包含表达增强子的真核宿主细胞的制作方法

专利名称：包含表达增强子的真核宿主细胞的制作方法
包含表L大j曾强子的真核宿主细胞，本发明涉及包含表达增强子的真核宿主细胞及其在目的蛋白(protein ofinterest, Ρ0Ι)生产方法中的用途。蛋白的成功分泌已在原核和真核宿主中都有实现。最显著的例子是诸如大肠杆菌的细菌；诸如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或者多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的酵母菌；诸如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或者瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的丝状真菌；或者诸如CHO细胞的哺乳动物细胞。虽然某些蛋白可以很容易地达到高水平分泌， 许多其他蛋白只能以较低水平分泌(Punt et al.，2002 ；Macauley-Patrick et al.，2005 ； Porro et al. ,2005)。提高重组蛋白的分泌的一种方法是通过随机突变(Archer et al. , 1994 ；Lang and L00man，19%)。这种方法的主要缺点是阳性结果通常不能转化到其他菌株上。真核生物(例如酵母)的分泌途径-蛋白的折叠和加工是非常复杂的，有许多相互作用的参与成分。这些蛋白中的一些对诸如二硫键异构酶(PDI)的蛋白有催化活性，其他一些通过与蛋白结合并阻止它们聚集(分子伴侣，例如BiP)或者通过在分泌途径后面的步骤中刺激蛋白释放到细胞外部(SS0蛋白)来发挥作用。由于这种相互依赖，提高分泌途径中一个反应步骤的速率可能不会自动增加目的蛋白的分泌，而是可能导致随后一个或多个反应步骤被限速，因此不是除去了而只是转移了表达系统的瓶颈。多个例子表明可以借助过表达被称为“辅助因子”的一类蛋白质来增强异源蛋白的分泌(Mattanovich et al.，2004)。WO 2008/128701A2描述了用于增加从真核细胞分泌POI的表达系统，所述系统采用 了选自 BMH2、BFR2、⑶g6、COYl、CUP5、IMHl、KIN2、SEC31、SSA4 和 SSE1 的分泌辅助因子。 相关基因从酿酒酵母的cDNA芯片获得。Gasser等 OVpplied and Environmental MicrobiologH2007)6499-6507)描述了酵母菌中鉴定能够增强异源蛋白分泌的新因子的基于转录组的方法。利用DNA芯片杂交试验发现了特异的分泌增强蛋白。WO 93/25676中首次建议将编码POI的基因与编码异源二硫键结合蛋白的基因共表达从而作为增加异源蛋白产生的手段。WO 93/25676报道安逖斯塔辛(antistasin)和蜱抗凝血肽蛋白的重组表达可以通过与PDI共表达来提高。WO 94/08012提供了通过增加Hsp70伴侣蛋白(即KAR2和BIP或PDI伴侣蛋白)
的表达来提高酵母菌中蛋白质分泌的方法。WO 03/057897提供了通过共表达至少两个基因来重组表达目的蛋白的方法，所述基因编码选自GroEL、GRoES、DnaK、DnaJ、GRpe，ClpB及其同源分子的伴侣蛋白。WO 2005/0617818和WO 2006/067511提供了通过使用基于2 μ m的表达质粒在酵母菌中生产所需异源蛋白的方法。当一或多个伴侣蛋白与异源蛋白的基因在相同质粒上被共表达时，外源蛋白的产量大幅增加。刺激分泌途径的另一种方法是过表达未折叠蛋白反应(UPR)活化转录因子HAC1。 转录分析显示，高达330个基因受到HACl的调控，其中大部分属于分泌或分泌细胞器生物发生的功能组(例如内质网分子伴侣(ER-resident chaperones)、折叠酶、易位因子 (Translocon)成分)。WO 01/72783描述了通过诱导提高未折叠蛋白反应(UPR)从而增加真核细胞分泌外源蛋白的量的方法，其中UPR是通过与选自HAC1、PTC2和IREl的蛋白共表达而调整的。虽然这些方法一旦建立起来可以转移到其他菌株，并用于其他蛋白质，但它们受限于对支持其他蛋白分泌的这些蛋白的功能的实际了解。可以预见的是重组蛋白的高水平分泌，可在多个不同步骤受到限制，如折叠、二硫键形成、糖基化、细胞内的运输或从细胞释放。这些过程中许多还没有被完全理解。根据本领域目前的知识无法预测所述辅助因子功能，即使已经有了宿主生物体的完整基因组DNA 序列。Wentz 和 Shusta(Appl. Environ. Microbiol. (2007)73(4) :1189-1198)采用酿酒酵母的酵母菌表面展示基因库，利用合适的选择压来鉴定分泌改善的菌株。提高scTCR展示的酵母菌cDNA是温度依赖性的CCW12、SEDI、CWP2、RPP0，以及单独的20°C增强子(a lone 20 °C enhancer)的 ER01。发明的一个目的是提供提高真核细胞，特别是提高毕赤酵母属的酵母细胞中分泌蛋白产量的简单有效的新方法。希望提供新基因用于所述方法中，以便借助过表达辅助因子来提高分泌蛋白的产量，其中所述辅助因子可能应用于工业生产方法。本发明另一目的是提供性能改进的重组宿主细胞从而增加POI的产量。通过权利要求所述的发明主题可以解决发明目的。具体地，发明是指包含编码表达增强子的重组核苷酸序列的真核宿主细胞，所述表达增强子选自cLC52、RPL33、cLC61，包括它们的功能活性变体。本发明的宿主细胞优选包含来源于巴斯德毕赤酵母的核苷酸序列。本发明的宿主细胞优选是真菌细胞，更优选是酵母细胞，或更高等的真核细胞，优选哺乳动物或植物细胞。