用的是不成熟但完全分异的叶子，比如甘蔗茎秆的不成熟内叶。在某一具代表性的实施案例中，可用含有甘蔗微型染色体的超细微粒子辐射不成熟叶的方法释放微型染色体。本发明还提供了一种经甘蔗微型染色体改造的甘蔗植株再生的方法，其步骤如下(a)获取一个含有用本发明中的任一方法改造的甘蔗细胞的愈伤组织，(b)在聚乙烯吡咯烷酮浓度为-3%的介质中将愈伤组织培育成经甘蔗微型染色体改造的幼苗。另一实施案例中，愈伤组织的培育方法包括两个步骤，先将细胞放入液体介质培育一段时间，随后放入固体培养基培育。某一具代表性的实施案例中，甘蔗微型染色体含有一个生长调控基因，比如生长素生物合成或途径感知基因。这种类型的基因可能包括iaaMCTrp单氧化酶)， iaaH(吲哚_3_乙酰胺水解酶)，以及ipt (AMP异戊烯基转移酶)。当这三种基因同时在微型染色体中表达的时候，IaaM将Trp转化成吲哚_3_乙酰胺，IaaH将吲哚_3_乙酰胺转化成植物生长素，Ipt将AMP转化成细胞分裂素。这三种基因的表达允许培养细胞在没有外源性激素的情况下发育。本发明的另一实施案例是一个包括两个重复的核酸的甘蔗人工染色体。该核酸与 SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。本发明的另一实施案例是植物细胞。该细胞包括一个包括两个重复的核酸的甘蔗人工染色体。该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。该植物细胞可以成为一个甘蔗植物细胞。本发明的进一步实施案例是一个包括两个重复的核酸的甘蔗人工染色体。该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为 98%。其中，重复方向是从特定组中选出的，这些组包括从头到尾、从尾到尾、从头到头。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%的。还有其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。本发明的另一实施案例是一个甘蔗人工染色体。它包括一个长度至少为151Λ的核酸，而该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。本发明的另一实施案例是一个植物细胞，它包括一个长度至少为151Λρ的核酸。该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。在其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。 另外一些实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。这些植物细胞可以成为一个甘蔗植物细胞。本发明的另一实施案例是一个甘蔗人工染色体，它包括一个长度至少为^lcbp的核酸，该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。本发明的另一进一步实施案例是一个植物细胞，它包括一个长度至少为151Λ的核酸，该核酸与SEQ ID NO :204相比较， 同源性至少为98%。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204至少具有95%的同源性。还有其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。植物细胞可以是一个甘蔗植物细胞。
本发明的另一实施案例是一个包括一个着丝粒的甘蔗人工染色体。改着丝粒包括两个重复的核酸，而该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。本发明的另一更进一步的实施案例是一个包括一个着丝粒的甘蔗人工染色体的植物细胞。其中着丝粒包括两个重复的核酸，该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。植物细胞可以是一个甘蔗植物细胞。本发明的另一进一步实施案例是一个包括两个重复的核酸的着丝粒的甘蔗人工染色体。该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%，其中重复方向从下列组中选出，包括从头到尾、从尾到尾、从头到头。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO 204相比较，同源性至少为95%。另外一些实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。本发明的另一实施案例是一个包括一个长度至少为151Λρ的核酸的着丝粒的甘蔗人工染色体。该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。本发明的另一实施案例是一个包括一个长度至少为151Λ的核酸的着丝粒的植物细胞，它，该核酸与SEQ ID NO 204相比较，同源性至少为98%。植物细胞可以是一个甘蔗植物细胞。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。另一些的实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。本发明的另一实施案例是一个孤立核酸，它与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。本发明的另一实施案例是一个植物细胞，它包括一个孤立核酸，核酸与SEQ ID NO 204相比较，同源性至少为98%。植物细胞可以是一个甘蔗植物细胞。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。另外的实施案例中，核酸与SEQ ID NO: 204相比较，同源性至少为99%。本发明的另一实施案例是一个孤立核酸，它包括至少两个重复的核酸，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。本发明的另一实施案例是一个植物细胞，它包括一个孤立的核酸，核酸包括至少两个重复的核酸，它与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为 98%。植物细胞可以是一个甘蔗植物细胞。某一进一步的实施案例是一个孤立核酸，它包括至少两个重复的核酸，该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%，其中，重复方向是从特定组中选出的，这些组包括从头到尾、从尾到尾、从头到头。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。另外的实施案例中，核酸与SEQ ID NO: 204相比较，同源性至少为99%。