用于治疗可卡因滥用的BChE白蛋白融合体的制作方法

专利名称：用于治疗可卡因滥用的BChE白蛋白融合体的制作方法
技术领域：
无
背景技术：
可卡因(cocaine)滥用和依赖具有灾难性的医学和社会后果，这些后果己使 得对有效治疗的开发尤为迫切(潘Y. (Pan，Y.)，高D. (Gao，D.)，杨W. (Yang, W.)，曹 H. (Cho, H.),杨 G. (Yang, G.),台 H. (Tai, H.)，詹 C. (Zhan, C.)，“用于抗可卡因药物的人类丁酰胆碱酷酶的计算机重新设计(Computational redesign of humanbutyrylcholinesterase for anticocaine medication)，，，美国国豕科学院院干丨J(PNAS)，102(46) :16656-61, 2005)。然而，如布瑞米乔因(Brimi join)等人所述尚无可靠手段能治疗可卡因过量或降低己实现戒断成瘾者的复发可能性。人类血浆丁酰胆碱酯酶(BChE)有助于正常的可卡因代谢且已被考虑用于治疗可卡因毒性”(布瑞米乔因S. (Brimi join, S.)，高Y. (Gao, Y.)，安克 J. (Anker，J.)，格利登 L. (Gliddon, L.),拉弗勒 D. (LaFleur, D.)，沙哈 R. (Shah, R.),赵 Q. (Zhao, Q.)，辛格 M. (Singh, Μ.)，卡罗尔M. (Carroll, M.), “自人类丁酰胆碱酯酶工程化的可卡因水解酶在大鼠中选择性阻断可卡因毒性和药物寻求的恢复(A Cocaine Hydrolase Engineered from HumanButyrylchoiinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement ofDrug Seeking in Rats)”，神经精神药理学(Neuropsychopharmacology)，33:2715-25，200野生型BChE虽然在体内对于可卡因代谢很重要,但对可卡因的催化效率低。野生型BChE的低可卡因水解酶活性将需要使用不可承受的大量纯化酶来治疗可卡因滥用或过量。出于增强可卡因水解酶活性的目的对人类BChE执行诱变导致开发了双突变体A328W/Y332A (相对于全长BChE的残基356和360)，这一突变体的keat为野生型BChE的40倍，且Km仅略微升高(孙H. (Sun H.)，沈M. (Shen Μ.)，彭Y. (Pang Y.)，洛克里奇0. (Lockridge 0.),布瑞米乔因S. (Brimi join, S.), “重新工程化的人类丁酰胆碱酯酶加速的可卡因代谢(Cocaine Metabolism Accelerated by a Re-Engineered HumanButyrylcholinesterase)w,药理学与实验治疗杂志(Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics)，302(2):710-716, 2002)。利用分子动力学模拟可卡因受BChE催化水解的第一化学反应步骤的过渡态的进
6W. (Yang, W.),曹 H. (Cho, H.),杨 G. (Yang, G.),台 H. (Tai, H.)，詹 C. (Zhan, C.), “用于抗可卡因药物的人类丁酰胆碱酷酶的计算机重新设计(Computational redesign ofhuman butyrylcholinesterase for anticocaine medication)，，，美国国家科学院院干1J(PNAS)，102 (46) : 16656-61, 2005)。为了获得可适用于治疗性用途的A227S/S315G/A356W/Y360G BChE突变体形式，将由潘(Pan)等人设计的BChE突变体的C端融合至人血清白蛋白(HSA)，因为已观察到，类似的融合体展现出稳定性高且血浆半衰期延长的有利药物动力学性质。曾观察到，包含上述突变的BChE-白蛋白融合体保有对可卡因的高催化效率且在对大鼠静脉内注射之后展现出8小时的血浆半衰期。(布瑞米乔因S. (Brimijoin，S.)，高Y. (Gao, Y.),安克 J. (Anker, J.)，格利登 L. (Gliddon, L )，拉弗勒 D. (LaFleur, D.)，沙哈R. (Shah，R.)，赵Q. (Zhao, Q.), “自人类丁酰胆碱酯酶工程化的可卡因水解酶在大鼠中选择性阻断可卡因毒性和药物寻求的恢复(A Cocaine Hydrolase Engineered from HumanButyrylcholinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement ofDrug Seeking in Rats)”，神经精神药理学(Neuropsychopharmacology)，33:2715-25，200迄今为止，尚未开发出利用包含突变A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合体治疗灵长类动物可卡因滥用或过量的有效方法。

发明内容
本发明提供一种减弱灵长类动物由可卡因暴露所致的生物效应的方法，其包含给予灵长类动物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)突变的丁酰胆碱酯酶(BChE)多肽，其包含序列EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKV(SEQ ID NO 1),( b )人血清白蛋白(HSA )多肽,其包含序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS
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LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO :2),和(c)信号肽，其包含序列 MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO :3)，其中所述融合蛋白的所述量有效引起灵长类动物由可卡因暴露所致的生物效应减弱。


