专利名称：猿腺病毒41及其应用的制作方法
猿腺病毒41及其应用关于联邦资助下研发的声明本项工作部分受到国立卫生研究院的基金，NIH基金号P30-DK47757的支持。美国政府对本发明享有一定权利。电子形式提交的资料通过引用纳入申请人:将以电子形式提交的序列表材料通过引用纳入本文。这些文件标记为 "UPN-U4710PCT_ST25. txt”。
背景技术：
腺病毒是双链DNA病毒，基因组大小约为36千碱基(1Λ)，由于能在多种靶组织中实现高效基因转移以及较大的转基因容量，它被广泛用于基因转移应用。通常，腺病毒的El 基因缺失，被替换为由所选启动子、感兴趣基因cDNA序列和聚A信号组成的转基因盒，从而产生复制缺陷型重组病毒。腺病毒的形态特征是由三种主要蛋白和许多其他小蛋白VI、VIII、IX、IIIa和 Iva2组成的二十面体衣壳，这三种主要蛋白是六邻体(II)、五邻体基质(III)和突结尾丝 (knobbed fibre)(IV)[W. C. Russell, J. Gen Virol.，81 :2573-3704(2000 年 11 月)]。病毒基因组为线形双链DNA，末端蛋白共价连接于含有反向末端重复(ITR)的5’末端。病毒 DNA与高碱性蛋白VII和小肽pX(之前称为mu)密切相连。另一种蛋白V与此DNA-蛋白复合物包装在一起，并通过蛋白VI提供与衣壳的结构连接。该病毒也含有病毒编码的蛋白酶，这种蛋白酶是加工某些结构蛋白以产生成熟的感染性病毒所必需的。已经开发了一种对包括人、猿、牛、马、猪、羊、犬和负鼠腺病毒在内的哺乳动物腺病毒家族进行分类的方法。这种分类方法的开发依据该家族内的腺病毒序列凝集红血细胞的能力不同。结果得到了六个亚组，现在称为亚组A、B、C、D、E和F。参见T. Sienk等， “腺病毒科病毒及其复制”(Adenoviridae :The Viruses and their Replication), it g B. N Fields等编的《菲尔德病毒学》(FIELD' S VIROLOGY)第6版，第67章，(LR出版社 (Lippincott Raven Publishers)，费城，1996)，第 111-2112 页。已报道可使用重组腺病毒将异源分子递送至宿主细胞。参见美国专利6，083，716， 它描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。猿腺病毒C5、C6和C7已经描述于美国专利 7，247, 472，它可用作疫苗载体。其他黑猩猩腺病毒描述于WO 2005/1071093，可用于制造腺
病毒疫苗载体。本领域需要其它腺病毒分离物用于制备可用于治疗和/或免疫应用的载体。发明概述本文提供了猿腺病毒41 (SAdV-41)的分离核酸序列和氨基酸序列，以及含有这些序列的载体。还提供了利用本发明载体和细胞的许多方法。本文所述方法包括通过给予本发明的载体将一种或多种所选异源基因递送给哺乳动物患者。用本文所述组合物进行疫苗接种能够呈递所选抗原从而引发保护性免疫反应。基于猿腺病毒41的载体也可用于体外产生异源基因产物。此类基因产物可用于各种目的，例如本文描述的。
下文将更加详细地描述本发明的这些和其它实施方式以及优点。发明详述本发明提供了分离自黑猩猩排泄物的猿腺病毒41的新型核酸和氨基酸序列。还提供了新型腺病毒载体和产生那些载体的包装细胞系，以便用于体外产生重组蛋白质或片段或其它制剂。还提供了用于递送异源分子的组合物以供治疗或疫苗目的。此类治疗性或疫苗组合物含有携带插入的异源分子的腺病毒载体。此外，所述新型SAdV-41序列可用于提供产生重组腺相关病毒(AAV)载体所必需的辅助功能。因此，提供了在此种产生方法中利用这些序列的辅助构建物、方法和细胞系。本发明人测定到SAdV-41序列与人亚组B腺病毒处于同一亚组。以前根据限制性酶消化谱将人亚组B腺病毒细分成B :1和B :2亚进化支，发现它们分别成簇。SAdV-41簇含人B :1分离物。在一个实施方式中，本发明提供称为SAdV41. 1的新型腺病毒分离物。在另一实施方式中，本发明提供称为SAdV41. 2的新型腺病毒分离物。这两种分离物具有氨基酸水平 100%相同的六邻体蛋白(即，SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:44相同)。除了另有表述之处， 本文所述的构建物及腺病毒序列和构建物的应用适用于本文所述的SAdV41分离物。术语“基本上同源”或“基本上相似”指核酸或其片段时，表示当任选比对含相应核苷酸插入或缺失的序列与另一核酸(或其互补链)时，所比对序列有至少约95、96、97、98、 98. 5、99或99. 5%的核苷酸序列相同。术语“基本上同源”或“基本上相似”指氨基酸或其片段时，表示当任选比对含相应氨基酸插入或缺失的序列与另一氨基酸(或其互补链)，所比对序列有至少约95、96、97、 98、98.5、99或99.5%氨基酸序列相同。优选在全长序列，或其蛋白，或其至少8个氨基酸、 或更理想至少15个氨基酸长度的片段上具有所述同源性。本文描述了合适片段的实例。