另一实施案例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞方法，它包括制备一个包括至少两个副本的核酸的步骤，该核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。使用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。制备一个甘蔗植物细胞，其中的核酸在甘蔗植物细胞分裂时是自主复制的。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。另一些实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。另一实施案例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞的方法， 它包括获取一个核酸的步骤，而核酸包括一个长度至少为151Λρ的核酸，它与SEQ ID NO 204相比较，同源性至少为98%。使用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。获取一个甘蔗植物细胞，其中，核酸在甘蔗植物细胞分裂时是自主复制的。在其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。另一些实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。
另一实施案例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞方法，它包括制备一个核酸的步骤，这个核酸包括一个长度至少为^lcbp的核酸，它与SEQ ID NO: 204相比较，同源性至少为98%。使用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。获取一个甘蔗植物细胞，其中的核酸在甘蔗植物细胞分裂时是自主复制的。在其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。另一些实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。另一实施案例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞方法，它包括获取一个核酸的步骤，这个核酸包括至少两个重复的核酸，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。使用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。获取一个甘蔗植物细胞，其中，核酸在甘蔗植物细胞分裂时是自主复制的。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。还有其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。另一实施案例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞方法， 它包括获取一个核酸的步骤，这个核酸中包括一个着丝粒，着丝粒又包括一个长度至少为 151Λ的核酸。它与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。使用核酸对甘蔗植物细胞进行改造，并制备一个甘蔗植物细胞，其中，核酸在甘蔗植物细胞分裂时是自主复制的。其他实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。另一些实施案例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。另一实施例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞的方法，它包括获取一个核酸的步骤，这个核酸包括一个长度至少为^lAp核酸的着丝粒，这个核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。采用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。制备一个甘蔗植物细胞，其中的核酸在甘蔗植物细细胞分裂时是自主复制的。在其他实施例中， 核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。还有其他实施例中，核酸与SEQ ID NO: 204相比较，同源性至少为99%。另一实施例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞的方法，它包括如何获取一个至少包括两个重复核酸的核酸的步骤，这种重复核酸与SEQ ID NO 204 相比较，同源性至少为98%。使用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。制备一个甘蔗植物细胞， 其中，核酸在甘蔗植物细细胞分裂时是自主复制的。其他实施例中，核酸与SEQ ID NO 204 相比较，同源性至少为95%。还有其他实施例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。另一实施例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞的方法，它包括获取一个长度至少为151Λρ的核酸的步骤，这种核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。使用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。获取一个甘蔗植物细胞，其中，核酸在甘蔗植物细胞分裂时是自主复制的。其他实施例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为95%。还有其他实施例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。另一实施例是一种将一个自主复制核酸稳定结合到一个甘蔗植物细胞的方法，它包括制备一个核酸的步骤，核酸包括一个长度至少为^lAp的核酸，它与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为98%。采用核酸对甘蔗植物细胞进行改造。获取一个甘蔗植物细胞， 其中，核酸在甘蔗植物细细胞分裂时是自主复制的。其他实施例中，核酸与SEQ ID NO 204相比较，同源性至少为95%。还有其他实施例中，核酸与SEQ ID NO :204相比较，同源性至少为99%。