图I (SEQ ID N0:4)展示 AlbuBChE,—种包含突变 A227S、S315G、A356W 和 Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。图2展示在单次IM给予0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后个别称猴(cynomolgus monkey)中的AlbuBChE血清浓度-时间分布(上图为线性标度，下图为半
对数标度)。图3展示在单次IM给予0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后称猴中的平均AlbuBChE血清浓度-时间分布(上图为线性标度,下图为半对数标度)。图4展示对照动物(n=2)和随AlbuBChE给药后时间推移的动物(n=3)中的平均可卡因浓度相对于时间的分布。图5展示对照动物(n=2)和随AlbuBChE给药后时间推移的动物(n=3)中的平均苯甲酰芽子碱浓度相对于时间的分布。图6展示对照动物(n=2)和随AlbuBChE给药后时间推移的动物(n=3)中的平均芽子碱甲酯浓度相对于时间的分布。 图7展示可卡因对照组第I天与0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE给药后第11天(240小时)的平均可卡因浓度-时间分布的比较。图8展示在单次IM给予0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后称猴的AlbuBChE PK/PD分析。在对照动物或AlbuBChE给药后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时的动物中IV给予lmg/kg剂量的可卡因。图9展示可卡因代谢途径。图10展示在对照动物(n=2)和随AlbuBChE给药后时间推移的动物(n=3)中IV给予lmg/kg可卡因之后的平均可卡因AUC(()_t)。图11展示在对照动物(n=2)和随AlbuBChE给药后时间推移的动物(n=3)中IV给予lmg/kg可卡因之后的平均苯甲酰芽子碱AUC(()_t)。图12展示在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后个别松鼠猴的AlbuBChE血清浓度-时间分布(半对数标度)。图13展示对照动物(n=2)和随AlbuBChE给药后时间推移的动物(n=3)的平均可卡因浓度相对于时间的分布。
图15展示在对照动物(n=2)和随AlbuBChE给药后时间推移的动物(n=3)中IV给予lmg/kg可卡因后5分钟时的平均苯甲酰芽子碱浓度。图16展示可卡因注射后5分钟(上图)和30分钟(下图)时可卡因以及可卡因代谢物芽子碱甲酯(EME)和苯甲酰芽子碱(BZ)的松鼠猴血液水平的汇总。图17展示在单次IM给予5mg/kg AlbuBChE剂量之后松鼠猴的AlbuBChE PK/PD分析。在对照动物(n=2)或在AlbuBChE给药后2小时、72小时和96小时的动物(n=3)中IV给予lmg/kg剂量的可卡因。图18展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均心率相对于时间的分布。图19展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均心率血压乘积相对于时间的分布。 图20展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均动脉血压相对于时间的分布。图21展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均舒张压(diastolic blood pressure)相对于时间的分布。图22展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均收缩压(systolic blood pressure)相对于时间的分布。图23展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均体温相对于时间的分布。图24A展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均呼吸速率相对于时间的分布。雄性猕猴的数据展示于图24B的上图中，且雌性猕猴的数据展示于图24B的下图中。图25A展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均SP02水平相对于时间的分布。雄性猕猴的数据展示于图25B的上图中，且雌性猕猴的数据展示于图25B的下图中。图26展示在单次IM给予15mg/kg AlbuBChE剂量或调配缓冲液之前和之后猕猴的平均ETC02水平相对于时间的分布。雄性猕猴的数据展示于图26B的上图中，且雌性猕猴的数据展示于图26B的下图中。图27展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予lmg/kg剂量的可卡因之后猕猴的平均动脉血压相对于时间的分布。在t=0时给予可卡因剂量。图28展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予lmg/kg剂量的可卡因之后猕猴的平均舒张压相对于时间的分布。在t=0时给予可卡因剂量。图29展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予lmg/kg剂量的可卡因之后猕猴的平均收缩压相对于时间的分布。在t=0时给予可卡因剂量。图30展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予lmg/kg剂量的可卡因之后猕猴的平均心率相对于时间的分布。在t=0时给予可卡因剂量。图31展示在15mg/kg AlbuBChE剂量后3小时IV给予lmg/kg剂量的可卡因之后
