专利名称：改进的发酵方法
技术领域：
本发明涉及微生物学和利用微生物发酵的食物生产领域，其中利用选自丙酮酸、叶酸和吐温-20的化合物改善Streptococcus thermophilus菌株在发酵培养基(afermentation medium)中的生长,并且利用选自含硫氨基酸和支链氨基酸的化合物改善Lactobacillus bulgaricus菌株在培养基中的生长。
背景技术：
许多食物产品通过由细菌、酵母或丝状真菌组成的混合培养物(culture)进行发酵。发酵的乳制品通常采用乳酸菌(LAB)(革兰氏阳性菌的主要种群)进行生产。酸乳酪是一种通过 LAB Streptococcus thermophilus 和 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (此后被称为 “L. bulgaricus” 或 “Lactobacillus bulgaricus”)发酵的牛乳。发酵期间，这两个物种通过如下促成产品的质地(texture)和风味(i)酸化培养基导 致乳蛋白凝结；(ii)生产外泌多糖(EPS);并且(iii)产生特有的风味化合物，诸如乙醛和联乙酰(diacetyl)。S. thermophilus和L. bulgaricus在混合的乳培养物中刺激彼此的生长和酸生产，这个过程也被称为初级合作。这种相互刺激基于生长增强代谢物的交换。S. thermophilus为L. bulgaricus提供甲酸和叶酸和二氧化碳,这些都是与嘌呤生物合成相关联(要么作为前驱体要么作为辅助因子)的化合物。Lbulgaricus缺乏丙酮酸-甲酸裂解酶(PFL)和2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶二磷酸激酶，叶酸的生物合成路径中必不可少的基因。其他代谢相互作用存在于氮代谢水平。乳包含低水平的游离氨基酸(AA)和少量肽，但乳蛋白提供丰富的可以通过细胞外蛋白水解酶的作用释放的AA源。通常，用在酸乳酪生产中的非蛋白水解的S. thermophilus得益于L. bulgaricus的驻膜蛋白酶prtB的蛋白水解作用。类似地，Lbulgaricus已被报道受长链脂肪酸(LCFA)诸如油酸和月桂酸刺激(Partanen 等人 2001. System. Appl. Microbiol. Vol. 24 :500-506)，但这些化合物是否由混合培养物中的S. thermophilus提供还有待确定。酸乳酪细菌之间的代谢相互作用主要采用经典的微生物途径来阐述。最近的两项后基因组研究解决了 S. thermophilus LMG18311对以单一培养物形式或者以与L. bulgaricus ATCC11842的混合培养物形式在乳中的生长的全局响应(global response)(Herve-Jimenez 等人 2009. Appl. Environ. Microbiol.Vol.75，no. 7，p. 2062-2072 ;Herve-Jimenez 等人 2008. Proteomics, vol. 8 :4273-4286)。这些研究揭不了若干额外的针对共培养物生长的代谢响应。在混合培养物中，精氨酸和支链AA(BCAA)的生物合成路径在S. thermophilus中被有力上调了。在铁代谢中也存在明显的响应。这些作者表明，响应于L. bulgaricus生产的H2O2, S. thermophilus显示多个可能导致低细胞内铁浓度的响应。以这种方式，S. thermophilus看起来使由在Fenton反应中产生的反应性氧物种(ROS)造成的破坏最小化。上述后基因组分析仅在S thermophilus中进行。本发明人的目标在于同时分析在乳中对 Streptococcus thermophilus 和 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (本文中也被称为 Lactobacillus bulgaricus 或 L. bulgaricus) 二者共培养的总体调节响应。出于如下若干原因进行本项研究。首先，在酸乳酪生产期间，需要共培养S. thermophilus和L. bulgaricus 二者，从而获得足够的S. thermophilus产出物(outgrowth)以使乳底物酸化。然而，由于若干原因，L. bulgaricus的存在是不利的。Lbulgaricus在存储和分配期间造成后酸化，这导致酸乳酪发酸、淡味性降低。而且，其还在酸乳酪生产期间产生异味。因此，有利的是，在不存在L. bulgaricus的情况下刺激S. thermophilus的生长，这允许酸乳酪状生产没有后酸化和异味的情况。其次，不同类型的酸乳酪起子培养物的制备需要单独生产S. thermophilus和L. b ulgaricus的培养物。在没有它们初级合作的刺激效应的情况下，这些细菌的纯培养物的生长不是最适宜的。有利的是，为了制备随后可被用在发酵食物产品诸如酸乳酪的制备中的单个起子培养物，为S. thermophilus和L. bulgaricus 二者提供改进的发酵条件。
发明内容