本发明的序列说明下面是序列表中SEQ ID NOs的编号清单SEQ ID NOS 1-201-甘蔗卫星序列SEQ ID NO :202-共有甘蔗卫星序列SEQ ID NO :203-甘蔗 CRS 序列SEQ ID NOS :204-甘蔗卫星重复序列块SEQ ID NOS :205-221-引物序列SEQ ID NOS :222-241-启动子序列SEQ ID NOS :242-251-引物本发明的详细内容本发明中包括各种形式的实施例，此处将对这些实施例进行详细、具体地解释，因此可以将本说明理解为对本发明原则的例证过程，但不受具体实施例的局限。本发明提供了新颖的、实用的、稳定的、自主的甘蔗微型染色体和重组染色体，这两种染色体中都包括着丝粒，着丝粒又包括甘蔗重复序列例如合成序列，它可以是“孤立” 甘蔗微型染色体或者重组染色体。本发明还提供了“加强染色体”甘蔗植株，将在本说明中进一步详细阐述。一方面，本发明是针对甘蔗植株，这种甘蔗植株包括实用的、稳定的、自主的甘蔗微型染色体或重组染色体，染色体可选择性地携带一个或多个外源性核酸、或携带已存在于甘蔗基因组中的核苷酸的额外副本。与这种携带甘蔗微型染色体或重组染色体的植株相比，转基因植株通过将外源性核酸转基因融合到原生甘蔗染色体中来改变基因组。在具代表性的实例中，外源性核酸的表达会改变植株表现型，无论是出于本质、还是信号响应(可能是受刺激或者应激诱导的)、组织特异性表达、以及时间特异性表达。本发明准备的甘蔗微型染色体或重组染色体至少包括1个、2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、 21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、 100个、110个、120个、130个、140个、150个、250个、500个、1000个或更多外源性核酸。本发明考虑到甘蔗植株可能会用于携带本发明中的自主甘蔗微型染色体或重组染色体。一方面，本发明是关于甘蔗植株部分或者植株组织的，包括一荚、根、种根、苗根、原基根、苗、初生苗、次生茎、吊穗、穗、箭状物、中脉、叶片、叶舌、外耳、赘肉、叶片联合、鞘、节点、节间、芽畦、叶痕、切割、块茎、干、主茎、果实、浆果、坚果、花、叶、茎皮、木质部、表皮、输导组织、器官、原生质体、冠、愈伤组织培养、叶柄、花瓣、萼片、雄蕊、柱头、中柱、花蕾、分生组织、形成层、皮层、木髓、鞘、丝光包裹体、胚珠或胚胎。其他具代表性的甘蔗植株机体结构包括本发明中任一植物的性母细胞、或配子、或胚珠、或花粉、或内胚乳。其他具代表性的植物机体结构包括种子、种子件、胚胎、原生质体、细胞培养物、及各种植株细胞组，这些细胞组构成了本发明中的所有甘蔗植株的结构和功能单位、再生芽或繁殖体。一个实施例中，外源性核酸主要存在于甘蔗植株的某一特定位置或组织中，如茎秆、表皮、输导组织、分生组织、形成层、皮层，木髓，叶，鞘，花，根或种子。组织特性表达可以表现在以下几方面，例如将甘蔗微型染色体或重组染色体进行定位、对甘蔗微型染色体或重组染色体的选择性保护、或含有推动组织特异表达的启动子。另一方面，本发明关于甘蔗性母细胞、花粉、胚珠、胚乳、种子、体细胞胚、内胚胎、 来自受精作用的胚胎、无性繁殖体和原“加强染色体”植株的的子代及其保留的实用、稳定、 自主的甘蔗微型染色体或重组染色体的子代，这些子代包括克隆繁殖的甘蔗植株、胚胎和植株部分以及来自自我和杂交育种、单性结实的子代。在具代表性实例中，在细胞有丝分裂过程中，甘蔗微型染色体或者重组染色体遗传给下一代存活的子细胞，传输效率至少为60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、或者 99%。在本发明的实例中，在减数分裂过程中，当目前的植物配子母细胞中存在一个以上的甘蔗微型染色体或重组染色体的副本时，甘蔗微型染色体或重组染色体将被传输给存活的配子，传导效率至少为60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或者 99%。减数分裂过程中，当目前的甘蔗植株植物配子母细胞中存在一个甘蔗微型染色体或重组染色体的副本时，甘蔗微型染色体或重组染色体有选择地被传输给存活的配子，传输效率至少为1%、10%、20%、30%、40%、45%、46%、47%、48%、或者49%。根据本发明的实施例，通过有性繁殖、单性结实产生种子，当植物细胞中存在一个或多个甘蔗微型染色体或重组染色体的副本时，甘蔗微型染色体或重组染色体以至少60%、70%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、或者99%的速率传输到存活的胚胎。由于种子繁殖通过甘蔗植株的有性繁殖或单性结实实现，这种甘蔗植株含有一个甘蔗微型染色体或重组染色体， 因此甘蔗微型染色体或重组染色体是选择性地传输到存活的胚胎，传输速度不低于1%、 10%、20%、30%、40%、45%、46%、47%、48%、或 49%。本发明具代表性的实施例中，一个甘蔗微型染色体或重组染色体中包含一种外源性可选特征或外源性可选标记特性，这个甘蔗微型染色体或重组染色体可用于提高含有甘蔗微型染色体或重组染色体的加强染色体细胞、组织、配子、胚胎、内胚乳、种子、植株或子代的繁殖频率。特殊实施例中，有丝分裂或者减数分裂后，甘蔗微型染色体或重组染色体被传输到存活的细胞、组织、子、胚胎、内胚乳、种子、植株或后代中，频率至少为95%、96%、 97%、98%、99%或者99. 5%。有丝分裂是通过至少一个选项，选项有利于不含微型染色体或重组染色体的加强染色体细胞、组织、配子、胚胎、胚乳、种子、植株或这种细胞、组织、配子、胚胎、胚乳、种子、植株的子代。传输效率是携带甘蔗微型染色体或重组染色体的甘蔗子代细胞或甘蔗植株所占的百分比。这个结果可通过本文中提到的多种试验方法的一种来计算，其中包括荧光报告基因的检测、采用PCR检测法检测一个甘蔗微型染色体或重组染色体所携带的序列、采用 RT-PCR检测法检测一个携带甘蔗微型染色体或重组染色体的基因转录、使用西方分析法分析一个由携带甘蔗微型染色体或重组染色体的基因产生的蛋白质，使用南方分析法对蔗微型染色体或重组染色体携带的DNA (全部或者部分)进行分析，抑制子结合进行荧光原位杂交(FISH)或原位定位。任何用于检测甘蔗微型染色体(或微型染色体的一部分)或者重组染色体的分析方法都可用于测量一个亲代细胞或植株向子代传输微型染色体或者重组染色体的效率。通过一些基准百分比计算出的高效传输，应通过有丝分裂和减数分裂循环来说明甘蔗微型染色体或重组染色体在何种程度上、向哪种子代细胞传输是稳定的。