根据发明的特定方面，宿主细胞是毕赤酵母属的细胞，特别是巴斯德毕赤酵母菌株的细胞。本发明一个方面涉及这样的宿主细胞，所述宿主细胞是用于导入编码POI的目标基因的wildcard宿主细胞。本发明另一个方面涉及这样的宿主细胞，所述宿主细胞是包含编码POI的重组核苷酸序列的生产细胞，其能够产生POI。发明优选提供了巴斯德毕赤酵母宿主细胞，所述宿主细胞包含-编码表达增强子的重组核苷酸序列，所述表达增强子选自cLC52、RPL33和 cLC61，和-编码POI的目的基因。编码选自cLC52、RPL33、cLC61的蛋白及其功能活性变体的核苷酸序列优选按照本发明作为表达增强子来提高POI在真核宿主细胞内的表达。本发明还提供了制备生产宿主细胞的方法，包括-提供发明所述wildcard宿主细胞，所述宿主细胞包含编码选自cLC52、RPL33、 cLC61及其功能活性变体的蛋白的重组核苷酸序列，和
-导入编码POI的核苷酸序列。根据替代的实施方案，制备生产宿主细胞的方法包括步骤-提供真核宿主细胞，-导入编码cLC52、RPL33、cLC61及其功能活性变体中至少一个的核苷酸序列，以及-导入编码POI的核苷酸序列。因此，发明提供了在真核细胞内生产POI的方法，所述方法包括步骤-提供发明所述生产宿主细胞，-在细胞培养物中共表达POI和表达增强子，以及-从细胞培养物中获得POI。在本发明的优选方法中，POI是多肽，优选是真核生物多肽，选自诸如免疫球蛋白或血清白蛋白的血清蛋白、酶、激素、信号分子、基质蛋白或者它们的片段或衍生物。在另一优选方法中，POI介导宿主细胞代谢产物的产生，优选POI是底物、酶或辅因子，而代谢产物由该宿主产生以获得足够量的代谢产物。优选地，编码POI的重组核苷酸序列是在质粒上提供的，所述质粒适合整合到宿主细胞的基因组或者在宿主细胞内自主复制。进一步优选质粒是真核表达载体，优选是包含分泌引导序列和/或启动子序列的酵母表达载体，所述分泌引导序列能够有效地引起POI从宿主细胞的分泌，所述启动子序列能够有效地引起POI在宿主细胞内的表达。本发明一方面涉及用于本发明方法的共同过表达质粒 (co-overexpressionplasmid)，所述质粒包含-编码POI的重组核苷酸序列，和-编码选自cLC52、RPL33、cLC61及其功能活性变体的核苷酸序列。发明详述蛋白质的“生物活性片段”或“功能活性片段”意味着与全长蛋白发挥类似或相当的生物效应的蛋白质片段。表达增强子的功能活性片段特征在于来源于SEQ ID NO 1-4 的表达增强子通过一或多个缺失得到的多肽或核苷酸序列，包含至少50%的序列、优选至少70 %、更优选至少80 %、更优选至少90 %、再更优选至少95 %，最优选至少97 %、98 %、 99%。序列同一性可以如下所述进行确定。这类片段可以通过例如氨基和羧基端缺失以及内部缺失来产生。优选片段是通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失；更优选1、2、3、4或5 个；更优选1、2或3个；再更优选1或2个；最优选1个缺失获得的。名词“衍生物”涵盖一或多个化合物(例如多肽或蛋白质)的任何组合，和/或融合化合物，其中化合物的任何部分可以在任何位置与一或多个其他多肽融合。衍生物也可以借助各种化学技术，比如共价偶联、静电相互作用、二硫键合等，通过与其他物质的关联或结合来获得。与所述化合物结合的其他物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或者它们的任何组合(例如PEG、前药或药物)。名词“衍生物”还包括变体，后者可能含有非天然的或者化学修饰的氨基酸，和化合物的片段。应当明白名词cLC52、RPL33或 cLC61也指它们的衍生物，所述衍生物可能是功能等同体或者功能活性变体，和/或具有类似或改进的功能。
此处使用的“表达载体”被定义为克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)在合适宿主生物体中的转录以及它们的mRNA的翻译所需要的DNA序列。这种表达载体通常包含用于在宿主细胞中自主复制的复制原点、选择性标记(例如氨基酸合成基因或赋予对抗生素(比如博莱霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)、多个限制性内切酶酶切位点、 合适的启动子序列和转录终止子，这些成分可操纵地连在一起。名词“真核宿主”是指任何可以被培养来表达POI的真核细胞或生物体。共识这一名词不包括人类。用于本文，名词多肽或核苷酸序列的“功能等同变体”或“功能活性变体”是指对序列内部或者序列的一个或两个远端的一或多个氨基酸或核苷酸进行插入、删除或替换等修饰得到的序列，并且所述修饰不影响(特别是损害)这个序列的活性。在优选实施方案中，功能活性变体a)是多肽或核苷酸序列的生物活性片段，功能活性片段包含多肽或核苷酸序列的至少50 %的序列，优选至少70 %、更优选至少80 %、更优选至少90 %、再更优选至少95%、最优选至少97%、98%或99% ；b)来源于多肽或核苷酸序列经过至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失，其中所述功能活性变体与多肽或核苷酸序列或者a)中定义的功能活性片段的序列同一性是至少40 %，优选至少60 %，更优选至少75 %，更优选至少90 %，再更优选至少95%，最优选至少97%、98%或99% ；和/或c)由多肽或核苷酸序列或其功能活性变体以及额外的对于所述多肽或核苷酸序列是外源的至少一个氨基酸或核苷酸组成， 优选其中所述功能活性变体来源于SEQ ID NO :1、2、3或4中任一序列的任何天然变体或者与其相同。