就核酸序列而言，术语“序列同一性百分比”或“相同”指当比对最大对应性时，两个序列中的残基相同。序列同一性比较的长度需要是基因组全长(例如，约361Λρ)、基因的开放读框的全长、蛋白、亚基、或酶[参见，例如提供腺病毒编码区的表]、或至少约500到 5000个核苷酸的片段。然而，也可能需要较小片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸、 通常至少约20到M个核苷酸、至少约观到32个核苷酸、至少约36或更多核苷酸的片段。 类似地，不难测定氨基酸序列、蛋白全长或其片段的“序列同一性百分比”。片段长度宜是至少长约8个氨基酸，也可最多约700个氨基酸。本文描述了合适片段的实例。在一个实施方式中，所比对序列有至少约95、96、97、98、98. 5、99或99. 5%的氨基酸同一性。利用文中所述用默认设置的算法和计算机程序不难测定同一性。优选在蛋白质、 酶、亚基的全长或至少约8个氨基酸长度的片段上具有这种同一性。然而，同一性可基于较短的区域，适合使用相同基因产物的区域。如本文所述，用各种公共可得或可购得的多序列比对程序进行比对，例如可通过互联网Web服务器获得的“Clustal W"。或者，也可使用载体NTI 实用程序[英杰公司 (InVitrogen)].还有许多本领域已知的算法也可用于检测核苷酸序列同一性，包括包含在上述程序中的算法。再例如，可使用GCG 6.1版中的程序!^asta来比较多核苷酸序列。 Fasta可对查询序列与检索序列之间最佳重叠区域进行比对并提供序列同一性百分比。例如，可使用GCG 6. 1版提供的Fasta及默认参数(字长为6和用于计分矩阵的NOPAM系数)来确定核酸序列之间的序列同一性百分比，通过引用纳入本文。可采用相似程序进行氨基酸比对。虽然本领域技术人员可视需要改变设定值，但通常这些程序都利用默认设定值。或者，本领域技术人员也可采用能够象上述算法和程序一样至少提供同一性水平或进行比对的另一算法或计算机程序。“重组”用于多核苷酸时表示该多核苷酸是产生不同于天然发现的多核苷酸的构建物的克隆、限制或连接步骤以及其它过程的各种组合的产物。重组病毒是其中包装了异源多核苷酸(例如，表达盒)的病毒颗粒。在某些实施方式中，可产生不含表达盒或其它异源多核苷酸的病毒颗粒。此类构建物可用于本文并称为“空衣壳”，例如2008年1月M日出版的国际专利公布号WO 2008/010864所述。该术语分别包括原始多核苷酸构建物的复制物以及原始病毒构建物的子代。“异源”表示衍生自与所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实体。例如，通过遗传工程技术引入来源于不同物种的质粒或载体的多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列上取下并操作性连接于天然情况下不连接的编码序列的启动子是异源启动子。已被克隆入病毒基因组或病毒载体中的位点特异性重组位点是异源重组位点，其中所述病毒基因组在天然情况下不含该位点。当具有重组酶编码序列的多核苷酸被用于遗传改变正常情况下不表达该重组酶的细胞时，多核苷酸和重组酶对于该细胞都是异源的。本说明书和权利要求书中所用的术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包括” 等其它形式，指包含其它组分、元素、数值、步骤等。术语“由...组成”不包括其它组分、元件、整数、步骤等。I.猿腺病毒序列本发明提供了各分离自天然相关的其它材料的猿腺病毒41 (SAdV-41)的核酸序列和氨基酸序列。A.核酸序列本文提供的SAdV-41. 1核酸序列包括SEQ ID NO 1的核苷酸1-35100。参见通过引用纳入本文的序列表。SAdV41.2的核苷酸序列，1到35776见SEQ ID NO :34。在一个实施方式中，本发明的核酸序列还包括分别与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :34的序列互补的链，以及以下序列和它们的互补链的序列的相应RNA和cDNA序列。在另一实施方式中，所述核酸序列还包括与序列表有98. 5%以上，更优选约99%以上相同的序列。一个实施方式中还包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :34中所提供序列以及它们互补链的天然变体和工程构建修饰物。例如，此类修饰包括本领域已知的标记、甲基化、以及用简并核苷酸取代一个或多个天然产生的核苷酸。表 权利要求
1.一种具有SAdV-41衣壳的腺病毒，所述衣壳使异源分子衣壳化，所述异源分子携带操作性连接于表达控制序列的基因，而所述表达控制序列指导所述基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表达。
2.如权利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒还包含复制和衣壳化所需的 5’和3’腺病毒顺式元件。
3.如权利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒缺乏所有或部分的El基因。
4.如权利要求3所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是复制缺陷型的。