除自主甘蔗微型染色体或者重组染色体之外，本发明中的甘蔗植株也可能包括染色体整合的外源性核酸。改性甘蔗植株或者植株部分包括本发明中含有部分微型染色体组合的甘蔗植株(如外源性核酸或着丝粒序列)或部分或全部含重组染色体的细胞所在的甘蔗植株。一方面，本发明通过将改性甘蔗植株杂交，外源核苷酸组合将自主甘蔗微型染色体或者重组染色体进行隔离。甘蔗植株包括外源性核酸和甘蔗植株的组合，它能产生一些不含组合外源性核酸的配子，随后隔离杂交后代，否则后续的杂交后代会被改性，但不含组合外源性核酸。这种将甘蔗微型染色体或重组染色体独立隔离一种检测微型染色体独立性的方式。另一方面，本发明是关于生产和选择性孤立这种含有有效的、稳定的、自主的甘蔗微型染色体的改性甘蔗植株的方法。在一个实施例中，本发明考虑改进孤立原生甘蔗着丝粒序列的方法。另一实施例中，本发明考虑通过细菌母体或者真菌母体来产生原生或人工甘蔗着丝粒序列变种的方法。某一进一步实施例中，本发明还考虑了以下几种方法将甘蔗微型染色体输送到甘蔗植株细胞或组织中，从而改变细胞或组织，然后选择性地检测微型染色体的状态或评估微型染色体的表型，最后根据这种细胞或组织选择性地种植甘蔗植株。对甘蔗微型染色体或重组染色体机能进行的分析和评估包括基于谱系的继承检测、使用染色体丢失剂展示自主性、核酸外切酶消化、使用或不使用染色体丢失剂进行全局有丝分裂微型染色体遗传分析(扇形扫描分析)、检测甘蔗微型染色体所携带的基因显性水平在甘蔗植株内时空变化(包括标记基因)的方法、从甘蔗植株内源性核染色体中分离出自主甘蔗微型染色体或重组染色体的物理实验、证明保存的甘蔗微型染色体结构或者重组染色体的分子检测(如PCR、DNA印迹、甘蔗微型染色体保护、甘蔗植株中的甘蔗微型染色体序列的克隆和特征描述)、甘蔗细胞基因组(比如FISH)中的甘蔗微型染色体或重组染色体的细胞学检测、减数分裂中甘蔗微型染色体或重组染色体遗传检测，通过有丝分裂和配子、胚胎、胚乳或种子测量在甘蔗植株中微型染色体或重组染色体在直系后代中的遗传程度。另一方面，本发明是关于用含有一个甘蔗微型染色体或重组染色体的甘蔗植株生产食品、医药产品、生物燃料和化工产品的方法，这种方法是通过甘蔗微型染色体或重组染色体中的外源性核酸的恰当表达实现的。然而，另一方面，本发明提供了新颖、自主的具有新型的成分和结构的甘蔗微型染色体，可用于植物细胞的改造，同时可用于生产一棵植株(或者多棵植株)。本发明中考虑的具代表性的甘蔗微型染色体尺寸为20001Λ或长度小于20001Λ。甘蔗微型染色体的其他具代表性尺寸，长度上应不大于 1500kb、IOOOkb、900kb、800kb、700kb、600kb、500kb、450kb、 400kb、350kb、300kb、250kb、200kb、150kb、IOOkb、80kb、60kb、40kb、；35kb。某一具代表性的实施例中，微型染色体长度大约为观吐、长度大约为421Λ、长度大约为821Λ、长度大约为 871Λ、长度大约为881Λ、长度大约为971Λ、长度大约为1301Λ、长度大约为1501Λ、长度大约为2001Λ或长度从^lib到2001Λ。某一相关方面，新甘蔗着丝粒组成部分的特征是通过序列含量、大小或其他参数表现的。可选择地，将最小着丝粒序列用于构建微型染色体。具代表性的大小包括一个甘蔗着丝粒核酸段，它根据一个甘蔗微型重复序列取自于甘蔗部分基因组DNA或组合基因组 DNA，甘蔗微型重复序列不大于 10001Λ、900kb、800kb、700kb、600kb、500kb、400kb、300kb、 200kb、190kb、150kb、100kb、95kb、90kb、85kb、80kb、75kb、70kb、65kb、60kb、55kb、50kb、 45kb、40kb、35kb、30kb、28kb、25kb、20kb、17kb、15kb、12kb、1 Okb、7kb、6. 4kb、5kb、或者 2kb。 具代表性的插入物尺寸范围包括从80kb到100kb、7kb到190kb、7kb到12kb、5kb到10kb、 3kb 到 IOkb、3kb 到 7kb、5kb 到 7kb、10 到 30kb、15 到 30kb、以及 15 到 28kb。另一个相关方面是甘蔗微型染色体的新结构，特别是不含细菌序列(比如，需要细菌传播的序列)的结构，称为无骨干甘蔗微型染色体。其他具代表性的实施例中，本发明认为含着丝粒核酸序列的甘蔗微型染色体或其他载体，当它与文中实例所述的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多探针进行杂交，在所述的杂交环境下(比如非严格杂交、中等杂交、严格杂交)，可以得出相对的杂交分数。具代表性的严格杂交环境包括65°C恒温，然后用65°C的0. 25x SSC, 0. 1% SDS清洗三次，每次15分钟。其他的具代表性的严格杂交环境包括50°C左右到70°C的0. 02M到0. 15M 的NaCl中进行杂交、或在65 °C的0. SSC 0. 25% SDS中进行15分钟，然后65 °C的温度下清洗半小时，或者65°C恒温条件下培植14个小时，然后用65°C的0. 5x SSC, 1 % SDS清洗三次。用目测的方式对探针杂交进行评分，直观地确定一个二进制值(正面与负面)，或根据 10点规模的相对杂交强度为探针分配一个评分。举例来说，相对杂交评分5可用于选择克隆，对探针杂交来说，这个评分也为良好。另外，杂交信号大于一个或多个探针所处的背景， 可用于选择克隆。本发明还考虑到含有这种甘蔗微型染色体的改性染色体或广告染色体的甘蔗植株或者植株部位。本发明的优点包括准备了一个自主、独立的遗传连锁群来加速甘蔗繁殖、不含母体甘蔗基因组中断、较大基因和无限基因的多基因“堆栈”、植物细胞和含有自主甘蔗微型染色体的植株中外源DNA序列的普遍遗传组成、确定可预测基因显性的基因环境、以及(由于淘汰了无效整合步骤)含有保持稳定的外源性DNA的甘蔗植株细胞和植株的出现和恢复的频率较高。此外，本发明明确提出甘蔗微型染色体可以增加总的蔗糖回收量或加强改性甘蔗植株在生物燃料声场中的作用。I.微型染色体的组成及微型染色体的构造本发明中的甘蔗微型染色体载体可能包括各种各样的元素，如(1)起甘蔗着丝粒作用的序列；( 一个或多个外源性核酸，比如包括植物表达基因或非编码RNA基因；(3) 起到复制源作用的序列，它可能在起植物着丝粒作用的区域内；(4)或者起到细菌中质粒增殖作用的细菌质粒骨干；(5)或者起到植物端粒作用的序列；(6)或者额外的“填充片段 DNA”，它起到从甘蔗微型染色体中物理隔离各种元素的作用；(7)或者“缓冲”序列，如核基质附着区(MARs)或染色体支架结合区(SARs) ； (8)或者非必须标记序列包括但不限于植物和细菌的起源标记序列；(9)或者作为复合位置的序列；以及(10)或者作为“染色质包装序列”，如内聚和凝聚结合部位。本发明中，甘蔗微型染色体的构造可能含有各种新成分，新成分中包括但不限于含有新重复着丝粒序列的甘蔗着丝粒，下文将做详细阐述。新着丝粒的成分在本发明中，微型染色体包括含有新颖重复甘蔗着丝粒序列的着丝粒。