功能活性变体可以如上所述通过对序列进行改变来获得，其特征在于具有与变体所来源的SEQ ID NO :1-4中相应序列所展示的类似的生物活性，包括能够增强POI在重组细胞内的表达的能力。当用于本发明时，功能活性变体可以通过多肽或核苷酸序列中的序列变化来获得，所述序列变化保留了未被改变的多肽或核苷酸序列的功能。所述序列变化包括，但不仅限于(保守性)取代、添加、缺失、突变和插入。多肽或核苷酸序列的变体是本发明语境中的“功能活性的”，如果本发明的组合物 (包括变体，但不是原来的多肽或核苷酸序列)的活性达到发明所述表达增强子的活性的至少10 %，优选至少25 %，更优选至少50 %，更优选至少70 %，再更优选至少80 %，特别是至少90%，特别是至少95%，最优选至少99%，其中所述表达增强子包括不含序列变化的多肽或核苷酸序列，即原来的多肽或核苷酸序列。在发明的一个优选实施方案中，本发明的肽的功能活性变体与SEQ IDNO :1_4的多肽或核苷酸序列基本相同，但分别与多肽或核苷酸序列的区别在于它来源于不同菌株或不同物种的同源序列。这些被称为天然变体。然而，名词“功能活性变体”包括天然等位基因变体，以及突变体或任何其他非天然存在的变体。本领域已知，等位基因变体是(多)肽的另一种形式，其特征在于含有基本不改变多肽的生物功能的一或多个氨基酸取代、缺失或添加。“生物功能”是指多肽或核苷酸序列在它所天然存在的细胞内的功能，即使该功能不是细胞生长或存活所必需的。在优选实施方案中，如上定义通过氨基酸交换、缺失或插入来源于多肽或核苷酸序列的功能活性变体也可能保持，或更优选提高了活性。
保守性取代发生在侧链和化学属性相关的一个氨基酸家族内。这类家族的例子是带有基本侧链、酸性侧链、非极性脂肪族侧链、非极性芳香族侧链、不带电荷的极性侧链、小侧链、大型侧链等的氨基酸。 在发明的另一个实施方案中，如上定义的多肽或核苷酸序列可以通过各种化学技术进行改动来产生衍生物，所述衍生物与改动过的多肽或核苷酸序列具有基本相同的活性 (如同以上给片段和变体的定义中)，任选还具有其他希望的特性。名词“基因产物(‘gene product，或‘product of a gene，)”是生化物质，由基因(比如cLC52、RPL33或cLC61基因)的表达所产生的RNA或蛋白质。用于本文，多肽的“同源物”或“功能同源物”意味着多肽在其一级、二级和三级结构中相应位点上有相同或保守的残基。名词还延伸到编码同源多肽的两个或多个核苷酸序列。具体来说，同源化合物相对全长天然序列或其任何片段通常具有至少大约50%的氨基酸序列同一性。优选地，同源化合物与天然化合物或全长化合物的任何其他特别限定的片段具有至少大约的氨基酸序列特异性，更优选至少大约60%的氨基酸序列同一性，更优选至少大约65%的氨基酸序列同一性，更优选至少大约70%的氨基酸序列同一性，更优选至少大约75%的氨基酸序列同一性，更优选至少大约80%的氨基酸序列同一性，更优选至少大约85%的氨基酸序列同一性，更优选至少大约90%的氨基酸序列同一性，更优选至少大约95%的氨基酸序列同一性。当这样的同源物被证明具有辅助因子功能时，同源物被称为“功能同源物”。用于本文，名词“同源核苷酸序列”是指这样的核苷酸序列，其与被考虑的核苷酸序列在核苷酸序列上相关但不相同，执行基本相同的功能。这也意味着涵盖核苷酸组成上的变化，包括由于遗传密码简并性带来的变化，核苷酸序列由此执行基本相同的功能。名词“宿主细胞”或“宿主细胞系”是指用于重组基因表达产生多肽或由所述多肽介导的代谢物的微生物。被培养宿主细胞经过增殖的宿主细胞克隆通常被认为是宿主细胞系。生产宿主细胞系通常理解是随时可用于生产方法中在生物反应器进行培养来获得基因产物的细胞系。用于本文，名词“可操纵地连接”是指单一核酸分子(例如载体)上核苷酸序列的连接，其连接方式使得一或多个核苷酸序列的功能受到所述核酸分子上存在的至少一个其他核苷酸序列的影响。例如当启动子能够影响重组基因的编码序列的表达时，启动子是可操纵地连接编码序列。就本文指出的多肽序列而言的“氨基酸序列同一性百分比(％ ) ”定义为将序列排列对位并按需要引入空位以达到最大的序列同一性百分比后，候选序列中与特定多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不把任何保守取代认为是序列同一性的一部分。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括被比较的序列在全长达到最佳比对所需的任何算法。用于本文，名词“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列和基因组整合核苷酸序列。名词“多肽”是指含有两个或更多个氨基酸的蛋白或肽，一般是含有至少3个，优选至少20个，更优选至少30个，更优选至少50个氨基酸。该名词还指较高分子量的多肽， 比如蛋白质。下文中名词“多肽”和“蛋白质”可以互换使用。