5.一种病毒载体，其包含猿腺病毒41 (SAdV-41)衣壳，所述衣壳包含选自下组的衣壳蛋白(a)SAdV-41. 1的六邻体蛋白，SEQ ID NO 11的氨基酸1-943 ；(b)SAdV-41. 1的五邻体蛋白，SEQ ID NO 6的氨基酸1-584 ；和(c)SAdV-41. 1 的尾丝蛋白，SEQ ID NO 21 的氨基酸 1-321 ；(d)SAdV-41. 2的六邻体蛋白，SEQ ID NO 44的氨基酸1-943 ；(e)SAdV-41. 2的五邻体蛋白，SEQ ID NO 39的氨基酸1-584 ；和(f)SAdV-41. 2 的尾丝蛋白，SEQ ID NO 54 的氨基酸 1-325。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒。
7.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述病毒具有杂交衣壳。
8.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体包含选自SAdV-41的多个衣壳蛋白。
9.一种重组腺病毒，其具有包含六邻体的衣壳和SAdV-41的异源核酸序列，所述六邻体含有猿腺病毒-41 (SAdV-41)六邻体蛋白的片段，其中所述SAdV-41六邻体蛋白的片段具有长约50个氨基酸的N-端和/或C-端截短的SEQ ID NO 11或44所示氨基酸序列，或选自下组SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 44 的氨基酸残基 125-443 ； SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 44 的氨基酸残基 138-441 ； SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 44 的氨基酸残基 138-163 ； SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 44 的氨基酸残基 170-176 ；禾口 SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 44 的氨基酸残基 404-430。
10.如权利要求9所述的重组腺病毒，其特征在于，所述衣壳还包含SAdV-41尾丝蛋白。
11.如权利要求9所述的重组腺病毒，其特征在于，所述衣壳还包含SAdV-41五邻体蛋白。
12.如权利要求9所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是假型腺病毒，包含复制和衣壳化所需的5’和3’腺病毒顺式元件，所述顺式元件包含腺病毒5’反向末端重复和腺病毒3’反向末端重复。
13.如权利要求9所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒包含编码产物的核酸序列，该序列操作性连接于指导所述产物在宿主细胞中表达的序列。
14.如权利要求9所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒包含一种或多种腺病毒基因。
15.如权利要求9所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒是复制缺陷型的。
16.如权利要求15所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒缺失腺病毒El。
17.—种组合物，其在药学上可接受的载体中包含权利要求1-4中任一项所述病毒、权利要求5-8中任一项所述的载体或权利要求9-16中任一项所述的重组腺病毒。
18.—种靶向具有腺病毒受体的细胞的方法，包括将权利要求1-4中任一项所述病毒或权利要求9-18中任一项所述的重组腺病毒递送给对象。
19.一种分离的猿腺病毒41 (SAdV-41)核酸，其选自下组SEQ ID NO 1的核酸 1-；35100、其互补序列、对应于其的cDNA和RNA，和SEQ ID NO 34的核酸1_；35767、其互补序列、对应于其的cDNA和RNA。
20.一种包含猿腺病毒41 (SAdV-41)核酸序列的载体，所述核酸序列选自下组中的一个或多个(a)5，反向末端重复(ITR)序列；(b)腺病毒Ela区；(c)腺病毒Elb区，或其选自下组的片段小T、大Τ、IX和IVa2区的开放读框；(d)E2b区；(e)Ll区，或其选自下组的片段28. IkD蛋白、聚合酶、未知蛋白(agnoprotein)、 52/55kD蛋白和IIIa蛋白的开放读框；(f)L2区，或其选自下组的片段五邻体、VII、VI和Mu蛋白的开放读框；(g)L3区，或其选自下组的片段VI、六邻体或内切蛋白酶的开放读框；(h)Eh蛋白；(i)L4区，或其选自下组的片段100kD蛋白、33kD同源物、22kD同源物和VIII的开放读框；(j)E3 区，或其选自下组的片段E3 0RF1、E3 0RF2、E3 0RF3、E3 0RF4、E3 0RF5、E3 0RF7、E3 0RF8和E3 0RF9的开放读框；(k)L5区，或其选自尾丝蛋白的开放读框的片段；(1)E4 区，或其选自下组的片段E4 0RF7、E4 0RF6、E4 0RF4、E3 0RF3、E4 0RF2 禾口 E4 ORFl的开放读框；和(m) SAdV-41. 1，SEQ ID NO 1 的 3' ITR 或 SAdV41. 2，SEQ ID NO :34 的 3，ITR。