本发明还考虑了下列例子中所描述的所有具代表性的载体中包括的多种元素，数量为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20、或更多。本发明特别考虑了文中描述的能充分保持活力的核酸片段或变种(突异变种)的选择使用，包括起到甘蔗着丝粒作用的核酸、起启动子或其他调控序列作用的核酸、或外源性核酸。在原始核苷酸序列或共有序列中，变种可能会增加、替换或者删除一个或多个核苷酸。与原始核酸序列相比，变种包含的核酸序列同源性至少为50^^55^^60,65,70,75,80, 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或 100%。变种还含有核酸序列，能在低温、中等温度、高温或超高温条件下与原始核酸序列杂交。类似地，本发明还考虑替代文中描述的任一多肽片段、或变种。可以用数学算法对序列进行比较，并确定两个核苷酸序列的同源性百分比。比如确定两个核苷酸序列的同源性百分比可以用已被纳入GCG软件包(网址 厕.gcg. com)的 GAP 程序中的 Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :444-453 算法，这个算法写入 GAP程序是通过Blossom 62矩阵或PAM250矩阵实现的。参数可以进行设置，这样就可以使同源性百分比最大化。文中所使用的“不严格、中等、严格环境杂交”指的是杂交和清洗环境。杂交反应表现可以从《现代分子生物学实验手册》(参见Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons,N. Y.，6. 3. 1-6. 3.6，)中找到，此处引用作为参考。实验手册中介绍了溶于水和不溶于水的方法，并且两种方法都可行。这里特殊杂交环境是指1)非严格杂交环境，在45°C的6x 氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中，随后用至少50°C的0. 5x SSC, 0. SDS溶液清洗两次；2) 中等强度杂交环境是指在45°C的6xSSC溶液中，随后用至少55°C的0.切SSC, 0. 1%SDS溶液清洗一到两次；幻严格的杂交环境指的是在65°C的溶液中培植12-18小时，随后用65°C 的0. 25x SSC和0. SDS溶液清洗三次，每次时间为15-90分钟。另外，具代表性的严格杂交环境包括大约45°C的6x SSC溶液，随后用65°C的0. 2x SSC和0. 1 % SDS溶液清洗一到两次。其他具代表性的高度选择性或严格杂交环境包括用50°C -70°C的0. 02M-0. 15M NaCl 溶液或者65ο的0. 5x SSC 0. 25% SDS溶液培植12-15小时，随后用65°C的溶液清洗三次， 每次15-90分钟。甘蔗微型染色体序列含量和结构为了适应甘蔗密码子的需求、在靠近转录起始ATG密码子附近插入优选的模体、 从5’或者3’剪接位点移除植物中已识别的序列、或更好的反映植物GC/AT的含量，非植物源的甘蔗表达基因则可能会被修改。通常，植物基因中的GC含量大于35%，对富含A和T 核苷酸序列的编码可能会出现问题，如ATTTA模体可能会使mRNA失稳，植物多聚腺苷酸化信号，比如在信息内不恰当位置的AATAAA可能会造成转录的过早截断；以及单子叶植物比如甘蔗可能会把富含AT的序列识别为剪接位点。每个外源性核酸或甘蔗表达基因可能包括一个启动子、一个编码区域及一个终止序列，它们都有可能在限制性内切酶位点、或重组位点、或以上两个位点上相互分离。基因也可能会包括内含子，它可能会在基因转录部位以任一数目出现在任何位置上，包括5’非转录序列、编码区域以及3’非转录序列。内含子可能是任何植物中都包含的天然植物内含子、或根据植物物种定义的剪接位点一致的人工内含子。另外，有的内含子序列在植株中还表现出表现增强的态势。或者，外源性核酸可能包括一个植物转录终止符、可增强表达的病菌的非转录前导序列、一个最小启动子、或一个控制向植物室或细胞器官输送基因产物的信号序列。基因的编码区域可对任何蛋白编码，包括但不限于可见标记基因(如荧光蛋白基因、其他赋予植物可见表型的基因)、或者其他筛选标记或选择标记基因(如对抗生素、除草剂或其他有毒化合物产生抵抗能力，或对蛋白进行编码，使含有蛋白质的细胞具有生长优势)、或者能使转基因或加强染色体甘蔗植株具有商业或农业价值的基因。同一甘蔗微型染色体载体中存在多个基因。基因可能会从限制性内切酶位点、归巢核酸内切酶位点、重组位点或任一组合中被分离开。另外，克隆工艺可以通过破坏干预限制位点的方式实现。基因数量不限。甘蔗卫星染色载体可能包括一个用于细菌的细菌(如大肠杆菌、农杆菌、或者发根质粒繁殖)质粒骨干。质粒骨干可能是一个低副本载体，或者在其他实施案例中，更倾向于使用一个中高水平的副本骨干。本发明的一个实施案例中，这个骨干包括了大肠杆菌的 F’质粒复制子。但也可能会用到其他质粒复制子，如噬菌体Pl复制子、或者如PK2复制点的低副本质粒系统。骨干可能包括一个或多个能使含有质粒的细菌细胞具有特殊抗生素耐药性的基因。细菌抗生素耐药性基因包括但不限于卡那霉素，氨苄青霉素，氯霉素，链霉素， 壮观霉素，四环素和庆大霉素耐药基因。甘蔗微型染色体载体还可能含有植物端粒。一个具代表性的端粒序列是TTTAGGG 或他的补体。端粒是线性染色体末端的特殊DNA结构，起到稳定末端和帮助DNA分子极端末端的完整复制的作用(Richards et al. , Cell, 1988Apr 8 ；53(1) :127-36 ；Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, 1997)。此外，甘蔗微型染色体载体可能包括“DNA填充序列”，这个序列的作用是将微型染色体(着丝粒、基因、端粒)中各种成分分离。DNA填充序列包括了任何来源，不管原核的还是真核状态，或可以取自于任何基因组或物种、植物、动物、微生物或细胞器官，或者也有可能是合成的。DNA填充序列的长度范围是IOObp到10Mb，可以在序列中重复存在，重复单元范围从10到1，000，OOObp0 DNA填充序列的重复性序列包括但不限于rDNA、卫星重复、逆转录因子、转位子、假遗传因子、转录基因、微卫星、tDNA基因、短序列重复以及它们的组合。 另外，DNA填充序列包括来源或序列的独特的、非重复的DNA。填充片段序列可能也包括能够形成边界领域的DNA，包括但不限于染色体支架结合区(SARs)或核基质附着区(MARs)。 DNA填充序列可能是由随机序列组成的完全合成物质。这种情况下，DNA填充序列可能包括任何碱基组成、或任何A/T或G/C的含量。比如，DNA填充序列的G/C含量与植物类似( 30-40% )、或更低(0-30% )、或更高(40-100% )。另外，不同的合成填充序列包括任一给定的核苷酸，比如A、C、G或者T。各种不同成分的合成填充片段也可能互相结合。比如，一个G/C含量低的片段可能被一个中等或高G/C含量的片段侧击或邻接，反之亦然。本发明的第一个实施案例中，甘蔗微型染色体包括一个没有端粒的环状结构。