9猕猴的平均体温相对于时间的分布。在t=0时给予可卡因剂量。图33展示在可自行给予可卡因或盐水的连续数天内在自行给药阶段期间松鼠猴的反应率(上图)和注射次数(下图)。在给予媒剂或AlbuBChE (5mg/kg)之后追踪反应持续5天。图34展示在给予AlbuBChE或AlbuBChE媒剂之后可卡因自行给药的恢复程度。肌肉内给予AlbuBChE或媒剂。2小时、48和96小时后，在盐水替代阶段前5分钟静脉内给予0. 3mg/kg可卡因(左图)或静脉内给予0. lmg/kg可卡因(右图)。图35展示AlbuBChE对经甲基苯丙胺训练的个体中可卡因区别性刺激效应的调节。图36展示AlbuBChE给药后经甲基苯丙胺训练的个体中的甲基苯丙胺区别性刺激效应。图37展示白蛋白融合体与非融合肽相比的相对血清浓度,其中白蛋白融合体每周给予一次且非融合肽每日给予。图38展示自CHO细胞纯化的AlbuBChE的SDSHPAGE。泳道I是分子量标记物，且泳道2和泳道4分别展示在还原和非还原条件下的纯化的AlbuBChE。图39展示在可卡因给药之前经野生型BChE或AIbu-CocH处理的大鼠、仅给予可卡因剂量的大鼠和既未给予可卡因也未给予BChE的大鼠中的光束穿过次数(beamcrossing)相对于时间的分布。如布瑞米乔因(Brimijoin)等人中所述，通过检测红外线光束的断开数来评估自主活动(Locomotor activity)。图40展示AlbuBChE给药后小鼠中的AlbuBChE浓度相对于时间的分布，而且展示AlbuBChE给药后可卡因水解(以可卡因给药60分钟内可卡因转化成苯甲酸的百分比(BA%)表示)相对于时间的分布。图41展示自大鼠(n=6)收集的脑和心中的可卡因含量，所述大鼠通过尾静脉给予AlbuBChE (3mg/kg)剂量或盐水，接着10分钟后同样通过尾静脉给予30 y Ci 3H-可卡因(3. 5mg/kg)o 3H-可卡因给药后10分钟收集脑和心。从左到右，对照数据是第I条和第3条，而AlbuBChE数据是第2条和第4条。图42展示自大鼠收集的脑、心和血浆中的可卡因水平(左图)和苯甲酸酯水平(右图)，所述大鼠被给予3mg/kg AlbuBChE剂量或盐水，10分钟后给予30 u Ci 3H-可卡因剂量(3. 5mg/kg)。可卡因给药后10分钟收集脑、心和血衆。图43展示检查AlbuBChE防止致命性过度剂量的能力的研究的实验设计。图44 展示应答 0mg/kg、lmg/kg、3mg/kg 或 10mg/kg 剂量的 AlbuBChE 后 10 分钟所给予的100mg/kg剂量的可卡因而展现出机能亢进、癫痫和死亡的大鼠的百分比。图45展示史泊格多利(Sprague Dawley)大鼠中可卡因浓度相对于时间的分布，所述大鼠被给予0mg/kg、2mg/kg和10mg/kg IV剂量的AlbuBChE，接着5分钟后给予60mg/kg或100mg/kg IP剂量的可卡因。图46展示成瘾和复发的行为模型。“S”和“D”分别表示盐水和药物可卡因。训练动物触发杠杆按压以达成可卡因输注。在稳定(维持)之后，用盐水替代可卡因且使行为消断。用IV注射盐水(S)、可卡因(C，10mg/kg)或苯丙胺(A,2mg/kg)来引发已先前自行给予可卡因且在可卡因置换为盐水时消退的大鼠。在行为阶段前2小时，IV给予AlbuBChE (E,
2mg/kg)o图48展示在成瘾阶段和强迫戒断后，在盐水注射、可卡因注射(10mg/kg，IV)或是AlbuBChE (2mg/kg, IV)后给予可卡因(10mg/kg, IV)后，大鼠中每阶段的杠杆按压次数。图49展示在单次静脉内(IV)、皮下(SC)或肌肉内(IM)注射后猕猴的AlbuBChE生物可用性、半衰期和达到最大浓度的时间Tmax,相对于3mg/kg剂量水平下的IV计算IM和SC给药途径的AlbuBChE绝对生物可用性。
具体实施方式

本发明提供一种减弱灵长类动物由可卡因暴露所致的生物效应的方法，其包含给予灵长类动物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)突变的丁酰胆碱酯酶(BChE)多肽，其包含序列EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNF
GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKV(SEQ ID NO 1),(b)人血清白蛋白(HSA)多肽，其包含序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS
KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKEMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID N0:2)，和(c)信号肽，其包含序列 MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO 3)，其中所述融合蛋白的所述量有效引起灵长类动物由可卡因暴露所致的生物效应
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MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARGEDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTS LYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLEETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO :4)。在方法的另一实施例中,在可卡因暴露之前给予融合蛋白。在另一实施例中,在可卡因暴露前至多一天给予融合蛋白。在另一实施例中,在可卡因暴露前至多216小时给予融合蛋白。可在可卡因暴露前1、2、3、4、5、6、7、8或9天给予融合蛋白。在方法的另一实施例中在可卡因暴露之后给予，融合蛋白。在另一实施例中，在可卡因暴露后至多六小时给予融合蛋白。在另一实施例中，在可卡因暴露后至多一小时给予融合蛋白。在方法的另一实施例中，可卡因暴露是单次可卡因暴露。在方法的另一实施例中，可卡因暴露是重复性可卡因暴露。在方法的另一实施例中，重复性可卡因暴露是可卡因滥用或可卡因依赖。在方法的另一实施例中，重复性可卡因暴露包含在12个月期间至少六次单次可卡因暴露。在方法的另一实施例中，重复性可卡因暴露包含在灵长类动物一生期间至少二十次单次可卡因暴露。在方法的另一实施例中，生物效应由灵长类动物中可卡因过量引起，且减弱是治疗或预防所述生物效应。在方法的另一实施例中，生物效应是血压增高。