用于本文，“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。启动子活性是通过它的转录效率来评价的。这可以通过例如Northern印迹测量从启动子开始的mRNA转录量来直接确定，也可以通过测量从该启动子表达的基因产物的量来间接确定。用于本文，名词“目的蛋白(POI)，，是指通过重组技术手段在宿主细胞内产生的蛋白质。更具体地说，蛋白可以是宿主细胞中不天然存在的多肽，即异源蛋白；或者是宿主细胞天然有的，即对宿主细胞是同源的，但是其产生是通过例如与含有编码POI的核酸序列的自复制载体一起转化，或者编码POI的一或多个拷贝的核酸序列通过重组技术整合到宿主细胞的基因组中，或者通过对控制编码POI的基因的表达的一或多个调控序列(例如启动子序列)进行重组修饰。名词“cLC52”是指与转录调控子有同源性的巴斯德毕赤酵母的多肽。在酿酒酵母中，与cLC52有最高同源性的蛋白质是介导葡萄糖阻遏的转录抑制因子Nrgl和Nrg2。各自的 External ID 是SGD YDR043C, SGD YBR066C. Gene annotation PIPA03435。名词“RPL33”是指rRNA编码的与酿酒酵母RPL33A和RPL3!3B (大(60 核糖体亚基的核糖体蛋白L37)有同源性的巴斯德毕赤酵母的多肽。各自的External ID是S⑶ YPL143W 和 YDR234C。基因标注 PIPA05837。名词“cLC61”是指与肽酶同源的基因编码的巴斯德毕赤酵母的多肽。基因标注 PIPA02482o用于本文，名词“cLC52、RPL33或cLC61 ”对基因和基因产物可互换使用。以下提供了这些多肽的序列信息。为了本发明，这些因子也被称为辅助因子或表达增强子。名词涵盖全长蛋白或者其功能活性变体(包括生物活性片段和功能同源物)。获得这样可用于蛋白表达和/或分泌的基因和基因产物是令人惊奇的，这些基因和基因产物迄今还未被定性为功能性辅助因子。发现这方面相关基因是cLC52、RPL33和 cLC61，它们在共表达时能够提高蛋白的产量。这些基因具有的功能不会估计与POI表达和 /或分泌有关。为了证明相关基因的辅助因子功能，将来源于生长在各种培养条件下的不同巴斯德毕赤酵母菌株的cDNA文库在巴斯德毕赤酵母菌株中共同过表达，所述酵母菌在细胞表面展示单克隆抗体的Fab片段。荧光染色后的荧光信号提高的菌株借助高通量荧光活化细胞分拣术进行富集。经过几轮培养和分拣后，优选经过几轮严紧度增加的分拣(例如以非常严紧的单细胞模式)富集后，可以鉴定到基因RPL33、cLC52和cLC61对表面展示的Fab 片段的量有正效应，这些基因以前没有被与分泌途径联系起来。以前利用常规的DNA芯片技术没有鉴定到这些辅助因子。一或多个基因的共表达对POI表达有正面影响，使得即使生物量累计下降，产物浓度仍有提高。因此可以得到更高的特定产物产量。实施例1中有更详细的试验过程描述。鉴定到的基因从巴斯德毕赤酵母cDNA经 PCR扩增，克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体中，转化入预先挑选的巴斯德毕赤酵母菌株中用于各种不同POI经表面展示或分泌的高水平产生。为了估计共表达基因对表面展示或分泌的重组POI的影响，可以将按照发明得到的巴斯德毕赤酵母菌株在摇瓶试验和分批补料或恒化发酵中培养，与只表达POI的菌株比较。共同过表达研究中，三个基因都导致细胞表面信号增加。特别是共同过表达的cLC52显著增加了分泌的POI的量。根据发明的优选模式，重组核苷酸序列包含cLC52基因(kq. ID No. 1)或其功能活性变体。根据发明的另一个优选模式，重组核苷酸序列包含RPL33基因(分别是kq. ID No. 2和幻或其功能活性变体。根据发明的另一个优选模式，重组核苷酸序列包含cLC61基因(kq. IDNo. 4)或其功能活性变体。借助本发明的辅助因子，发明所述方法不仅通过表达增强而提高了产量，而且使 POI在真核细胞中的分泌增加。在有或没有共表达所述能够增加蛋白分泌的蛋白的情况下， 比较POI的分泌产量，在此基础上确定POI分泌增加。POI可以是任何真核或原核多肽。可以是天然的分泌蛋白或胞内蛋白(即天然不分泌的蛋白)。本发明还提供了天然分泌蛋白或非天然分泌蛋白的功能同源物、功能活性变体、衍生物和生物活性片段的重组制备。功能同源物优选与序列相同或者对应该序列并具有序列的功能特性。本文提到的分泌POI可以，但不限于，是适合作为生物医药物质的蛋白，比如抗体或抗体片段、生长因子、激素、酶、疫苗或可以用在工业用途上的蛋白质，例如酶。优选POI是异源重组多肽或蛋白，在真核细胞，优选是酵母细胞中以分泌蛋白产生是有益的。优选产生的蛋白的例子是免疫球蛋白、抑肽酶、组织因子通道抑制剂或其他蛋白酶抑制剂，以及胰岛素或胰岛素前体、胰岛素类似物、生长激素、白介素、组织纤溶酶原激活剂、转化生长因子a或b、胰升糖素、胰升糖素样肽1 (GLP-I)、胰升糖素样肽2 (GLP-2)、 GRPP、因子VII、因子VIII、因子XIII、血小板源性生长因子1、血清白蛋白、诸如酯酶或蛋白酶的酶、或者这些蛋白任一种的功能类似物。在本文语境中，名词“功能类似物”是指具有类似于天然蛋白的功能的多肽。多肽可能与天然蛋白结构类似，可能由天然蛋白通过在天然蛋白的C或N末端或者侧链添加一或多个氨基酸；在天然氨基酸序列中一或多个不同位点取代一或多个氨基酸；在天然蛋白的任一端或两端或者氨基酸序列中的几个位点缺失一或多个氨基酸；或者在天然氨基酸序列中的一或多个位点插入一或多个氨基酸得到的。这类改动对以上提及的多个蛋白是已知的。另一个实施方案中，POI是真核蛋白或其生物活性片段，优选是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，比如Fc片段或Fab片段。最优选地，POI是单克隆抗HIVl抗体2F5的Fab片段。POI还可以选自供给宿主细胞内生化反应的底物、酶、抑制剂或辅因子，目的在于获得所述生化反应或者几个反应级联的产物(例如宿主细胞的代谢物)。示范性的产物可以是诸如核黄素的维生素、有机酸和醇，按照本发明表达P0I，可以获得产量提高的这些产物。一般来说，从那里分泌蛋白的宿主细胞可以是任何适合重组表达POI的真核细胞。优选的作为本发明宿主细胞的酵母细胞例子包括，但不限于酵母属(例如酿酒酵母)、毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母或嗜甲醇毕赤酵母hKomagataella属 (K. pastoris、K. pseudopastoris或K. phaffii)、多形汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。