第二个实施案例中，甘蔗微型染色体包括一个含有端粒的环状结构。第三个实施案例中，甘蔗微型染色体包括一个含有端粒的线性结构。比如切断一个“线性”结构与一个独特的核酸内切酶的联系，端粒将移动到原始封闭序列中的DNA分子的末端，具有抗生素耐药性的基因除外。在本发明的第四个实施案例中，端粒以下列方式存在细菌复制子、骨干序列、耐抗生素基因以及任一细菌来源序列。目前为了在细菌中进行甘蔗危险染色体繁殖，可通过用特殊的核酸内切酶切割构造将端粒从植株显性基因、着丝粒、端粒和其他序列中去除，这将会去除细菌中很多甚至全部的甘蔗染色体。在本实施案例中，植物显性基因或其他甘蔗微型染色体序列之间(中)，在通过一个核酸内切酶切割甘蔗微型染色体去除剩余细菌序列和构造结扎之前，细菌序列排列将会被去除，这样将导致耐抗生素基因的流失。特殊的核酸内切酶位点可能是任一核酸内切酶的识别序列，包括但不限于限制性核酸内切酶、兆碱基大范围核酸酶或归巢核酸内切酶。另外，内切酶和它们的位点可由任何特定的DNA进行替换， 这种DNA切断机制和它的特殊识别位点的联系，如个别切割核酸内切酶或重组酶及其相应的识别位点，只要是存在于甘蔗微型染色体中的位点只能在各自固定的位置上。由于甘蔗微型染色体的元素互为导向，因此各种结构的配置都是有可能出现的。 一个甘蔗着丝粒出现在一个基因间的、或位于一个或另一个端粒周围的基因组合外的甘蔗微型染色体。DNA填充序列可与这些构造相组合，将填充片段序列植入端粒、或者沿基因之间的着丝粒四周、或这些端粒和着丝粒的组合。因此，可以出现很多种可替代甘蔗微型染色体结构，这取决于着丝粒DNA、基因、填充片段DNA、细菌序列、端粒以及其他序列的相对位移。每一个这类变体的序列含量是相同的，但是它们的结构却可能存在差异，这取决于序列是如何排列的。对于线性或者环状甘蔗微型染色体来说，构造变化都是有可能的。具代表性的着丝粒组分甘蔗着丝粒组分可能是从一种原生植物基因组中孤立出来的，又或者是取自于这个基因组，如通过重组技术修改或通过以细胞技术对基因进行改性，下面将对此详细阐述。 另外，完全人工着丝粒组分可通过诸如原生卫星重复序列方式构建，它们是原生甘蔗丝粒的一般性引导序列。本发明还考虑到自然植株的着丝粒组分组合和/或自然植株组分与人工组分的组合。某一实施案例中，采用文中提出的方法获取的甘蔗着丝粒包括η个重复核苷酸副本；其中η至少为2。另一实施案例中，甘蔗着丝粒包括η个交叉重复副本。一个交叉重复是指一个由两种截然不同重复元素组成的DNA序列，同时它还具有独特的排列组合。能存在于重组结构中的任何数量的重复副本都包括在这个构造之中，数目约为5、10、15、20、30、 50、75、100、150、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000、5000、7500、10000、20000、 30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000 和大约 100000、以及这样的副本数之间的数目。此外，副本虽然大致相同，但是又各不相同。一般来讲，这种重复变化可在着丝粒中观测到。重复的长度可能各不相同，长度范围可从约20bp到约360bp、从约20bp到约250bp、 从约 50bp 到约 225bp,/A 20bp 到 137bp、从约 75bp 到约 210bp、从约 IOObp 到约 2(^bp、从约125bp到约200bp、从约150bp到约l%bp、从约160bp到约190以及从约170bp到约 185bp包括约180bp。具代表性的重复包括但不限于一个92bp重复、一个97bp重复或者一个IOObp重复。在本发明中，可存在较大的重复数目，可达3465bp、或3500bp、或3600bp、或 3700bp。本发明认为其中两个以上这种甘蔗重复核苷酸序列或类似的甘蔗重复核苷酸序列可能在着丝粒内头尾相接。“头尾相接”是指相同或相似的重复核苷酸序列(比如，至少具有70%同源性)的多个连续重复副本，这些重复副本在相同的5’-3’方向。本发明还认为两个以上这种甘蔗重复核苷酸序列在着丝粒内可能具有连续性。这里的“连续”是指相同和相似的没有被其他显著序列元素中断的一个接一个的重复核苷酸序列(比如，至少具有70%的同源性)。这样的连续重复核苷酸序列可发生在任何方向，比如头尾相接、尾尾相接、 头头相接，也可能被η个核苷酸分隔开，其中η范围从1到10、或者1到20、或者1到30、或者1到40、或者1到50。通过此处描述的方法，将来自甘蔗的具代表性的重复核苷酸序列定义为 SEQ ID NOS 1-202，SEQ ID NO :204 和 CRS (SEQ ID NO :203)。
从原生植物基因组中分离的甘蔗着丝粒的修改
修改和变化通常发生在含有功能分子的甘蔗着丝粒DNA片段中，这些功能分子一般都具有理想的特性。本发明也对这种转基因甘蔗着丝粒进行了考虑。下面将就改变甘蔗着丝粒核酸进行讨论，着丝粒的改变是用来创造一个等效、甚至是改进的第二代分子。
本发明的某一特殊实施案例中，考虑到突变甘蔗着丝粒序列可能会有助于提高甘蔗着丝粒的效用。本发明没有受到任何理论的约束，而是特别考虑了甘蔗着丝粒的作用， 这可能部分或全部根据甘蔗着丝粒的DNA序列的次生结构、通过甲基或者其他加合物修改 DNA、以及/或与甘蔗着丝粒起交互作用的蛋白质。改变甘蔗着丝粒的DNA序列可能会改变甘蔗着丝粒的一个或多个着丝粒相关蛋白、以及/或次生结构、或修改甘蔗着丝粒序列，从而改变甘蔗着丝粒的运动。另外，在本发明中，变化可能会发生甘蔗着丝粒中，这不会影响甘蔗着丝粒的活动。本发明认为甘蔗着丝粒变化一缩小需赋予甘蔗着丝粒运动特性的DNA 片段尺寸一非常有用，原因在于在有丝分裂或减数分裂过程中，这会增加甘蔗着丝粒传输的精确度。
通过细菌、甘蔗或其他母体、或工艺修改甘蔗着丝粒
本发明所提到的方法中，甘蔗微型染色体DNA序列结果可能是亲本克隆或者甘蔗着丝粒克隆的衍生物，它对核酸序列中的一个或者多个核苷酸做了代替、删除、插入、复制和/或重新排列。该类核苷酸突变可能是单独发生的，也可能是连续发生的，连续发生的时候约为 1、2、3、4、5、6、7、8、910、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、 200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、8000、10000、50000、 100000、以及大约200000，包括其间所有范围。
甘蔗微型染色体的变异可能是通过各种各样母体(比如病毒、细菌、酵母、或其他原核或真核生物)中的甘蔗微型染色体传代实现，也可能通过多个或者一个单独的母体传代实现。通过体外复制甘蔗微型染色体也可能会发生突变。
衍生物可通过序列分析、或用电泳分离法计算甘蔗微型染色体分子的重量变化来确定，分子重量变化可用方法包括但不限于CHEF gel分析、柱分离或梯度分离、或该领域可用于确定和/或分析DNA分子重量或序列含量的任何方法。另外，还可以通过改变衍生物的活动赋予一个甘蔗微型染色体以甘蔗着丝粒作用的方法来确定衍生物。