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在方法的另一实施例中，生物效应是心率或体温增高。在方法的另一实施例中，减弱程度为45%到70%。在方法的另一实施例中,减弱程度为57%。在方法的另一实施例中，生物效应是灵长类动物的可卡因寻求行为。在方法的另一实施例中，可卡因寻求行为出现在可卡因暴露之后的可卡因戒断时期期间。在方法的另一实施例中，可卡因寻求行为伴有复发。在方法的另一实施例中，在复发前两小时给予融合蛋白在复发后立即减弱灵长类动物的可卡因寻求行为。在方法的另一实施例中，在可卡因暴露前两小时给予融合蛋白引起灵长类动物的可卡因寻求行为减少50%到100%。 在方法的另一实施例中，在给予融合蛋白后至多四天观察到可卡因寻求行为的减在方法的另一实施例中,给予融合蛋白所产生的灵长类动物的总可卡因暴露比不给予时低。在方法的另一实施例中，减弱可卡因寻求行为产生灵长类动物的可卡因戒断时期。在方法的另一实施例中，戒断时期为2周到3周。在方法的另一实施例中，减弱可卡因寻求行为所产生的灵长类动物不暴露于可卡因的天数比不给予时多。在方法的另一实施例中，减弱可卡因寻求行为所产生的灵长类动物不暴露于可卡因的连续天数比不给予时多。在方法的另一实施例中，如利用可卡因选择性严重程度评估(cocaine selectiveseverity assessment，CSSA)或精神疾病诊断与统计手册 IV(Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders IV，DSM-IV)所评估，减弱可卡因寻求行为引起可卡因依赖或滥用的严重程度减弱。在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量为在静脉内给予lmg/kg可卡因约30分钟内使灵长类动物的血清可卡因水平降低到约Ong/ml的量。在方法的另一实施例中,给予融合蛋白在静脉内给予lmg/kg可卡因约5分钟内使灵长类动物的血清可卡因水平降低到低于不给予时血清可卡因水平的12%。在方法的另一实施例中,给予融合蛋白在静脉内给予lmg/kg可卡因约5分钟内使灵长类动物的血清可卡因水平降低到不给予时血清可卡因水平的7%。在方法的另一实施例中，仅一次、每日、每半周、每周、每两周或每月给予融合蛋白。在另一实施例中，每周一次或每周两次给予融合蛋白。在另一实施例中，在可卡因暴露之后以单剂量形式给予融合蛋白。在另一实施例中,在可卡因过量之后以单剂量形式给予融合蛋白。在方法的另一实施例中，通过肌肉内注射或皮下注射来给予融合蛋白。在方法的另一实施例中，融合蛋白是在包含IOmM磷酸钠、200mM甘露糖醇、60mM海
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在方法的另一实施例中,在给予融合蛋白后至多72小时观察到生物效应的减弱。在方法的另一实施例中,灵长类动物是人类。在方法的另一实施例中，可卡因暴露是IOmg到60mg的单次可卡因暴露；或是重复性可卡因暴露,其中重复性可卡因暴露中各单次可卡因暴露是IOmg到60mg。在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是在静脉内给予40mg可卡因约30分钟内使人类的血清可卡因水平降低到约Ong/ml的量。在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是0. 06mg/kg到5mg/kg。在方法的另—实施例中，融合蛋白的有效量是0. 06mg/kg、0. 3mg/kg、l. 6mg/kg或4. 8mg/kg。在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是50mg到300mg。在方法的另一实施例中，融合蛋白的有效量是50mg、IOOmg> 15Omg或300mg。包含氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白的一个实施例展示于图I中(SEQ ID N0:4)o图I中所展示的氨基酸序列包含异源信号肽(通过加下划线来展示)、包含人类BChE氨基酸E29到V529的BChE域和人血清白蛋白(HSA)(以斜体展示)。在图I中，氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G以粗体展示并加下划线。取代的编号是相对于全长BChE的编号。由图I氨基酸序列编码的蛋白质在本申请案中称为“AlbuBChE，，。应理解本发明上述实施例的所有组合均在本发明的范畴内。如本文所用,“灵长类动物”是指哺乳纲的一个目中的任一者，这一目的特征尤其在于双目视觉、抓握附属肢体特化和大脑半球扩大的高等发育，且包括人类、猿类、猴类及相关种类。如本文所用，“减弱程度”是指与缺乏BChE-白蛋白融合蛋白时所观察到的由可卡因暴露所致的生物效应相比，给予BChE-白蛋白融合蛋白之后所观察到的由可卡因暴露所致的生物效应的降低。减弱程度由下式计算
减弱程度=△缺乏BChE-lJ蛋^ ^ △苻在BChE-Cl虫U
缺乏BChE-白蛋白举例来说，如果在缺乏BChE-白蛋白融合蛋白时可卡因暴露使基线温度38°C升高到38. 7°C,并且在存在BChE-融合蛋白时可卡因暴露使基线温度38°C升高到38. 3°C，那么减弱程度是 57. 1% ((0. 70C -0. 30C )/0. 7oO0如本文所用，“单次可卡因暴露”是指孤立于任何其它可卡因暴露的一次可卡因暴露。“重复性可卡因暴露”是指一次以上的单次可卡因暴露。重复性可卡因暴露可以是从个体的第二次或后续单次可卡因暴露起定期或不定期模式的单次可卡因暴露。经历重复性可卡因暴露的个体可能符合精神疾病诊断与统计手册IV (DSM-IV)的可卡因依赖或可卡因滥用准则。如本文所用,术语“总可卡因暴露”是指在既定时间间隔期间的累计可卡因暴露。总可卡因暴露可在旨在减弱可卡因寻求行为或其它由可卡因暴露所致的生物效应的治疗期间或一段时期后测量。
如本文所用,术语“复发”是指在可卡因戒断时期之后的可卡因暴露。应理解当提供参数范围时，本发明所提供的所述范围内的整数精确到十分位。举例来说，“0. 2mg/kg 到 15mg/kg”包括 0. 2mg/kg、0. 3mg/kg、0. 4mg/kg、0. 5mg/kg 等直至并包括 15. Omg/kgo通过使用可见于出版物“行业指南针对成年健康志愿者治疗估算初期临床试验的最大安全起始齐丨J量(Guidance for Industry:Estimating the Maximum Safe StartingDose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)”，美国卫生与人类服务部(U. S. Department of Health and Human Services),美国食品药品管理局(Food and Drug Administration)药品评估和研究中心(Center for DrugEvaluation and Research,CDER)，2005年7月中的换算表，可将动物剂量换算成人类等效剂量(HED)。以mg/kg为单位的猕猴剂量可通过将猕猴剂量除以3. I来换算成以mg/kg为单位的HED。以mg/kg为单位的松鼠猴(squirrel monkey)剂量可通过将松鼠猴剂量除以 5.3来换算成以mg/kg为单位的HED。缩写清单