21.权利要求20所述核酸序列编码的猿腺病毒41蛋白。
22.—种组合物，其包含选自下组的一种或多种猿猴腺病毒41蛋白 Ela，其具有SEQ ID NO 29或SEQ ID NO 63所示氨基酸序列；Elb,/Jn T/19K，其具有 SEQ ID NO 23 或 SEQ ID NO 56 所示氨基酸序列； Elb，大T/55K，其具有SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 35所示氨基酸序列； IX，其具有SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 36所示氨基酸序列； 52/55D，其具有SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 37所示氨基酸序列； Illa，其具有SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 38所示氨基酸序列； 五邻体，其具有SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 39所示氨基酸序列； VII，其具有SEQ ID NO :7或SEQ ID NO 40所示氨基酸序列； V，其具有SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 41所示氨基酸序列； pX，其具有SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 36所示氨基酸序列；VI，其具有SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 43所示氨基酸序列； 六邻体，其具有SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 44所示氨基酸序列； 内切蛋白酶，其具有SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 58所示氨基酸序列； IOOkD,其具有SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 59所示氨基酸序列； 33kD，其具有SEQ ID NO 31或SEQ ID NO 65所示氨基酸序列； 22kD，其具有SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 45所示氨基酸序列； VIII，其具有SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 46所示氨基酸序列； E3/12. 5K，其具有SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 47所示氨基酸序列； CRl-α，其具有SEQ ID NO 26或SEQ ID NO 60所示氨基酸序列； gpl9K，其具有SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 48所示氨基酸序列； CRl-β，其具有SEQ ID NO 17或SEQ ID NO 49所示氨基酸序列； CRl- Y，其具有SEQ ID NO 18或SEQ ID NO 50所示氨基酸序列； RID-α，其具有SEQ ID NO 19或SEQ ID NO 52所示氨基酸序列； RID-β，其具有SEQ ID NO 27或SEQ ID NO 61所示氨基酸序列； Ε3/14. 7Κ，其具有SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 53所示氨基酸序列；和尾丝，其具有SEQ ID NO :21或SEQ ID NO 54所示氨基酸序列。
23. —种靶向具有腺病毒受体的细胞的方法，包括将权利要求22所述的组合物递送给对象，所述组合物包含一种或多种选自六邻体、五邻体或尾丝的猿腺病毒41蛋白。
全文摘要
本发明描述了新型猿腺病毒41及其两种分离物。提供了这些分离物的各种应用，包括构建包含在调控序列控制下的猿腺病毒41序列和异源基因的重组载体。还公开了表达一种或多种猿腺病毒41基因的细胞系。提供了利用所述载体和细胞系的方法。
文档编号C12N15/861GK102575232SQ201080033150
公开日2012年7月11日 申请日期2010年5月27日 优先权日2009年5月29日
发明者J·M·威尔森, L·H·范登伯格, S·罗伊 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会