合成甘蔗着丝粒重复系列的产生或合成
本发明中，这些人工合成的重复核苷酸序列有多个来源，包括天然甘蔗着丝粒序列、原生甘蔗着丝粒序列的组合或片段，包括一种不同长度重复的组合、一种不同序列的组合、一种不同重复长度和不同序列的组合、一种不同人工合成序列的组合或者一种原生甘蔗着丝粒序列和人工合成序列的组合。可以通过该领域的例如来自基因组DNA的PCR法的任何已知技术生产合成核苷酸序列和这些合成重复序列阵列，，如例1中描述的方法、或自定义多核苷酸的合成。
多核苷酸合成是使用自动合成仪实现的指定核酸序列的非生物、化学合成。寡核苷酸可能是由化学合成、提纯，然后这些寡核苷酸通过热处理和标准连接或聚合酶反应组合在一起。具代表性的连接方法包括磷酸化重叠寡核苷酸连接(Gupta et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA,60,1338-1344, Fuhrmann et al. Plant J. 1999 Aug; 19 (3) :353-61)、FokI 方法(Mandecki et al. Gene，68，101-107)和一种关于基因合成的连接酶链式反应的修正形式。此外，也可能使用到PCR装配方法，该方法中通常录用的寡核苷酸长度为40-50Π，且互相重叠。经过设计，这些寡核苷酸可以覆盖大多数序列的子线，全长分子是通过重叠延伸PCR(Stemmer et al. Gene，164，49-53)、热力学平衡里外PCRO^ao et al. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 15 ；31 (22) :el43)、或者组合法(Young et al. Nucleic Acids Res. 2004 Apr 15 ；32 (7) :e59)逐步生严。
含植物表现基因在内的具代表性的外源性核酸
本发明中，其中的一个重点就是外源性核酸，当它进入甘蔗植株后，它会改变植株、一个植株器官、植物组织或者植物的部分表型。具代表性的外源性核酸能对多肽编码。 其他具代表性的外源性核酸改变外源性或内源基因的表达，此外还可以提高或降低在面对一种特殊信号或刺激时的表现。
文中所使用的“性状”这个词一方面指目标表型的改变，另一方面还指可造成目标表型改变的核酸。
甘蔗改造的一大主要目的是为植株增强商业价值或农作物性状。这些性状包括但不限于增加总可回收糖量的生产、用于生物燃料的生产、除草剂耐药性或者耐受性、抗昆虫 (虫)或者耐受性、抗灾害或者耐受性(病毒，细菌，霉菌，线虫或者其他病原生物)、提高抗性或者耐受性(如干旱、炎热、寒冷、冻结、过度湿润、盐分失调、机械应力、极端酸性、强碱性、毒素、紫外线、致电离辐射或者氧化应激等)、增加产量、增加生物质的数量或者质量、加强或者改变养分吸收以及加强或改变植株代谢效率、加强或者改变营养成分和植物组织的组成，这些组织可用于食物、种子、纤维或者处理、物理性质、雄性不育性、脱水、直立性、多产、淀粉数量和质量、油分数量和质量、蛋白数量和质量、氨基酸成分、改性化学物生产、改变制药或者保健食品性质、改变生物处理法性质、增加生物质、改变生长速度、改变健康、改变生物降解能力、改变二氧化碳固定能力、生物学指标活动的存在、改变人类或者动物对它的消化性、改变变应原性、改变配对特征、改变花粉扩散、改善环境影响、改变固氮能力、生产一种配药活跃蛋白、一种具药物特性小分子的生产、一种具工业效用的化学品的生产、保健食品、食品添加剂、碳水化合物、RNAs、油脂、燃料、染料、天然色素、维他命、香水，调味品、 疫苗、抗体、荷尔蒙以及类似物品的生产、织物结构或者发育的改变，包括发育时间、光合作用、信号转导、细胞生长、生殖或者变异的变化、此外，可以创建一个整个基因组库(也可以是其一部分)，该基因库可以是任何生物或者细胞器官的，包括哺乳动物、植物、微生物、真菌或者细菌。
某一实施案例中，甘蔗植株含有一个显示增加或减少、或植物某种产品积累的甘蔗微型染色体或者重组染色体。产品可能是植物的一种原生产品或者植物的一种新的、或修改产品。具代表性的产品包括一种酵素、一种RNA分子、一种营养蛋白、一种结构蛋白、一种氨基酸、一种油脂、一种脂肪酸、一种多糖、一种糖类、一种酒精、一种生物碱、一种类胡萝卜素、一种丙酸、一种苯丙素、一种萜类化合物、一种类固醇、一种类黄酮、一种酚类化合物、 一种花青素、一种天然色素、一种维他命或者植物荷尔蒙。另一实施案例中，甘蔗植株包括一种可以增加或减少光、水、氮、或者微量元素需求的甘蔗微型染色体或者重组染色体。另一实施案例中，甘蔗植株包括一种提高从氮环境中获取或稳定氮的能力的甘蔗微型染色体或重组染色体。另一实施案例中，甘蔗植株包括一个富含一种作为植物蛋白分段存在的基本氨基酸的甘蔗微型染色体或者重组染色体。蛋白分段可能是如总种子蛋白质、可溶性蛋白质、非可溶性蛋白质、水可萃取蛋白质以及脂类蛋白质。甘蔗微型染色体或者重组染色体可能含有一种多功能基因，这种基因可导致超表达、低表达、反义调控、共抑制、诱导性表达或者其他基因的诱导调制。
下面列出了具代表性的目标性质和表现以及增减的多肽。
⑴抗除草剂
除草剂抗药性(或者耐受性)性状是含有甘蔗微型染色体或重组染色体的甘蔗植株的一个特性，即对野生植株有致死威胁的典型药剂具有抵抗性。对植物来说除草剂抗药性是很有用的，其中具代表性的除草剂包括草甘膦除草剂、草丁膦除草剂、苯腈除草剂、咪唑啉酮除草剂、二硝基苯胺除草剂、氮苯除草剂、磺脲除草剂、bialaphos除草剂、磺胺除草剂以及草铵膦除草剂，其他的除草剂可能当除草剂基因组合都进入相同的甘蔗微型染色体或者重组染色体时，就
改造中能够使用到的抗除草基因的例子包括对草丁膦乙酰转移酶(bar)编码的基因、草甘膦耐受性EPSP合酶基因、草甘膦乙酰转移酶、草甘膦退化酵素基因气态氧编码草甘膦氧化还原酶、deh(对脱卤素酶编码，使其对茅草枯具不活跃性)、抗除草剂(比如磺胺和咪唑啉酮)的乙酰乳酸合酶、以及bxn基因(对一种腈水解酶编码，使器能够降解溴苯腈)。Bar基因能对一种酵素，草丁膦乙酰转移酶(PAT)编码，它能降低除草剂草丁膦的活性以及阻止这种化合物对谷氨酰胺合成酶酵素的抑制作用。5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP合成酶)通常受到除草剂N-(膦羧甲基)-甘氨酸-(草甘膦)的抑制。然而，据所知，能够编码草甘膦抗性EPSP合酶酵素的基因。特别考虑了能够用于植物转化的基因。 Deh基因能对酵素茅草枯脱卤酶编码，赋予除草剂茅草枯的抗性。Bxn基因对一种特殊腈水解酶酵素编码，把溴苯腈转化成一种非除草剂降解产品。草甘膦乙酰基转移酶基因能是除草剂草甘膦失活，阻止该化合物对EPSP合酶的抑制。