AUC(Ct)从时间零点直到最后可检测浓度的时间(tZ)的血浆浓度-时间曲线下面积
AUC{0-t)从时间零点到无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积
AUCex%由tz外推到无穷大而得到的AUC百分比
BChE 丁酰胆碱酯酶
BQL 低于定量限
CL 清除率
Cmax 最大浓度
CocH 可卡因水解酶
ELISA 酶联免疫吸附测定
GFR 肾小球滤过率
hr小时
HRP 辣根过氧化物酶
IM肌肉内
IV 静脉内
LLOQ 定量下限

15H卜干-jj in
NIDA国家药物滥用研究所(National Institute on Drug Abuse)
PBS磷酸盐缓冲盐水
PD药效学
PK药代动力学
RT室温
Rsq决定系数
RSD%相对标准偏差百分比
SD标准偏差
SC皮下
SOP标准操作方案
tl/2末端相半衰期
tmax最大浓度的时间
Vz末端相分布容积将图I所示的BChE-白蛋白融合蛋白(AlbuBChE)应用于如以下实例中所述的试实例I-猕猴单次肌肉内给予AlbuBChE并多次静脉内给予可卡因之后的药代动力学和药效学研究目的这一试验的目的在于测定雄性猕猴单次肌肉内给予0. 2mg/kg,lmg/kg或5mg/kgAlbuBChE剂量水平后的AlbuBChE药代动力学(PK)分布，和通过在给予AlbuBChE剂量后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时静脉内给予lmg/kg剂量的可卡因来测定AlbuBChE随时间推移的活性。基本原理AlbuBChE是人血清白蛋白(HSA)和遗传改良型人类丁酰胆碱酯酶(BChE)的融合蛋白，其对可卡因水解成苯甲酸展现出高催化效率。AlbuBChE作为一种预防药物寻求行为复发的潜在介入术正在开发中。己显示蛋白质与白蛋白的融合通过降低清除率和延长半衰期来改良所述蛋白质的药代动力学性质。预期较长的半衰期将意味着较长的给药间隔以及对药物方案的较佳顺应性。物种选择的基本原理基于解剖学、生理学和生化方面与人类的相似性选择猕猴(Cynomolgus monkey/macaca mulatta)用于本研究,这些相似性会有助于将所观察到的药代动力学和药效学性质外推到人类。己知猴可表达丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶是这一药物的组分。猴在生理上对可卡因也有反应。SC (7. 8mg/kg、2. 4mg/kg 和 0. 78mg/kg)、IM (2. 4mg/kg)和 IV (2. 4mg/kg)给予测试物品。AlbuBChE的药代动力学性质在所有所测量的SC剂量下呈线性。本研究选择IM是基于在先前研究中观察到与SC相比IM的生物可用性较大(分别为35%到39%和79%)。此外，选择0. 2mg/kg、lmg/kg和5mg/kg的AlbuBChE IM剂量水平来定义称猴的AlbuBChE药效学范围。lmg/kg IV可卡因剂量被选择为足以产生生理相关反应并在血液中达到可测量浓度可卡因同时不过度剌激动物的剂量。各组中的动物数目是评估动物间变异性所必需的每组动物的最低数目。由于这是初步研究，因此仅评估一种性别(雄性)。测试溶液 测试物品AlbuBChE在-70± 15°C下以浓度为29. 9mg/mL的冷冻液体调配物的形式储存在储备溶液中。给药前，在室温下解冻测试物品调配物。当测试物品调配物完全解冻时，通过轻轻翻转来混合容器,且用适当体积的测试物品稀释剂稀释以获得20mg/mL的浓度。用测试物品稀释剂连续稀释这一调配物以获得4mg/mL和0. 8mg/mL的浓度。盐酸可卡因、药效学测试物品是购自西格玛公司(Sigma)。剂量水平以盐酸盐的形
o实验设计研究包括总共11只未经任何处理的成年雄性猕猴,分成以下四个剂量组对照组，两只猕猴，仅接受单次IV剂量可卡因；三个剂量组，用0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg单次IM剂量AlbuBChE处理。各剂量组中使用三只未经任何处理的成年雄性猕猴。AlbnBChE处理后,在AlbuBChE剂量给予后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时给予lmg/kg IV剂量可卡因。剂量设计和剂量水平的汇总可见于表I中。个体剂量基于剂量给予当天所记录的体重加以计算。动物在剂量给予之前不禁食。表I :组设计和剂量水平
17丁单次IV剂量可卡因I1.0~ I ~1~
单次 IM 剂量 AlbuBChE__02___08__0.25
2在AlbuBChE剂量给予后2小时、48
小时、96小时、120小时和240小时给I1.0I
__予单次W剂量可卡因〖_____
—单次 IM 剂量 AlbuBChE 一I40.25
3在AlbuBChE剂量给予后2小时、483
小时、96小时、120小时和240小时给I1.0I
__予单次IV剂量可卡因1_____
单次 IM 剂量 AIbuBChE__5__20__0.25
4在AlbuBChE剂量给予后2小时、483
小时、％小时、120小时和240小时给I1.0I
予单次IV剂量可卡因1____1所有时间将均在所列时间的±5分钟内针对AlbuBChE的样品收集在研究第I天时执行AlbuBChE的单次肌肉内(IM)给药，且在表2中汇总的时间点下收集血液。将约0.5mL全血自股静脉中收集到血清分离管(SST)中。表2 AlbuBChE的药代动力学
时间点样品体积收集装置
给药前，给药后I小时、3小时、6小时、12小时、24小时、