较新的文献将巴斯德毕赤酵母分类并重新命名为Komagatael lapastoris、 Komagataella phaffii 禾口 Komagataella pseudopastoris(Kurtzman, 2005)。 本文中巴斯德毕赤酵母作为 Komagataella pastoris、Komagataellaphaffii 禾口 Komagataella pseudopastoris的同义词使用。根据发明优选使用的酵母生产生物体可以是任何合适的酵母生物体，在培养时产生大量的目标异源蛋白或多肽。合适的酵母生物体的优选例子是选自以下酵母种的菌株 酉良氏## (Saccharomyces kluyveri) > ^ ^ (Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、假丝酵母、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、白地霉(Geotrichum)禾口发酵白地霉(Geotrichum fermentans)。最优选的酵母宿主细胞来源于甲醇营养型酵母(methylotrophic yeast)，比如来自毕赤酵母或Komagatae 11a，例如巴斯德毕赤酵母或Komoagataellapastoris或 K. phaffii或K. pseudopastoris。宿主的例子包括诸如巴斯德毕赤酵母的酵母菌。巴斯德毕赤酵母菌株的例子包括 CBS 704( = NRRL Y-1603 = DSMZ 70382) ,CBS 2612( = NRRL Y-7556), CBS 7435( = NRRL Y-11430)、CBS9173-9189 和 DSMZ 70877 (German Collection of Microorganisms and CellCultures)；酿酒酵母菌株的例子包括W303、CEN. PK和BY-系列(EUROSCARF collection)。所有上述菌株都曾成功用于制备转化子和表达异源基因。一般来说，本文中的目的蛋白是通过本领域技术人员熟知的重组表达方法产生的。应当理解，本文公开的方法还进一步包括在允许POI表达的条件下培养所述重组宿主细胞。然后可以通过本领域技术人员已知的技术从细胞培养基中分离分泌出来的重组制备的POI并进行纯化。编码提高蛋白分泌的蛋白的核苷酸序列可以从多种来源获得。重组辅助因子核苷酸序列(又称为“辅助因子基因”)的来源根据发明优选来自植物、昆虫、真菌或细菌物种， 优选来自酵母菌，更优选来自与宿主酵母菌株不同的酵母菌株以便获得重组菌株。根据发明优选的毕赤酵母宿主细胞，比如巴斯德毕赤酵母宿主细胞，含有外源辅助因子基因，所述基因优选来源于酿酒酵母菌株或与生产宿主不同的另一个巴斯德毕赤酵母菌株。在另一个特定实施方案中，发明所述宿主细胞包含重组核苷酸序列，其中的辅助因子基因与宿主细胞来源于相同菌株。根据发明的特定实施方案，辅助因子基因优选获得自和生产宿主细胞同一属的源细胞。例如，编码发明所述表达辅助因子之一的核苷酸序列可以来源于酵母菌，比如酿酒酵母菌株，并用于在酵母菌(比如酿酒酵母生产宿主细胞系)中与POI共表达辅助因子。特别优选的实施方案涉及编码来自巴斯德毕赤酵母的辅助因子的重组核苷酸序列，所述序列用于在巴斯德毕赤酵母生产宿主细胞系中共表达辅助因子和POI的方法中。核苷酸序列的同源性来源促进它进入相同属的宿主细胞内，因此能够在工业生产流程中稳定地生产产量可能得到提高的P0I。同样可以使用来自其他合适的酵母菌或其他真菌或者来自诸如脊椎动物的其他生物体的功能等同核苷酸序列。在发明另一个优选实施方案中，使用了分离自酿酒酵母的辅助因子核苷酸序列，特别是作为真核细胞中POI分泌的增强剂，所述真核细胞优选是酵母细胞，最优选是巴斯德毕赤酵母菌株的细胞。根据发明，也可能提供发明所述的wildcard宿主细胞，所述宿主细胞包含辅助因子基因中的至少一个，并且待引入编码POI的目的基因。因此所述wildcard细胞系是预先形成的宿主细胞系，已确定了它的表达能力。这遵循了创新的“wildcard”策略，该策略用于利用例如定点重组酶介导的盒式交换来制备生产生物药物所使用的生产细胞系(又称为表达宿主细胞系)。这种新宿主细胞协助GOI在几天内即可克隆到例如预先确定的基因组表达热点，从而得到可以繁殖的高效生产细胞系。根据发明，优选提供巴斯德毕赤酵母宿主，所述宿主包含的辅助因子基因可操纵地连接编码POI的核苷酸序列。根据优选实施方案，发明的方法应用了编码POI的重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列是以每细胞单一拷贝或多拷贝在适合整合到宿主细胞基因组的质粒上提供的。编码POI的重组核苷酸序列还可以以每细胞单一拷贝或多拷贝在自主复制质粒上提供。替代地，编码POI的重组核苷酸序列和编码能够提高蛋白分泌的蛋白的核苷酸序列以每细胞单一拷贝或多拷贝存在于同一质粒上。发明的优选方法采用了质粒，所述质粒是真核表达载体，优选是酵母表达载体。表达载体可以包括但不限于克隆载体、改动的克隆载体和特别设计的质粒。用于发明的优选表达载体可以是适合在宿主细胞中表达重组基因的任何表达载体，根据宿主生物体进行选择。