本发明人已经确认了几种刺激S. thermophilus和/或L. bulgaricus在单培养物中的生长从而允许这些生物体在上述单培养物中或在混合培养物中具有增强生长的化合物。第一方面，本发明涉及一种用于制备发酵产品的方法，所述方法包括如下步骤_提供含有一种或多种第一化合物的发酵培养基，所述第一化合物选自丙酮酸、叶酸和吐温-20 ；-向所述发酵培养基中添加单一的酸化菌株,所述酸化菌株是Streptococcusthermophilus菌株；_任选地向所述发酵培养基中添加一种或多种辅助培养物；以及-使所述发酵培养基发酵以获得发酵产品。在一个实施方式中，所述发酵培养基还包含一种或多种第二化合物，所述第二化合物选自含硫氨基酸、支链氨基酸和甲酸。所述发酵产品可以是发酵食物产品，也可以是Streptococcus thermophilus起子培养物，诸如用于制备酸乳酪。第二方面，本发明涉及一种或多种第一化合物在发酵培养基中用于刺激Streptociccus thermophilus生长的用途,所述第一化合物选自丙酮酸、叶酸和吐温-20。在一个实施方式中，一种或多种第二化合物进一步用于刺激S. thermophilus的生长，所述第二化合物选自含硫氨基酸、支链氨基酸和甲酸。第三方面，本发明涉及一种用于制备发酵产品的方法，所述方法包括如下步骤_提供含有一种或多种第三化合物的发酵培养基，所述第三化合物选自含硫氨基酸和支链氨基酸；-向所述发酵培养基中添加单一的酸化菌株，所述酸化菌株是Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus菌株；-任选地向所述发酵培养基中添加一种或多种辅助培养物；以及-使所述发酵培养基发酵以获得发酵产品。在一个实施方式中，所述发酵培养基进一步包含一种或多种第四化合物，所述第四化合物选自甲酸、核苷碱基(诸如嘌呤)、丙酮酸、叶酸、吐温-20和吐温-80。所述发酵产品可以是发酵食物产品，或者可以是Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus起子培养物,诸如用于制备酸乳酪。另一方面，本发明涉及一种或多种第三化合物在发酵培养基中用于刺激Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus生长的用途，所述第三化合物选自含硫氨
基酸和支链氨基酸。一种或多种第四化合物可以进一步用于刺激Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus的生长,所述第四化合物选自甲酸、核苷碱基(诸如嘌呤)、丙酮酸、叶酸、吐温-20和吐温-80。发明详沭S. thermophilus第一方面，本发明涉及一种用于制备发酵产品的方法，所述方法包括如下步骤a)提供含有一种或多种第一化合物的发酵培养基，所述第一化合物选自丙酮酸、叶酸和吐温-20 ；b)向所述发酵培养基中添加单一酸化菌株,所述酸化菌株是Streptococcus thermophilus菌株；c)任选地向所述发酵培养基中添加一种或多种辅助培养物；以及d)使所述发酵培养基发酵以获得发酵产品。令人惊讶地,业已发现,丙酮酸、叶酸和吐温-20刺激S. thermophilus在单培养物中的生长，使得允许在缺乏Lactobacillus bulgaricus的情况下改善其在单培养物中的生长。以这种方式，可以制备酸乳酪状产品，而无需使用可能在这种酸乳酪的存储和分配期间引起后酸化并且在所述酸乳酪中产生异味的Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (在本文中也被称为 “Lactobacillus bulgaricus” 或 “L. bulgaricus”)。因而，在有利的实施方式中，没有L. bulgaricus被用在使用S. thermophilus的发酵中。当在本文中使用时，“生长增强量或生长刺激量的叶酸”意指约0. 01_500ppm叶酸，优选0. l-250ppm叶酸,优选0. 5-50ppm叶酸,更优选l_25ppm叶酸,甚至更优选2. 5_20ppm。当在本文中使用时，“生长增强量或生长刺激量的吐温-20”意指约0. I y M至约IOmM,优选约10 ii M至约5mM,更优选约25 y M至约2mM,还要更优选约50 y M至约ImM,甚至更优选约60 ii M至约0. 5mM。当在本文中使用时，“生长增强量或生长刺激量的丙酮酸”意指约0.01至约IOOmM,优选约0. I至约75mM,更优选约0. 5至约50mM,还要更优选约I至约25mM,甚至更优选约I至约10mM。本发明的方法可以包含如下步骤i)提供发酵培养基；ii)用至少一种S. thermophilus菌株对所述发酵培养基进行孵育；iii)允许发酵发生从而获得发酵产品；并且任选地iv)将所述发酵产品中的全部或部分用于制备食物产品。在一个实施方式中，一种或多种第二化合物进一步用于刺激S. thermophilus的生长，所述第二化合物选自含硫氨基酸(蛋氨酸和/或半胱氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸)和甲酸。因此，高度有效的发酵培养基可被构成，允许在发酵条件下较高的生长速率和通过S. thermophilus的增加的乳酸生产。第一和/或第二化合物可以S. thermophilus生长增强量添加。确定所述第一和/或第二化合物的上述S. thermophilus生长增强量是本领域技术人员的常规技能。本领域技术人员可以例如利用本发明的实施例I中所使用的技术，其中添加一定量的化合物，然后将S. thermophilus在所述量的这种化合物的存在下的生长与S. thermophilus在缺乏这种化合物的情况下的生长进行比较。