36小时、48小时、72小时、96小时、128小时、144小时、 约0.5 mL SST_168小时、216小时和264小时___针对可卡因的样品收集在可卡因各次给药(对照组的研究第I天以及AlbuBChE剂量给予后的第I天(2小时)、第3天(48小时)、第5天(96小时)、第6天(120小时)和第11天(240小时))后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟和60分钟时自股静脉中收集约0. 5mL全血。将血液放入具有酯酶抑制剂氟磷酸二异两酯(diisopropylfluorophosphate，DFP)的K2EDTA血液收集管中。收集后将管翻转数次且置于湿冰上。在收集的45分钟内在2°C到 8°C下离心样品。回收所得血浆，且将血浆的单份200 u L等分试样置于聚丙烯管中。血浆样品在干冰上冷冻且储存在-75±15°C下。测定方法以下概要描述了在给药前和给药后不同时间所获得的猴血清样品之AlbuBChE浓度测量中所用的基于ELISA的测定。在4°C下用IOOu L含 Iu g/mL抗BChE mAb 002-01(艾碧康公司(Abcam)abl7246)的PBS涂布Immulon 4HBX板过夜。在室温下用含2%酪蛋白的IXPBS以200微升/孔阻断2小时。洗涤后，向板中添加IOOu L经稀释的血清样品以及标准品。标准品是通过将AlbuBChE从2000ng/mL以3. 64倍连续稀释到3. Ing/mL产生的。通过用含有合并的猕猴血清的缓冲液稀释来使血清样品和标准品维持在10%血清下。在洗涤步骤后,用IOOuL
18下读数。通过内推由AlbuBChE标准品的4参数拟合所生成的标准曲线来计算未知血清样品的值。猕猴血清的定量限是21.1ng/mL。血清中可卡因的LC-MS定量以下概要描述了血浆样品之可卡因测量中所用的基于LC-MS的测定。在MS分析之前，使用支撑式液体萃取(SLE-IS0LUTE，宝他公司(Biotage))来萃取血浆样品、校准标准品和对照品。25微升样品(25uL)接受150ul 5%氢氧化铵和25u I内标溶液(可卡因-d3)。在混合和转移到SLE板之后,用二氯甲烷洗脱样品,且蒸发到干燥。再悬浮于50 u I复原溶液(含5%ACN的IOmM乙酸铵水溶液)中后，以0. 5ml/min将IOu I进样到ThermoHypercarb柱上。流动相是双相流动相。使用APCI正离子界面(positive interface)且多反应监测(MRM)的Api 4000执行质谱检测。使用这一测定来测定可卡因、苯甲酰芽子碱(benzoylecgonine)和芽子碱甲酯(ecgonine methyl ester)的血衆浓度。AlbuBChE 的 PK 分析 使用个别动物的血清浓度-时间分布来测定AlbuBChE药代动力学参数值。使用计算机软件专业版 WinNonlin (4. 0. I 版，药视公司(Pharsight Corporation),美国(USA))。具体地说，应用伴以血管外输入(extravascular input)的非房室分析模型。如果血清浓度曲线末端相中的数据点少于3个，那么不计算所述分布的末端相半衰期和由所述半衰期得出的PK参数。计算所分析的参数,包括tmax，、Cmax、t1/2, AUC(0-t)和AUC(q_^)。可卡因的PK分析当数据允许时，使用可卡因给药的所有研究日个别动物的血浆浓度-时间分布来测定可卡因和其代谢物的药代动力学参数值。使用计算机软件专业版WinNorilin (4.0.1版,药视公司(Pharsight Corporation),美国(USA))。具体地说，针对可卡因使用伴以IV推注输入(IV bolus input)的非房室分析模型，且针对代谢物使用伴以血管外输入的非房室分析模型。如果血浆浓度曲线末端相中的数据点少于3个,那么不计算所述分布的末端相半衰期和由所述半衰期得出的PK参数。PK/PD 分析使用计算机软件专业版WinNonlin (4. 0. I版，药视公司(PharsightCorporation),美国(USA))来定义AlbuBChE PK/PD关系。具体地说，使用直接S形抑制效应Emax模型，其中假设如由可卡因AUC测量为最大效应(Emax)时，AlbuBChE浓度为零。可如下描述模型方程抑制效应S形Emax，Eraax时，C=O ；E0时，C=无穷大E=Emax-(Emax-EO) X (Cy/(CV +EC50y))由于在48小时时间点时观察到的活性比2小时时间点时高,因此选择S形模型。用于分析的PD参数是可卡因AUC。模型中所用的PK参数是AlbuBChE给药后2小时、48小时、96小时、120小时和240小时的AlbuBChE血浆浓度。由于在AlbuBChE给药后2小时未测量到AlbuBChE浓度，因此分析中使用给药后3小时的浓度，且假设AlbuBChE给药后3小时的AlbuBChE浓度可反映AlbuBChE给药后2小时的AlbuBChE浓度。统计方法
19
结果AlbuBChE 浓度分布AlbuBChE浓度-时间数据和汇总统计列于表3和表4中。单次0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE IM注射之后个别动物AlbuBChE血清浓度-时间分布展示于图2中。三个AlbuBC hE剂量组的平均血清浓度-时间分布展示于图3中。在IM注射之后，所有动物均具有可测量的AlbuBChE浓度。如由所有时间点的CV%均在8. 2到78. 4范围内所指示，每个剂量组的动物间变异性看似合理。AlbuBChE血清浓度随剂量增加而增大。表3 :在单次IM给予每只动物0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE剂量之后，猕猴的个别和平均AlbuBChE血清浓度(ng/mL)相对于时间(hr)的分布。
0 ! AlbuBC^hE 剂量0.2 mg/kg IM ~| 平均值~cy%
(hr)176911769217693(ng/mL)、、"
0— <LLOQ <LLOQ~ <LLOQ<LLOQ —--
1~ 37.1 — 235.4111.0128IQQ 78.4 " 3 — 176.1 — 278.5 280.7 — 245 ~ 59.8 24.4
6 — 144.0212.1272.4210 — 64.2 — 30.7
12~ 88.4 — 143.1197.9143 _ 54.8 — 38.3
2452.3 — 95.2 _ 135.794.4 ~ 41.7 44.2
3629.8 — 68.387.461.8 — 29.3 ~ 47.4
48 _ <LLOQ 66.480.773.6 — n = 2~ -
72 " <LLOQ 44.5 ~ 39.542.0 — n = 2 -
96 — <LLQQ~ 30.1<LLQQ — <LLOQ ~一
12S " <LLOQ <LLOQ <LLOQ<LLOQ- _ -