重组表达载体可以是能够在宿主生物体内复制或者整合到其基因组内的任何载体，又称为宿主载体，比如酵母载体，其携带本发明的DNA构建体。优选的酵母表达载体是用于在选自以汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母和球拟酵母(Torulopsis)属为代表的甲醇营养型酵母酵母菌中进行表达的载体。本发明中，优选使用pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis 或来源于PPraZLE的质粒作为载体。根据本发明的优选实施方案，重组辅助因子基因、POI基因或重组宿主细胞是通过将相关基因连接到载体中并构建携带基因的单一载体或者分别携带辅助因子基因和POI 基因的独立载体而得到的。通过用所述载体转化宿主细胞，这些基因可以稳定地整合到宿主细胞基因组中。制备这些基因所编码的多肽可以利用重组宿主细胞系通过培养转化子， 从而在合适的培养基中获得多肽，从培养基中分离表达的Ρ0Ι，并通过适合表达产物的方法对它进行纯化，特别是将POI与共表达的辅助因子分开。可以根据发明对相关基因进行改动从而在宿主细胞内高度表达。基因的改动可以通过对基因序列的优化使之对应宿主中最常用的密码子。例如，可以根据宿主中高度表达的基因所使用的密码子来优化基因序列。几种不同的真核宿主细胞中POI表达和分泌方法是优选的。蛋白的表达、加工和分泌通过用携带编码所需蛋白和信号肽的DNA的表达载体转化真核生物体，准备被转化生物体的培养物，生长培养物和从培养基中回收蛋白。信号肽可以是所需蛋白自己的信号肽、 异源信号肽，或者天然和异源信号肽的杂交体。在本文语境中，名词“信号肽”是指酵母中表达的胞外蛋白的前体形式中以N-末端序列存在的前序列。信号肽的功能是使异源蛋白能被分泌进入内质网。信号肽通常在这个过程中被切除。信号肽对产生蛋白的宿主生物体可以是异源的或同源的。本发明优选的方面涉及这样的方法，所述方法中表达载体包含能够有效导致POI 从宿主细胞分泌出来的分泌前导序列。当意图重组表达和分泌的POI不是天然分泌蛋白， 因此缺少天然分泌前导序列时，或者POI的核苷酸序列克隆时没有包含它的天然分泌前导序列时，需要表达载体中有这种分泌前导序列。分泌前导序列可以来源于酵母来源，例如来自酵母α -因子(比如酿酒酵母的MFd )或者酵母磷酸酶；来源于哺乳动物或植物来源；或者其他。挑选合适的分泌前导序列对本领域技术人员是显而易见的。替代地，分泌前导序列可以通过本领域技术人员已知的常规克隆技术融合至编码要重组表达的POI的核苷酸序列上。在优选实施方案中，POI的核苷酸序列融合了分泌信号，即将蛋白靶向到分泌途径(在这里，信号肽被切割，蛋白释放到培养基中)的肽，例如 α -因子、PHO 或 AGA-2。合适的表达载体包含调控序列，所述调控序列适用于编码异源多肽或蛋白的DNA 在真核宿主细胞中的表达。调控序列的例子包括启动子、操纵子和增强子、核糖体结合位点，以及控制转录和翻译启始和终止的序列。调控序列可以可操纵地连接待表达的DNA序列。例如，如果启动子序列控制着编码序列的转录，所述启动子被称为可操纵地连接编码序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，可以来源于对宿主同源或异源的蛋白的编码基因。启动子优选来源于宿主细胞同源蛋白的编码基因。本发明再一方面涉及这样的方法，所述方法中表达载体包含能有效导致POI在宿主细胞中的表达的启动子序列。为了在宿主细胞中表达重组核苷酸序列，表达载体可以给重组核苷酸序列在编码序列的5’端提供功能性启动子。这样转录受到该启动子序列的调控和启动。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子序列可以包括但不限于从病毒基因组获得的启动子、异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子以及热震惊蛋白启动子。其他适用于酵母宿主细胞的启动子序列可以包括但不限于从编码代谢酶的基因获得的启动子，所述酶已知在细胞中以高浓度存在，例如糖酵解酶，比如磷酸丙糖异构酶 (TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、乙醇氧化酶(AOX)、乳糖酶 (LAC)和半乳糖苷酶(GAL)。合适的启动子的优选例子是酵母启动子，所述启动子含有作为酵母细胞中基因表达的启动子的DNA序列。优选的例子是酿酒酵母Mal、TPI、CUP、ADH或PGK启动子；或者巴斯德毕赤酵母葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PPGI)、3_磷酸甘油酸激酶启动子(PPGK)或甘油醛磷酸脱氢酶启动子(PGAP)、乙醇氧化酶启动子(PAOX)、甲醛脱氢酶启动子(PFLD)、 异柠檬酸裂解酶启动子(PICL)、翻译延伸因子启动子(PTEF)；以及巴斯德毕赤酵母烯醇酶 1 (PENOl)、磷酸丙糖异构酶(PTPI)、α-酮异己酸脱羧酶(PTHI)、核糖体亚基蛋白(PRPS2、 PRPS7、PRPS31、PRPL1)、热震惊蛋白家族成员(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6_磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGNDl)、磷酸甘油酸变位酶(PGPMl)、转酮醇酶(PTKLl)、磷脂酰肌醇合酶(PPISl)、 铁-02-氧化还原酶(PFET3)、高亲和铁透性酶(PFTRl)、可抑制性碱性磷酸酶(ΡΡΗ08)、 N-肉豆蔻酰基转移酶(PNMTl)、信息素反应转录因子(PMCMl)、泛素(PUBI4)、单链DNA内切核酸酶(PRAD2)的启动子；和线粒体内膜主要ADP/ATP载体的启动子(PPET9)。