一方面，本发明提供了一种或多种第一化合物用于在发酵培养基中刺激S. thermophilus生长的用途，所述第一化合物选自丙酮酸、叶酸和吐温_20。有利地，一种或多种第二化合物进一步被用在所述发酵培养基中，所述第二化合物选自含硫氨基酸、支链氨基酸、和甲酸。含有所述第一和/或第二化合物的改进发酵培养基可用在S. thermophilus的单培养物中，或者可用在S. thermophilus和一种或多种其他乳酸菌的混合培养物中。优选地，所述一种或多种其他乳酸菌并不包括L. bulgaricus。Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus本发明还提供了一种用于制备发酵产品的方法，所述方法包括如下步骤-提供含有一种或多种第三化合物的发酵培养基，所述第三化合物选自含硫氨基酸和支链氨基酸；_向所述发酵培养基中添加单一酸化菌株，所述酸化菌株是Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus菌株；-任选地向所述发酵培养基中添加一种或多种辅助培养物；以及-使所述发酵培养基发酵以获得发酵产品。在一个实施方式中，所述发酵培养基进一步包含一种或多种第四化合物，所述第四化合物选自甲酸、核酸碱基(诸如嘌呤)、丙酮酸、叶酸、吐温-20和吐温-80。 令人惊讶地发现，含硫氨基酸和支链氨基酸刺激L. bulgaricus在单培养物中的生长，允许其在缺乏S. thermophilus的情况下在单培养物中生长。这种方法在制备L. bulgaricus起子培养物时特别有利。本发明的方法可以包括如下步骤i)提供发酵培养基；ii)用至少一种L. bulgaricus菌株对所述发酵培养基进行孵育；iii)允许发酵发生从而获得发酵产品；并且任选地iv)将所述发酵产品中的全部或部分用于制备食物产品。另一方面，本发明涉及一种或多种第三化合物用于在发酵培养基中刺激Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus生长的用途,所述第三化合物选自含硫氨基酸和支链氨基酸。在一个实施方式中，一种或多种第四化合物进一步被用在所述发酵培养基中，所述第四化合物选自甲酸、核酸碱基(诸如嘌呤)、丙酮酸、叶酸、吐温-20和吐温-80。含有所述一种或多种第三和/或第四化合物的、用于L. bulgaricus的改进发酵培养基可用在L. bulgaricus的单培养物中，或者可用在L. bulgaricus和一种或多种其他乳酸菌的混合培养物中。第三和/或第四化合物可以L. bulgaricus生长增强量添加。确定所述第三和/或第四化合物的上述L. bulgaricus生长增强量是本领域技术人员的常规技能。本领域技术人员可以例如利用本发明的实施例I中所使用的技术，其中添加一定量的化合物，然后将L. bulgaricus在所述量的这种化合物的存在下的生长与L. bulgaricus在缺乏这种化合物的情况下的生长进行比较。S. thermophilus 和 L. BulRaricus 二者发酵培养基可以是其允许通过S. thermophilus和/或L. delbrueckii subsp.bulgaricus发酵的任何水性培养基。“发酵”或“发酵培养物”是指，用于细菌生长的生长培养物，其通常(但非必需)在厌氧条件下将碳水化合物转化成醇或酸类。“发酵培养基”是指，用于产生发酵培养物的生长培养基；而“发酵产品”通常指经发酵的培养基(即在发酵期间和/或之后)。然而，这两个术语在本文中可交替使用，其含义从上下文来看是清楚的。发酵培养基可以是任何含有糖源和蛋白质源的发酵培养基。糖源可以是任何可由所用S. thermophilus或L. bulgaricus菌株进行发酵的糖,其包括但不限于乳糖、鹿糖、右旋糖、葡萄糖等等。蛋白质源可以是任何蛋白质源，其包括但不限于乳蛋白，植物蛋白，包括但不限于大豆蛋白、鱼蛋白、肉蛋白等等。特别地，对于制备发酵食物产品而言，优选的是蛋白质源选自乳蛋白和植物蛋白。发酵产品可以是任何发酵产品，但也可以是本身适于人类和/或动物消费的发酵食物产品，即液体、半固体和/或固体食物产品(营养组合物)。因此，发酵产品可以是发酵食物产品本身，诸如酸乳酪或干酪，或者发酵产品可以用在食物产品的制备中。术语“食物”或“食物产品”是指，适用于人类和/或动物消费的液体、半固体和/或固体食物产品(营养组合物)。食物或食物产品可以本身是发酵的(“发酵食物产品”)，例如酸乳酪、干酪、克菲尔(kefir)等等，或者可以包括发酵食物产品或利用本发明的方法制备的发酵产品。例如，发酵产品可以用在其他食物产品中，所述其他食物产品诸如为液体食物(例如饮料、汤、酸乳酪或酸乳酪基饮品、奶昔、软饮料、水果饮料、发酵的乳制品、膳食替代品、发酵的水果和/或果汁产品等等)或固体食物/饲料(膳食、膳食替代品、零食诸如块 糖、动物饲料、发酵的乳制品、发酵的食物或饲料产品、冷冻产品、冻干的食物添加剂、干酪等等)或半固体食物(甜点等等)。可以在上述食物产品的生产过程中简单地添加或使用发酵产品。或者，发酵产品可以在用于制备食物组合物之前被浓缩或被稀释或被预处理。预处理包括过滤和/或离心、消毒、冻干、冷冻等等。发酵产品本身和/或经预处理的发酵产品本质上是上述方法的初级产品。这些初级产品例如在发酵食物产品的情况下可以原样使用，或者可被用作食物产品成分，即适量的初级产品在制造最终食物产品时作为成分。根据本发明的食物组合物包含或者由适量的初级产品(发酵产品，例如原样的或经预处理的)组成。发酵产品可以是起子培养物，并且可随后被用于制备食物产品、饲料产品等等。