144<LLQQ~ <LLQQ~ <LLQQ<LLQQ--
168 一 <LLQQ 一 <LLOQ__<LLOQ__<LLOQ
216 ~ <LLQQ~ <LLOQ <LLOQ<LLOQ-— -
264<LLQQ <LLOQ <LLQQ<LLQQ 丨一丨一
20
权利要求
1.一种减弱灵长类动物由可卡因(cocaine)暴露所致的生物效应的方法，其包含给予 所述灵长类动物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)突变的丁酰胆碱酯酶(BChE)多肽，其包含序列 EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNA TKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGG GFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLA LQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWA VTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNF GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRK EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFT KKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILS RSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFW TSFFPKV(SEQ ID NO 1),(b)人血清白蛋白(HSA)多肽，其包含序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLV RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK AACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCI AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNA LLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLH EKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL(SEQ ID NO :2)，和(c)信号肽，其包含序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO 3),其中所述融合蛋白的所述量有效引起所述灵长类动物由所述可卡因暴露所致的所述 生物效应减弱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包含序列 MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARGEDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQ PPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCL YLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGAL GFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLL SPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNK DPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDE GTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPE NYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYE IEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQK YLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFARHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO :4)。
3.根据权利要求I或2所述的方法,其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露之前给予。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露前至多一天给
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露前至多216小时给予。
6.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露之后给予。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露后至多一小时给
8.根据权利要求I至7中任一权利要求所述的方法,其中所述可卡因暴露是单次可卡因暴露。
9.根据权利要求I至7中任一权利要求所述的方法,其中所述可卡因暴露是重复性可卡因暴露。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述重复性可卡因暴露为可卡因滥用或可卡因依赖。
11.根据权利要求9至10中任一权利要求所述的方法，其中所述重复性可卡因暴露包含在12个月期间至少六次的单次可卡因暴露。
12.根据权利要求9至10中任一权利要求所述的方法，其中所述重复性可卡因暴露包含在所述灵长类动物的一生期间至少二十次的单次可卡因暴露。
13.根据权利要求I至12中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应由所述灵长类动物中可卡因过量引起，且所述减弱是治疗或预防所述生物效应。