在优选表达系统中，启动子是诱导型或组成型启动子。启动子可以是宿主细胞的内源或外源启动子。编码辅助因子和/或POI的DNA序列还可以可操纵地连接合适的终止子序列，例如AOXl (乙醇氧化酶)终止子、CYCl (细胞色素c)终止子、TEF(翻译延伸因子)终止子。表达载体可以包含一或多个表现型选择标记(例如编码赋予抗生素抗性的蛋白或者提供营养需求的蛋白的基因)和预期宿主细胞能够识别的复制原点以保证在宿主内进行扩增。酵母载体常常含有来自酵母质粒的复制原点、自主复制序列(ARS)，或者替代地， 用于整合到宿主基因组的序列、启动子区、多聚腺苷酸化序列、转录终止序列和选择标记。用于连接DNA序列，例如分别编码辅助因子和/或Ρ0Ι、启动子和终止子的DNA序列的过程，和将它们插入含有整合或宿主复制所需信息的合适载体的过程是本领域技术人员熟知的，例如J. Sambrook et al. ,“ MolecularCloning 2nd ed. “ ,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中有描述。应当理解，将辅助因子基因和/或POI作为整合目标的载体可以这样构建首先制备含有编码辅助因子和/或POI的完整DNA序列的DNA构建体，然后将这个片段插入合适的表达载体或者通过将含有各个元件(比如信号、前导或异源蛋白)的遗传信息的DNA片段顺序插入，之后进行连接。根据发明也可以使用多克隆载体，即含有多个克隆位点的载体，其中所需异源基因可以引入多克隆位点来提供表达载体。表达载体是携带异源基因，用于表达该基因所编码的异源化合物的载体。在表达载体中，启动子被放置在异源化合物基因的上游并调控该基因的表达。对于多克隆载体的情况，因为异源化合物的基因被引入多克隆位点，启动子被放置在多克隆位点的上游。根据发明提供的用于获得重组宿主细胞的DNA构建体可以通过成熟的标准方法来制备，例如亚磷酰胺法。DNA构建体还可以是基因组或cDNA来源的，例如通过制备基因组或 cDNA 文库，并按照标准技术(Sambrook etal.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, 1989)利用合成的寡核苷酸探针经杂交筛选编码发明所述多肽的全部或部分的DNA序列而获得。最后，DNA构建体可以是混合了合成和基因组、混合了合成和cDNA、或混合了基因组和cDNA来源，是按照标准技术通过将对应整个DNA构建体各个部分的合成、基因组或cDNA来源的片段按需要退火而制备的。本发明所述的转化子可以通过将这类载体DNA，例如质粒DNA导入宿主并挑选在有辅助因子的情况下过表达POI的转化子来获得。通过常规用于转化真核细胞的方法处理宿主细胞，使之能够接受外来DNA，所述方法是比如电脉冲方法、原生质体方法、醋酸锂方法以及它们的改进方法。巴斯德毕赤酵母优选通过电穿孔进行转化。在另一个优选实施方案中，酵母表达载体能够通过例如同源重组稳定地整合到酵母基因组中。通过用辅助因子和/或POI基因转化细胞获得的发明所述转化子宿主细胞优选首先在这样的条件下培养，所述条件允许宿主细胞在没有表达异源蛋白的负担下生长至较大细胞数量。当细胞系准备进行POI表达时，选择培养技术以便产生表达产物。当转化子在有诱导刺激的情况下生长时，启动子可能被激活引导基因在它的控制下进行转录，POI得以表达。在有诱导刺激的生长条件下，通常比正常条件下生长得慢，但因为已经在前一阶段生长至大的细胞数量，整个培养系统能够产生大量的异源蛋白。诱导刺激优选是热、或者添加的镉、铜、渗透压增长剂、过氧化氢、乙醇、甲醇、甲胺等。优选将发明所述宿主细胞系在生物反应器中生长条件下培养以获得至少lg/L、更优选至少10g/L细胞干重、优选至少50g/L细胞干重的细胞密度。对于中试或工业规模，提供这样的生物分子生产产量是有益的。优选POI表达所采用的条件产生至少lmg/L，优选至少10mg/L，优选至少100mg/L， 最优选至少lg/L的产量。根据本发明，令人惊讶的是能够在即使生物量保持较低的情况下，辅助因子和POI 以高产量有效地共表达。因此，在中试和工业规模达到高单位产量是可行的，其中单位产量 Wmg POI/g干生物量衡量，在2-200的范围，优选100-200，最高500。与没有辅助因子时产物的表达相比，发明所述生产宿主的单位生产率优选提供至少1. 1倍，更优选至少1. 5倍， 至少1.2或至少1.3倍的提高，某些情况中，可以实现2倍以上的提高。本发明的宿主细胞优选通过以下检测来测试其表达能力或产量ELISA、活性检验、HPLC或其他合适的检测。优选的发酵技术是分批式、分批补料式或连续培养。优选酵母被培养在含有合适碳源的矿物质培养基中，避免维生素混合液，这样能够极大地简化分离过程。优选的矿物质培养基的例子是含有可利用碳源(例如葡萄糖、甘油或甲醇)、含有常量元素的盐(钾、镁、钙、铵、氯、硫酸盐、磷酸盐)和痕量元素(铜、碘、 锰、钼酸盐、钴、锌和铁盐以及硼酸)的培养基。转化细胞被培养在适合所需重组化合物表达的条件下，根据表达系统和被表达蛋白的属性，例如蛋白是否融合了信号肽还有蛋白是否可溶或者膜结合的，可以从细胞或培养基中纯化重组化合物。正如本领域技术人员可以理解的，根据多种因素，包括宿主细胞类型和具体采用的表达载体，培养条件可能不同。如果所需化合物是从细胞分泌出来的，可以利用现有技术从培养基中分离并纯化它。