已经发现，向s. Thermophilus的培养基中添加一种或多种第一和/或第二化合物会使包含S. Thermophilus的起子培养物的生产快速高效,包括在发酵结束时生物质生产增加。进一步发现，向L. Bulgaricus的发酵培养基中添加一种或多种第三和/或第四化合物会使包含L. bulgaricus的起子培养物的生产快速高效，包括在发酵结束时生物质生产增加。发酵产品在作为起子培养物使用之前可被浓缩从而提供浓缩的起子培养物。(浓缩的)起子培养物可以是液体、冷冻的或冻干的。对于在本发明中的应用而言，(浓缩的)起子培养物可以包含本文所提到的第一和/或第二化合物，或第三和/或第四化合物，从而为发酵食物产品的发酵提供一体式包装(all-in-one package)。或者，(浓缩的)起子培养物以及第一和/或第二或第三和/或第四化合物可以分别添加到发酵培养基中以提供发酵食物产品。食物产品或发酵产品优选是发酵食物产品本身，其包括但不限于发酵乳品产品，诸如酸乳酪、干酪、克菲尔、酪乳、酸奶油或大豆酸乳酪等等。这些食物产品可以进一步包含常用于制备甜点的成分，所述甜点诸如为水果、巧克力碎或谷物，以及加甜的产品或液体巧克力。食物产品可以进一步包含常用的食物成分，诸如乳化剂、凝胶剂、稳定剂、甜味剂等等。本领域技术人员知晓如何利用本发明的(发酵)食物产品制备食物产品。在适当的实施方式中，发酵食物产品是发酵乳制品。在有利的实施方式中，发酵食物产品是酸乳酪。为了制备本发明的酸乳酪，可以利用S. thermopohilus作为单一酸化菌株发酵乳底物。可以添加其他细菌诸如LAB例如以提供酸乳酪的益生性质。S. thermophilus和L. Bulgaricus通过发酵含有乳蛋白(例如乳类)的乳型发酵培养基而被常规用在酸乳酪和干酪制备中。其还通过使用含有0.5-10% (w/w)大豆蛋白(例如大豆乳)的大豆型发酵培养基而被常规用在发酵的大豆食物产品(例如大豆酸乳酪)的制备中。S. thermophilus还需要碳源和能量,诸如碳水化合物,例如糖类,诸如乳糖。优选地，乳型基础培养基(也被称为“乳底物”)是天然的或复原的乳类，脱脂的或以其他方式处理的，或是乳基培养基或基于乳源产品的培养基。乳底物或大豆型基础培养基可以包含常用于制备甜点或饮料、固体产品(诸如水果、巧克力碎或谷物)、以及加甜的产品或液体巧克力的产品。可以利用一种或多种辅助起子进行发酵，所述辅助起子包括酵母(诸如用于制备Cheddar干酪的那些)和细菌。在一个实施方式中，辅助起子包括细菌菌株，尤其是其他乳酸菌。“乳酸菌”(LAB)是指，会产生乳酸或其他有机酸(诸如丙酸)作为发酵最终产品的细菌，其包括但不限于 Lactobacillus、Streptococcus、Lactococcus、Oenococcus、 Leuconostoc、Pediococcus、Carnobacterium、Propionibacterium、Enterococcus 和Bifidobacterium 属的细菌。优选地，所述一种或多种其他细菌菌株选自Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei 和 / 或Bifidobacterium。包含一种或多种第一和/或第二化合物或者一种或多种第三和/或第四化合物的发酵培养基提供了分别用于S. thermophilus和L. bulgaricus的改进的生长速率并且/或者增加的乳酸产品。较高的生长速率和/或增加的乳酸生产可以导致增强的食物保存和/或改进的发酵食物产品的质地。术语“含硫氨基酸”是指蛋氨酸和/或半胱氨酸，而术语“支链氨基酸”或“BCAA”
是指亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸。含硫氨基酸和/或支链氨基酸可以游离氨基酸形式或者以含有相对大量(优选以重量计至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%)的上述含硫氨基酸和/或支链氨基酸的肽形式提供。在本说明书中，任意的和所有的S. thermophilus和L. delbrueckii subsp.Bulgaricus菌株都可以包含在内，具体为用于制备发酵(食物)产品的那些。在本说明书和权利要求书中，动词“包括”及其连接词以其非限制含义使用，意指紧跟着措词的那些项目都包括在内，但并不排除未具体涉及的项目。另外，动词“由...组成”可被“本质上由...组成”替代，意指本发明的组合物除了具体确定的那些以外还可以包含额外的组分，但这些额外的组分不会改变本发明的特有特性。此外，通过不定冠词“一个”或“一种”表示的特征并不排除存在一个以上该特征的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个且仅一个该特征。不定冠词“一个”或“一种”因此通常意指“至少一个”。本说明书中引用的所有专利和文献参考资料通过弓I用全文插入本文。清楚可见，所包含的上述说明和附图