多肽可以使植物对植物除草剂(参与莽草酸途径的多肽)产生耐受性，它可为植物提供草甘膦耐受性。这些多肽包括参与chori smate、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸生物合成的多肽。
(ii)抗虫性
可采用的潜在抗虫性(或者耐受性)基因包括苏云金芽孢杆菌毒素基因或者Bt 基因((Watrud et al. , In !Engineered Organisms and the Environment，1985)。Bt 基因可提供对鳞翅目害虫或者鞘翅目害虫的抗药性，包括玉米螟(ECB)。这种实施案例中使用的具代表性的Bt毒素基因包括CryIA(b)和CrylA(c)基因。此外，从其他类的芽孢杆菌中也能提取出内毒素基因，用它来降低害虫增长速度或发育速度。
考虑到某些实施案例中用于甘蔗微型染色体或重组染色体中的Bt基因中编码序列已经被改变并以此来增加其在包括甘蔗植株在内的单子叶植株中的表达。我们已经熟知提取和酶基因的方法，比如U. S. Patent No. 5, 500, 365and U. S. Patent Number No. 5，689，052，，每个披露都以全文参考的形式引入本文。此类改性Bt毒素基因包括一种合成的 Bt CryIA(b)基因(Perlak et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 :3324-3328, 1991)，以及称为 1800b 的合成 CryIA(c)基因(PCT Application WO 95/06128)。本领域技术人员所熟知的一些Bt毒素在表1中列出。
表1 苏云金芽孢杆菌内毒素基因a
新命名法旧命名法基因银行注册号CrylAaCryIA(a)M11250CrylAbCryIA(b)M13898CrylAcCrylA(c)M11068CrylAdCryIA(d)M73250CrylAeCryIA(e)M65252CrylBaCryIBX06711CrylBbET5L32020CrylBcPEG5Z46442CrylBdCryElU70726CrylCaCryICX07518CrylCbCryIC(b)M97880CrylDaCryIDX54160CrylDbPrtBZ22511CrylEaCryIEX53985CrylEbCryIE(b)M73253
CrylFaCryIFM63897CrylFbPrtDZ22512CrylGaPrtAZ22510CrylGbCryH2U7072权利要求
1.由选自包含以下成分的基团的核苷酸序列组成的多核苷酸(a)SEQ ID NO :204的核苷酸序列；以及(b)和SEQID NO 204的核苷酸序列有至少98%相似度的核苷酸序列。
2.要求1中的多核苷酸，其中包含SEQID NO :204的核苷酸序列。
3.由包含要求1或要求2中多核苷酸的至少2个复制品的序列组成的核苷酸。
4.由包含要求1或要求2中多核苷酸的至少10个复制品的序列组成的核苷酸。
5.由包含要求1或要求2中多核苷酸的至少100个复制品的序列组成的核苷酸。
6.由包含要求1或要求2中多核苷酸的2到1000个复制品的序列组成的核苷酸。
7.要求6中的核苷酸，其中包含由5到250个多核苷酸复制品组成的序列。
8.要求3到7中任一种核苷酸，其中序列长度为1到2001Λ。
9.要求8中的核苷酸，其中序列长度为15到观吐。
10.含有要求1或要求2中多核苷酸的甘蔗着丝粒。
11.含有要求3到9中任一种核苷酸的甘蔗着丝粒。
12.含有要求1或要求2中多核苷酸的甘蔗人工染色体。
13.含有要求3到9中任一种核苷酸的甘蔗人工染色体。
14.含有要求10或要求11中甘蔗着丝粒的甘蔗人工染色体。
15.要求12到14中任一种甘蔗人工染色体，其中含有一个外源性核苷酸。
16.要求15中的甘蔗人工染色体，其中含有至少3个外源性核苷酸。
17.要求15或要求16中的甘蔗人工染色体，其中至少一个外源性核苷酸可连接到在甘蔗植物细胞中具备机能的异源调节序列中。
18.要求17中的甘蔗人工染色体，其中外源性核苷酸是除草剂抗性基因，氮固定基因， 昆虫抗性基因，抗病基因，植物应激诱导基因，养分利用基因，影响植物色素的基因，编码反向或RNA构成酶分子的基因，编码分泌抗原的基因，毒素基因，受体基因，配位子基因，种子贮存基因，激素基因，酶基因，抗体基因，生长因子基因，抗旱性基因，抗热性基因，抗寒基因，抗冻基因，抗过度潮湿基因，盐应激抗性基因或生物燃料基因。
19.要求12到18中任一种甘蔗人工染色体，其中甘蔗植物细胞有丝分裂分离率至少达到 90%。
20.含有要求1或要求2中多核苷酸的载体。
21.含有要求3到9中任一种核苷酸的载体。
22.含有要求10或要求11中甘蔗着丝粒的载体。
23.含有要求12到19中任一种甘蔗人工染色体的载体。
24.含有要求1或要求2中多核苷酸的细胞。
25.含有要求3到9中任一种核苷酸的细胞。
26.含有要求10或要求11中甘蔗着丝粒的细胞。
27.含有要求12到19中任一种甘蔗人工染色体的细胞。
28.含有要求20到23中任一种载体的细胞。
29.要求M到28中任一种细胞，其中包含甘蔗植物细胞。
30.含有一条甘蔗人工染色体的要求四中的甘蔗植物细胞，其中甘蔗人工染色体未整合到甘蔗植物细胞染色体组中。
31.由一条含有外源性核苷酸的甘蔗人工染色体组成的、要求四或要求30中的甘蔗植物细胞，其中出现与外源性核苷酸的表达相关的表型改变。
32.要求31中的甘蔗植物细胞，其中表型改变包含天然基因表达的改变。
33.要求31中的甘蔗植物细胞，其中表型改变包含外源性基因表达的改变。
34.含有要求四到33中任一种甘蔗植物细胞的甘蔗植物组织。
35.含有要求四到33中任一种甘蔗植物细胞的甘蔗植株。
36.含有要求四到33中任一种甘蔗植物细胞的甘蔗植株器官。
37.从要求35中的甘蔗植株中获取的甘蔗种子。
38.含有甘蔗人工染色体、由含甘蔗人工染色体的要求35中的植株培育而来的甘蔗植物子代。
39.使用要求35中的甘蔗植株的方法，其中甘蔗植株是由含外源性核苷酸编码的重组蛋白质的甘蔗人工染色体组成，该方法包括培育植株制造重组蛋白质。
40.要求30中的方法，进一步包括收获或处理甘蔗植株的步骤。
全文摘要
本发明大体上与含有甘蔗着丝粒序列的甘蔗微型染色体和重组染色体有关。此外，本发明也提供了由这些甘蔗微型染色体转化形成甘蔗植株的方法。含异常组分和结构的甘蔗微型染色体被用于转化依次用来生成甘蔗植株的甘蔗细胞。生成甘蔗植株的方法包括将甘蔗微型染色体注入甘蔗细胞中以转化细胞的方法，选择变异细胞的方法，以及分离甘蔗微型染色体或重组染色体转化后的甘蔗植株的方法。
文档编号C12P19/34GK102498220SQ201080033169
公开日2012年6月13日 申请日期2010年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者D.普罗伊斯, G.P.科彭哈弗, J.M.马赫, P.巴龙, S.R.卡尔森, 罗松 申请人:先正达参股股份有限公司