重组表达产物从酵母细胞分泌出来通常是有益的，原因包括有助于纯化过程，因为这样可以从培养物上清液回收产物，而不是从当酵母细胞被破坏以便释放胞内蛋白时产生的复杂蛋白混合液中回收。分泌蛋白通常首先表达为带有N端信号或前导肽的前体。信号肽一般含有带正电的N末端，之后是疏水核心，然后是被称为信号肽酶的酶的识别位点。该酶在转运过程中将信号肽从蛋白上切除。蛋白被从内质网转运到高尔基体，然后根据蛋白的特性进入分泌通道的多种途径之一。例如蛋白可能被分泌到培养基中或者保留在细胞表面。包含胞外、跨膜和胞质结构域的某些受体是保留在细胞膜上只有胞外结构域位于细胞之外的蛋白的例子。培养的转化子细胞也可以通过超声波或机械法、酶法或化学法来破裂以便得到含有所需POI的细胞提取物，从中可以分离和纯化到Ρ0Ι。对于获得重组多肽或蛋白产物的分离和纯化方法，可以使用诸如利用溶解度差异的方法，比如盐析和溶剂沉淀；利用分子量差异的方法，比如超滤和凝胶电泳；利用电荷差异的方法，比如离子交换层析；利用特异亲和性的方法，比如亲和层析；利用疏水性差异的方法，比如反相高效液相层析；以及利用等电点差异的方法，比如等电点聚集。优选采用特异的纯化步骤来分开共表达的并会对POI制品造成污染的任何辅助因子。分离和纯化过的POI可以通过常规方法，比如Western印迹或对其活性的检验来鉴定。纯化化合物的结构可以通过氨基酸分析、氨末端分析、一级结构分析等来限定。优选可以大量和高纯度水平地获得化合物，这样即可满足作为药物组合物中活性成分的必要要求。根据发明，优选的宿主细胞系保持了辅助因子和POI基因的完整性，并且维持高表达水平，例如甚至培养大约20代，优选至少30代，更优选至少40代，最优选至少50代后， 表达水平保持在至少μ g的水平。重组宿主细胞惊人的稳定，对于工业规模的蛋白生产这是一个极大的优势。以下实施例更详细地描述了本发明，所述实施例无论如何都不对权利要求所构成的发明范围造成限制。
实施例实施例1 a)构建表面展示Fab 2F5的巴斯德毕赤酵母菌株为了制备Fab 2F5表达盒，整个轻链基因(vL和cL)以及重链基因的vH和cHl区经PCR从含有人源化IgGlmAb的pRC/RSV(Kunert et al.，1998，2000)扩增。利用寡核苷酸引物加入无模板编码的限制性酶切位点(表1)。表1 用于PCR扩增Fab 2F5重链和轻链的寡核苷酸引物
权利要求
1.真核宿主细胞，其包含编码表达增强子的重组核苷酸序列，其中所述表达增强子选自 cLC52、RPL33 和 cLC61。
2.权利要求1所述的宿主细胞，其中所述核苷酸序列来源于巴斯德毕赤酵母。
3.权利要求1或2所述的宿主细胞，所述宿主细胞是真菌细胞，优选酵母细胞，或高等真核细胞，优选是哺乳动物细胞或植物细胞。
4.权利要求3所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞是毕赤酵母属的细胞，尤其是巴斯德毕赤酵母菌株的细胞。
5.权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞是用于导入编码目的蛋白 (POI)的目的基因的wildcard宿主细胞。
6.权利要求1-4中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞是包含编码POI的重组核苷酸序列的生产细胞，能够产生该POI。
7.巴斯德毕赤酵母宿主细胞，其包含-编码表达增强子的重组核苷酸序列，其中所述表达增强子选自cLC52、RPL33和 cLC61，和-编码POI的目的基因。
8.编码选自cLC52、RPL33和cLC61的蛋白的核苷酸序列作为表达增强子以提高POI在真核宿主细胞内的表达的用途。
9.制备权利要求6所述宿主细胞的方法，其包括 -提供权利要求5所述的宿主细胞，和-导入编码POI的核苷酸序列。
10.制备权利要求6所述宿主细胞的方法，其包括 -提供真核宿主细胞，-导入编码cLC52、RPL33和cLC61中至少一个的核苷酸序列，和 -导入编码POI的核苷酸序列。
11.在真核细胞中产生POI的方法，其包括 -提供权利要求6所述的生产宿主细胞，-在细胞培养物中共表达POI和表达增强子，和 -从细胞培养物中获得POI。
12.权利要求11所述的方法，其中所述POI是选自诸如免疫球蛋白或血清白蛋白的血清蛋白、酶、激素、信号分子、基质蛋白、或者它们的片段或衍生物的多肽。
13.权利要求11所述的方法，其中所述POI介导宿主细胞代谢物的产生。
14.权利要求11或12所述的方法，其中所述编码POI的重组核苷酸序列是在质粒上提供的，所述质粒适合整合到宿主细胞的基因组或者在宿主细胞内自主复制。
15.权利要求13所述的方法，其中所述质粒是真核表达载体，优选是酵母表达载体，所述载体包含能够有效导致POI从宿主细胞分泌出来的分泌前导序列和/或能够有效导致 POI在宿主细胞内表达的启动子序列。
16.用于权利要求10-14中任一项方法的共同过表达质粒，其包含 -编码POI的重组核苷酸序列，和-编码选自cLC52、RPL33和cLC61的蛋白的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及包含编码表达增强子的重组核苷酸序列的真核宿主细胞，其中所述表达增强子选自cLC52、RPL33和cLC61；以及它在目的蛋白(POI)生产方法中的用途。
文档编号C12N15/81GK102459609SQ201080033024
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月20日 优先权日2009年5月20日
发明者D.马塔诺维奇, G.斯塔德尔迈尔, M.索尔 申请人:维也纳南城高等专业学院