阐述了本发明的一些实施方式，但并非限制保护范围。从这个公开出发，那些落在本发明的保护范围和本质内并且是现有技术和本发明公开的显而易见组合的一些更多实施方式对本领域技术人员来说是明显的。实施例实施例I :干渉研究在含有0. 2体积的具有下述化合物的溶液和0. 8体积的复原脱脂乳中制备S. thermophilus的培养物、L. bulgaricus的培养物和混合培养物,所述化合物为丙酮酸Na(l. 82mM)、甲酸Na(l. 47mM)、叶酸(ImM)、核糖碱基(10mg/L)(表示嘌呤和嘧啶代谢的所有)、吐温-20 (105. 9uM)(作为月桂酸源)、吐温-80 (作为油酸源)。此后，这些化合物被称为“相互作用的化合物”。LCFA油酸和月桂酸是难溶的，因此我们使用吐温-20和吐温-80。以单一添加和单一省略方式测定所有相互作用的化合物中的每一个对生长和酸化的影响。将单一化合物与什么都未添加(阴性对照)进行成对比较，并且将所有化合物减去一个添加的对所有化合物(阳性对照)进行成对比较。250 ii L的四分之一培养物的酸化在37°C下水板(hydroplate) (Pre Sens-Prec is ion Sensing GmbH, Germany)中测试 19 小时，其中CFU之后，利用快速微型板方法确定计数(36)。利用双尾Students t_检验(p = 0. 05)通过比较最大酸化率来确定酸化的显著差异。类似地，以及计算最终PH值之间以及菌落形成 单位之间的显著差异。与对照相比，较高的细胞计数、较低的最终pH、较高的酸化速率和较短的达到这个速率的时间被认为是干涉的刺激效果。S. thermophilus的酸化由如下化合物以递减次序刺激甲酸、丙酮酸、叶酸和吐温-20。L. bulgaricus酸化的大部分由甲酸和核酸碱基刺激,而丙酮酸、叶酸、吐温_20和吐温-80显示小的刺激效应。混合培养物的酸化还被丙酮酸和甲酸刺激，但在所有情况下刺激效果要小于单一培养物。实施例2材料和方法微阵列设计采用定制探针设计(AMADID015342)在 Agilent 8xl5K 平台(AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA)上点微阵列，其包括 S. thermophilus CNRZ1066 (由NCBI 发布，Genbank 的登录号 NC_006449)和 L. bulgaricus ATCC BAA-365 (由 JGI 发布，Genbank的登录号NC_008529)的序列。探针根据以使交叉-杂交最小的目标进行设计探针是物种特异性的，即所有探针被设计为针对靶基因具有100%靶得分的60-mer，从而允许如果利用正确的杂交温度(65°C )和洗涤温度(37°C )，那么无cDNA结合(I个碱基差异(错配))。总体上，存在5483个探针，其表示1899个S. thermophilus的基因，和存在4028个斑点，其表示1709个L. bulgaricus的基因。大多数基因由3个或更多个探针表示。仅S. thermophilus中的55个基因和L. bulgaricus中的77个基因用一个探针表示，而且仅仅S. thermophilus的5个基因和L. bulgaricus的31个基因缺乏。菌株特异性基因探测的敏感性通过来自两种菌株的MRS-生长单培养物的样品一系列的转录物组分析(transcriptome profiling)实验检测。单独杂交和两个样品的混合物的杂交的比较分析结果表明，平均来说，探针显示与来自目标菌株的RNA样品的100倍高的杂交。得出了如下结论对于较少数量的基因来说，菌株特异性基因表达分析是不可能的。这些基因包括rRNA基因(S. thermophilus中14个,L. bulgaricus中19个)，核糖体蛋白(分别为4和12个)，和假定蛋白(分别为8和12个)。它们被从进一步的分析中排除。
从在乳中生长的培养物中分离RNA乳的高蛋白质含量和通过生长微生物的多糖生产使得细胞收获有问题。此外，为了避免在转录物组学实验中引入技术误差，需要快速实施取样和淬灭。已经开发了若干过程来“澄清”乳，使得能够通过离心进行细胞收获而没有被乳固体污染。然而，乳的澄清过程不仅耗时，并且需要PH剧烈变化以及添加大量柠檬酸钠。我们认为这个过程易于导致转录物组的变化。因此，我们开发了一种适于转录物组分析的从酸乳酪培养物中进行细胞收获和RNA提取的替代方法。酸乳酪培养物在_40°C的3体积的60%丙三醇中淬灭(这导致细胞过程的立即阻止)并且保持在_20°C下0.5小时。然后，用IM NaOH将pH调节至6. 5-7.0，并且将培养基用4ml25% (w/v)柠檬酸钠(Na3Citrate)/IOOmL在-20°C下澄清0. 5小时，上述添加都缓缓混合5min。使细胞在_20°C和23000G下旋转下降16分钟，并将其溶解在由50% (w/v)胍硫氰酸盐(Sigma)、0. 5% (w/v)N-月桂基肌氨酸(Sigma)和2. 5% (v/v)的IM柠檬酸钠溶液组成的溶液中，并用0. IMNaOH调节至pH 7. O。另一次离心后，使细胞重新悬浮在500 ii L IxTE中，并施涂在含有250 ii L酸性苯酚(Sigma)、250 y L氯仿(sigma) >30 u LNaAc (Merck)pH 5. 2>30 u L 10% SDS (Sigma)和具有 0. Imm直径的 500mg 锆珠(Biospec products Inc.，OK, USA)的RNA提取管上，使其立即在液氮中冷冻并保持在_80°C下直到进行RNA提取。为了 RNA提取,使用已经确定的用于从Iactobacilli中分离的方法(Stevens等人 2008. Improvement ofLactobacillus plantarum aerobic growth as directed bycomprehensive transcriptome analysis. Appl Environ Microbiol 74 :4776-4778)。