14.根据权利要求I至13中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应是血压增高。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述血压增高的持续时间被降低60%到90%。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述血压增高的持续时间被降低约78%。
17.根据权利要求I至13中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应是心率或体 温增高。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述减弱程度为45%到70%。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述减弱程度为57%。
20.根据权利要求I至13中任一权利要求所述的方法，其中所述生物效应是所述灵长类动物的可卡因寻求行为。
3
21. 根据权利要求书20所述的方法，其中所述可卡因寻求行为出现在所述可卡因暴露之后的可卡因戒断时间期间。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述可卡因寻求行为伴有复发。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在所述复发前两小时给予所述融合蛋白在所述复发后立即减弱所述灵长类动物的可卡因寻求行为。
24.根据权利要求20至23中任一权利要求所述的方法，其中在所述可卡因暴露前两小时给予所述融合蛋白引起所述灵长类动物的所述可卡因寻求行为减少50%到100%。
25.根据权利要求20至24中任一权利要求所述的方法，其中可卡因寻求行为的减弱在给予所述融合蛋白后至多四天观察到。
26.根据权利要求20至25中任一权利要求所述的方法,其中给予所述融合蛋白所产生的所述灵长类动物的总可卡因暴露比不给予时低。
27.根据权利要求20至26中任一权利要求所述的方法，其中减弱可卡因寻求行为产生2周到3周的可卡因戒断时期。
28.根据权利要求20至27中任一权利要求所述的方法，其中减弱可卡因寻求行为所产生的所述灵长类动物不暴露于可卡因的天数比不给予时多。
29.根据权利要求20至28中任一权利要求所述的方法，其中减弱可卡因寻求行为所产生的所述灵长类动物不暴露于可卡因的连续天数比不给予时多。
30.根据权利要求20至29中任一权利要求所述的方法,其中如利用可卡因选择性严重程度评估(CSSA)或精神疾病诊断与统计手册IV (DSM-IV)所评估，减弱可卡因寻求行为引起可卡因依赖或滥用的严重程度减弱。
31.根据权利要求I至30中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量为在静脉内给予lmg/kg可卡因约30分钟内使所述灵长类动物的血清可卡因水平降低到约Ong/ml 的量。
32.根据权利要求I至31中任一权利要求所述的方法，其中给予所述融合蛋白在静脉内给予lmg/kg可卡因约5分钟内使所述灵长类动物的血清可卡因水平降低到低于不给予时血清可卡因水平的12%。
33.根据权利要求32所述的方法，其中给予所述融合蛋白在静脉内给予lmg/kg可卡因约5分钟内使所述灵长类动物的血清可卡因水平降低到不给予时血清可卡因水平的7%。
34.根据权利要求I至33中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白每周一次或每周两次给予。
35.根据权利要求I至34中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白通过肌肉内注射或皮下注射来给予。
36.根据权利要求I至35中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白是在包含IOmM磷酸钠、200mM甘露糖醇、60mM海藻糖和0. 01% (w/v)聚山梨醇酯80，pH值为7. 2的调配缓冲液中。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白在所述调配物中的浓度为至少30mg/mlo
38.根据权利要求I至37中任一权利要求所述的方法,其中所述生物效应的减弱在给予所述融合蛋白后至多72小时观察到。
39.根据权利要求1至38中任一权利要求所述的方法，其中所述灵长类动物是人类。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述可卡因暴露是10mg到60mg的单次可卡因暴露；或是重复性可卡因暴露，其中所述重复性可卡因暴露中各单次可卡因暴露是IOmg到60mgo
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是在静脉内给予40mg可卡因约30分钟内使所述人类的血清可卡因水平降低到约Ong/ml的量。
42.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的方法,其中所述融合蛋白的有效量是0.06mg/kg 到 5mg/kgo
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是0.06mg/kg、0. 3mg/kg、I. 6mg/kg 或 4. 8mg/kg0
44.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是5Omg 到 300mgo
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是50mg、lOOmg、15Omg或300mgo 全文摘要
本发明提供一种减弱灵长类动物由可卡因(cocaine)暴露所致的生物效应的方法。所述方法包括给予所述灵长类动物一定量的包含氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白，其中所述融合蛋白的所述量有效引起所述灵长类动物由所述可卡因暴露所致的所述生物效应减弱。
文档编号C12P21/04GK102711795SQ201080061221
公开日2012年10月3日 申请日期2010年12月7日 优先权日2009年12月8日
发明者D·拉弗尔, H·哈拉克, L·斯克莱尔-泰维恩, L·示麦什-达维什, M·罗森斯托克, V·帕尔雅汀斯盖, V·诺斯奇 申请人:泰华制药工业有限公司