简言之，在Fastprep (Qbiogene Inc. ,France)中5. 5m/s下3X45秒破坏细胞，中间以在冰上I分钟间隔开。在20800G下离心I分钟之后，将500 u L的水相用400 U I氯仿和第二离心步骤进行纯化。该水相被用于采用High Pure试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim, Germany)的RNA分离，这包括采用DNase I处理I小时。将RNA储存在_80°C下。利用ND-1000光谱仪(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)和在 2100Bioanalyzer (Agilent)中的RNA 6000Nano LabChip 试剂盒(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)上的毛细管电泳核查数量和质量。cDNA合成、标记和杂交利用5至g的RNA用于cDNA合成以及标记，如先前所述(Stevens, 2008.Wageningen University, Wageningen, The Netherlands)。对于每个阵列来说，对0. 3 U g米用青色素3和青色素5标记的cDNA进行杂交。杂交采用溶液进行并且遵循Agilent (版本5. 5)提供的用于8xl5K载玻片的方案。阵列在65°C下杂交17小时。杂交方案被设计成允许在发酵实验中的不同阶段之间以及在单一培养物和混合培养物之间进行双重比较。此后，采用Agilent供应的缓冲液根据制造商的说明对微阵列载玻片进行洗涤(缓冲液I :室温；缓冲液2 :30-370C )。我们发现，在较低温度下洗漆在使采用Cy5标记的S. thermophiluscDNA和采用Cy3标记的L. bulgaricus cDNA同时杂交时导致严重的交叉杂交，但在仅施涂一种cDNA样品时不导致严重的交叉杂交。阵列分析载玻片采用Agilent微阵列扫描仪(G2565BA)进行扫描，并且使用波长为532nm和635nm的激光分别激发青色素3染料和青色素5染料。以多图像标记(multi-image-tagged)的图像文件格式形式捕捉突光图像，并且利用Imagene软件(Axon) (BioDiscovery, Marina del Rey, USA)对其进行分析。杂交程度由像素X像素比的中值得到。利用 Lowess(van Hi jum,等人 2008. BMC Bioinformatics 9 :93.)分别对S. thermophilus和 L. bulgaricus 斑点进行归一化。差异调节(differential regulation)通过多重检验校正由Cyber-T p_值通过错误发现率(FDR)确定。差异调节为定义为FDR截止值(cut-off value)为0.05或更小的两倍或更高的差异表达。调节的基因被分成功能种类，如NCBI (S. thermophilus)和JGI (L. bulgaricus)所述。利用分级归类、主要组成分析和MicroPrep来检验不同杂交的品质。最后，通过在KEGG图，Simpheny (GenomaticaInc. , San Diego, CA),代谢图和Minomics上绘图使结果可视化。益果单培养物和混合培养物的转录物组分析为了识别在共培养物中的两个物种中差异化表达的基因，对混合的培养物进行转 录物组分析，并将这些与在不同生长阶段(即第一指数阶段(开始发酵后3. 5小时)，过渡阶段(5. 5小时)，第二指数阶段(8小时)和静止阶段(123小时))的单培养物进行比较。类似的，比较培养物中这四个不同的生长阶段。对采用相互作用的化合物(甲酸和腐胺)补充的早期和中间第二指数阶段的混合培养物进行转录物组分析。这些研究允许分析全局调节响应以及整个发酵过程的相互作用的发展。所使用的DNA微阵列包含探针靶向的菌株特异性序列，以确保 S. thermophilus CNRZ1066 和 L. bulgaricus ATCC BAA-365 二者的基因组的交叉杂交最小化。基于通过快速冷冻培养物进行淬灭并且通过柠檬酸的澄清的RNA提取方法被特定地设计用于这些实验，并且被证明对于从酸乳酪培养物中获得高品质的RNA样品来说至关重要。尽管我们将以低于0. 05的FDR值被两倍或更多倍上调或下调的基因定义为以显著方式差异表达，但是更一般的效果被考虑(例如路径中的所有基因被显著上调I. 5倍)。在所有四个生长阶段中混合培养物和单培养物之间的差异表达都较高。相互作用主要在第二指数阶段影响S. thermophilus (所有基因的23%以高于2倍差异表达)，这与仅在这个生长阶段S. thermophilus被L. bulgaricus深度刺激的观测结果一致。受影响的主要功能组包括“氨基酸转运和代谢”(该类中基因的15-42% )，“无机离子的转运和代谢” (14-32% )，和“核苷酸转运和代谢” (10-47% )。S. thermophilus的存在已经在发酵的早期阶段刺激了 L. bulgaricus的生长,这通过如下被举例说明与S. thermophilus相比在两个早期生长阶段中Lbulgaricus的差异表达基因的比率较高(在过渡阶段为24%对7%).两个物种中差异表达的主要部分可被归因于增长的生长速率，这通过如下被举例说明包含在重要的最终产物(诸如联乙酰，导致典型的酸乳酪风味)的生产中所涉及的基因的初级代谢的诱导。确实，这种化合物在混合培养物中的存在量与在单培养物中相比更高。涉及相互作用的主要受影响功能组包括“氨基酸转运和代谢”(该类中基因的21-36% )，“无机离子的转运和代谢”(20-28% )，和“核苷酸转运和代谢”(18-44% )。L. bulRaricus的全局调节口向应分析在Lbulgaricus单培养物中，不同生长阶段之间的基因表达存在很小差异，但是从8小时开始(生长慢下来并且培养物进入静止阶段)，许多路径下调，尤其是与叶酸、嘌呤、LCFA和AA相关的那些，和直接涉及生长的基因诸如细胞壁生物合成中所涉及的编码核糖体蛋白和酶的那些。在混合培养物中，在过渡阶段中与叶酸和嘌呤的生物合成、LCFA生物合成和硫AA代谢相关的基因表达与第一指数阶段相比明显较低。这可能是由于过渡阶段的生长速率较低造成的。然而，在第二指数阶段中，嘌呤和LCFA生物合成基因的表达尽管与过渡阶段相比具有较高的增长速率但仍保持在低水平。此外，编码I-酰基-sn-丙三醇-3-磷酸酰基转移酶的LBUL_0106被13倍高地表达，这暗示了这种酰基转移酶与从培养基收获的LCFA —起被加载。此外，EPS和硫AA代谢中涉及的基因在第二指数阶段中与在过渡阶段相比被更高地表达。S. thermophilus中的全局调节响应在S. thermophilus单培养物中，用于甲酸生产和用于嘌呤生物合成的路径的基因pflA(4. 6倍)与第一指数阶段相比在过渡阶段尽管生长速率较低但被更高地表达。类似的，BCAA输入和生产基因在过渡阶段2. 9-3. 0倍高地表达，这暗示了在发酵的相对早期这些AA缺乏。与第一指数阶段相比，在过渡阶段中用于生产其他AA的基因的表达通常更低。与过渡阶段相比，第二指数阶段存在很小差异，但是硫AA代谢上调，这也如HerW-Jimenez 等人所述(如上)。S. thermophilus在混合培养物中和在单培养物中的第一指数阶段和过渡阶段之间的差异表达趋势相当，但是BCAA获得基因的较高表达不会出现在混合培养物中。在混合培养物中，第二指数阶段中的嘌呤生物合成基因与过渡阶段相比被较低地表达，但是一些涉及AA获得的路径被较高地表达，尤其是用于BCAA(2-3. I倍)和硫AA(2. 2-61. 5倍)的那些，这暗示了对于这些AA不断增加的需求。在静止阶段中，与生长相关的路径较低地表达。值得注意地，在混合培养物而非在单培养物中，S. thermophilus的EPS生物合成基因在第二指数阶段和静止阶段的表达与较早生长阶段的表达相比显著更高。嘌呤代谢我们发现了，丙酮酸甲酸裂解酶的两个基因pfl和pflA在混合培养物中尤其在第一指数阶段的表达与在单培养物中的表达相比较高(分别为3. 0和4. I倍)。当供应甲酸时，表达下调3. 8和5. 7倍，这表明了酶的生理学作用(部分)确保了甲酸的充分供应。用于叶酸生产的生物合成路径的基因的表达并未受影响，但是叶酸循环基因(Cl库)的表达相应于用于生产嘌呤的基因的表达。然而，在L. bulgaricus中不完全的叶酸盐生物合成路径尤其在头两个生长阶段被较低地表达。在S. thermophilus中嘌呤生物合成路径中的基因在混合培养物中在两个较早生长阶段中被较高地表达，但是根据Herv6_Jimenez等人(如上)的研究，在第二指数阶段中尽管生长速率较高但表达较少。类似地，L. bulgaricus中的嘌呤代谢在混合培养物中尤其在5. 5小时后被较低地表达，这可能是由于在这个阶段在混合培养物中的生长速率较低。当供应甲酸时，在两个物种中涉及嘌呤和叶酸循环的生物合成的基因表达在早期(第二)指数阶段较低，但是在中间指数阶段较高。氨基酸和二氧化碳代谢已知在氮代谢(蛋白质水解和二氧化碳利用)水平下发生相互作用。氮代谢在L. bulgaricus中除了很少的例外不太受影响。在共培养物中，我们观察到prtB基因，LBUL_1105的相当高的表达水平，其在共培养物中第二指数阶段中被8. 9倍高地表达。这可被解释为，在还存在S. thermophilus的情况下,通过蛋白酶的酪蛋白水解时产生的肽被更快速的消耗了。这要求更高的蛋白酶活性以维持两种细菌的生长。此外，硫AA半胱氨酸和蛋氨酸的生物合成中涉及的基因在混合培养物中高度上调，例如将0-乙酰基-L-丝氨酸转化成半胱氨酸的基因LBUL_1235在混合培养物中在第二指数阶段期间23. I倍高地表达。这表明了，酪蛋白的蛋白水解并不允许为两个生物体供应足够的半胱氨酸。事实上，酪蛋白的半胱氨酸含量仅为0. 35。此外，乳培养物中的游离蛋氨酸含量可以忽略，游离半胱氨酸被快速消耗，即半胱氨酸并未积聚在L. bulgaricus的单培养物和混合培养物中，而若干其他AA积聚。在S. thermophilus中，由于由蛋白酶(通过L. bulgaricus生产)进行的蛋白水解而引起的较高的肽充足性导致肽输入系统上调，诸如由amiC，amiD, amiE和amiFl编码的ABC转运体系上调(2. 5-2. 8倍)，并且导致肽水解，如由第二指数阶段中编码的肽酶P印N的基因的上调(2.4倍)所举例说明的。此外，编码三种BCAA的生物合成的的基因(2.0倍)和吸收的基因(I. 0-1. 3倍)在混合培养物中的表达略微较高。类似地，在L. bulgaricus中,在混合培养物中编码支链氨基酸透酶的LBUL_0431在第二指数阶段期间2. 3倍高地表达。这被预料到了，因为特别是S. thermophilus单培养物和混合培养物展现非常低的BCAA含量，具体展现非常低的异亮氨酸含量。类似地，在S. thermophilus中，存在较高表达的将丝氨酸转化成半胱氨酸和蛋氨酸的路径(I. 5-1. 9倍)。用于从谷氨酸和谷氨酸盐重新生产精氨酸的路径在混合培养物中上调。谷氨酸盐通过四个基因argJ、argB、argC和argD介导而被转化成鸟氨酸，这些基因在第二指数阶段期间在混合培养物中都I. 8-3. 3倍高地表达。此外，carA(引起谷氨酸向氨基甲酰磷酸酶转化的基因中的一种)I. 8倍高地 表达。这都表明了，当在具有Lbulgaricus的共培养物中生长时，脲循环在第二指数阶段在S. thermophilus中运行较快。此外,在S. thermophilus中编码碳酸脱水酶的cah在混合的培养物中3. 8至15. 8倍高地表达，特别是在较早的生长阶段。通过使二氧化碳从碳酸中释放，这个酶可以在提供在两个物种中进行天冬氨酸、谷氨酸盐、精氨酸和核苷酸的生物合成所必需的C02中起到作用。这些结果与Herv6_Jimenez等人(如上)所描述的结果一致，他们称BCAA和精氨酸在S. thermophilus中的代谢在L. bulgaricus的存在下上调。L. bulgaricus中的脂肪酸代谢在发酵的后三个阶段中，通过L. bulgaricus编码LCFA合成的基因在混合培养物中3. 3-9. 6倍低地表达，而在第二指数阶段和静止阶段中，LBUL_0106和LBUL_1256( 二者都是I-酰基-sn-丙三醇-3-磷酸酰基转移酶)在混合的培养物中分别3. I和15倍高地表达。因此，这种酰基转移酶很可能与来自S. thermophilus的存在下的培养基的脂肪酸(例如通过其脂解活性从乳脂肪中释放出来)一起被加载。
权利要求
1.一种用于制备发酵产品的方法，所述方法包括如下步骤 -提供含有一种或多种第一化合物的发酵培养基，所述第一化合物选自叶酸、吐温-20和丙酮酸； -向所述发酵培养基中添加单一的酸化菌株，所述酸化菌株是Streptococcusthermophilus 菌株； -任选地，向所述发酵培养基中添加一种或多种辅助培养物； -使所述发酵培养基发酵以获得发酵产品。
2.根据权利要求I的方法，其中，所述发酵培养基还包含一种或多种第二化合物，所述第二化合物选自含硫氨基酸、支链氨基酸和甲酸。
3.根据权利要求I或2的方法，其中，所述发酵产品是发酵食物产品。
4.根据权利要求I或2的方法,其中，所述发酵产品是Streptococcusthermophilus起子培养物，诸如用于制备酸乳酪。
5.一种或多种第一化合物在发酵培养基中用于刺激Streptococcus thermophilus生长的用途，所述第一化合物选自叶酸、吐温-20和丙酮酸。
6.根据权利要求5的用途，其中，进一步地，一种或多种第二化合物用在所述发酵培养基中，所述第二化合物选自含硫氨基酸、支链氨基酸和甲酸。
7.一种用于制备发酵产品的方法，所述方法包括如下步骤 -提供含有一种或多种第三化合物的发酵培养基，所述第三化合物选自含硫氨基酸和支链氨基酸； -向所述发酵培养基中添加单一的酸化菌株，所述酸化菌株是Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus 菌株； -任选地，向所述发酵培养基中添加一种或多种辅助培养物； -使所述发酵培养基发酵以获得发酵产品。
8.根据权利要求7的方法，其中，所述发酵培养基进一步包含一种或多种第四化合物，所述第四化合物选自甲酸、核苷碱基诸如嘌呤、丙酮酸、叶酸、吐温-20和吐温-80。
9.根据权利要求7或8的方法，其中，所述发酵产品是发酵食物产品。
10.根据权利要求7或8的方法,其中，所述发酵产品是Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus起子培养物,诸如用于制备酸乳酪。
11.一种或多种第三化合物在发酵培养基中用于刺激Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus生长的用途,所述第三化合物选自含硫氨基酸和支链氨基酸。
12.根据权利要求11的用途，其中，进一步地，一种或多种第四化合物用在所述发酵培养基中，所述第四化合物选自甲酸、核苷碱基诸如嘌呤、丙酮酸、叶酸、吐温-20和吐温-80。
13.根据前述权利要求中任意一项的方法，其中，向所述发酵培养基中添加一种或多种辅助培养物，所述一种或多种辅助培养物选自Lactobacillus、Streptococcus、Lactococcus > Oenococcus > Leuconostoc > Pediococcus> Carnobacterium、Propionibacterium、Enterococcus 和 Bifidobacterium 属的细菌。
全文摘要
本发明公开了改进的用于S.thermophilus和/或L.bulgaricus的发酵条件，其使得基于这些菌株的单培养物有效的制备发酵产品。这些发酵产品可以是发酵食物产品，或者可以是用于制备发酵食物产品的起子培养物。本发明还描述了某些化合物用于刺激S.thermophilus和/或L.bulgaricus生长的用途。
文档编号C12N1/20GK102782120SQ201080055759
公开日2012年11月14日 申请日期2010年10月7日 优先权日2009年10月7日
发明者弗朗西斯库斯·阿德里亚努斯·玛利亚·德博克, 杰伦·胡甘霍尔茨, 桑德尔·斯沃尔茨, 约翰尼斯·厄普斯·特奥多尔·范·海尔卡玛·维列格 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司