用于生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物的方法

专利名称：用于生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物的方法
技术领域：
本发明涉及通过重组基因表达来生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物。
背景技术：
商用的复杂生物聚合物聚羟基脂肪酸酯是由大量细菌产生的细胞内材料。聚羟基丁酸酯(PHB)基于该聚合物的化学和物理特性是有用的生物材料。PHB具有各种潜在的应用，包括用作可生物降解/热塑性材料、作为用于某些抗生素有机合成的手性中心的来源，以及作为用于药物递送和骨替代的基质。在体内，该聚合物内部降解为羟基丁酸，这是人血液的正常成分。聚羟基脂肪酸酷(PHA，包括PHB)和共聚物的生产的多种方面在例如美国专利5，534，432、美国专利5，663，063、美国专利5，798，235以及美国专利7，202，064中有所描述。作为ー个例子,众所周知细菌真养雷氏菌(Ralstonia eutropha)用于积累高水平的聚羟基脂肪酸酷(PHA)生物塑料。该野生型生物典型地产生均聚物聚羟基丁酸酯(PHB)。该聚合物通过β-酮硫解酶(PhaA)、こ酰こ酰辅酶A还原酶(PhaB)以及聚羟基脂肪酸酷合酶(PhaC)的作用产生自こ酰辅酶A。PHB不是有用的生物塑料，因为其易碎并且熔解温度接近其分解温度。之前已经证实将3-羟基己酸単体引入该聚合物链生产了比PHB更具韧性并且熔解温度更低的材料，从而提高了塑料的性能并使其比PHB适于更多的应用。美国专利7，235，621描述了在很特定的条件下生产3_羟基丁酸与3_羟基己酸的共聚物。美国专利7，235，621描述了需要具有高月桂酸含量的特定植物油来作为碳源用于微生物来生产该共聚物。这些必需的油具有比在较常见的油(如棕榈油、大豆油以及菜籽油)中发现的更短的脂肪酸。即便碳源要求有这样的限制，在美国专利7，235，621中所公开的共聚物中3-羟基己酸的最高量为13. 8mol%。美国专利申请2009/0130731描述了在重组表达PHA合酶基因(phaC)和3_酮酯酰-ACP还原酶基因(fabG)的细菌中生产3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。但是，在美国专利出版物2009/0130731中所公开的共聚物中的3-羟基己酸的最高量为4mol%。

发明内容
本发明涉及通过重组基因表达生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酷共聚物。在ー些方面中，本发明提供了以任意植物油作为碳源生产具有至少约4m0l%或5wt%的中等链长单体含量的聚羟基脂肪酸酯共聚物的细胞或生物。在一些实施方案中，所述细胞或生物用任意植物油作为碳源生产具有至少约4mol%或5wt% HHx含量的3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些实施方案中，所述细胞中3-羟基丁酸的正常合成被破坏。在一些实施方案中，编码こ酰こ酰辅酶A还原酶的基因被缺失。在一些实施方案中，所述细胞是真养雷氏菌细胞，并且PhaBl基因、phaB2基因和phaB3基因中的一种或更多种被破坏。在一些实施方案中，phaB3基因被破坏。在一些实施方案中，所述细胞或生物重组表达非内源性PHA合酶基因。在ー些实施方案中，所述非内源性PHA合酶基因是豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)PHA合酶基因或食醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans)PHA合酶基因。在一些实施方案中，所述食醚红球菌PHA合酶基因是编码SEQ ID NO 4的食醚红球菌124 D12 PHA合酶基因或编码SEQID NO :2的食醚红球菌124 C09 PHA合酶基因。在一些实施方案中，所述食醚红球菌124 D12 PHA合酶基因包含SEQ ID NO :3或由其组成和/或其中所述食醚红球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO: I或起始密码子从TTG变为ATG的SEQ ID NO :1，或由其组成。在一些实施方案中，所述细胞或生物重组表达烯脂酰辅酶A水合酶基因。在ー些实施方案中，所述烯脂酰辅酶A水合酶基因是豚鼠气单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)烯脂酰辅酶A水合酶基因。在一些实施方案中，所述铜绿假单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因是铜绿假单胞菌phajl基因(基因PA3302)或铜绿假单胞菌phaJ2基因(基因PA1018)。在一些实施方案中，所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因被扩增。在一些实施方案中，所述单体含量是至少约5mol%，至少约6mol%，至少约711101%,至少约IOmol1^,至少约1511101%或至少约2011101%或更多。在一些实施方案中，所述单体含量是至少约6wt%,至少约8wt%,至少约10wt%,至少约15wt%,至少约IOwt%或至少约25wt%或更多。在一些实施方案中，所述细胞或生物是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是雷氏菌(Ralstonia spp.)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、产碱菌(Alcaligenes spp.)或假单胞菌(Pseudomonas spp.)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真养雷氏菌、豚鼠气单胞菌、大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)细胞。在一些优选的实施方案中，所述细胞是真养雷氏菌细胞。在一些实施方案中，所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因表达自质粒。在一些实施方案中，所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因整合到所述细胞的基因组中。在另ー些方面中，本发明提供用于生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物的方法。所述方法包括培养前述的细胞或生物以生产具有至少约4mol%或5wt%的中等链长单体含量的共聚物。在一些实施方案中，所述方法包括培养前述的细胞或生物以生产具有至少约4mol%或5wt%的HHx含量的聚(HB-co-HHx)，其中生产3-羟基丁酸与3_羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些实施方案中，所述方法进ー步包括从所述细胞或生物中回收所述共聚物。在一些实施方案中，所产生共聚物的量为细胞干重的至少约20%，细胞干重的至少约30%，细胞干重的至少约40%，细胞干重的至少约50%，细胞干重的至少约60%或更多。在另ー些方面中，本发明提供用于生产细胞的方法，所述细胞产生具有至少约4mol%或5wt%的中等链长单体含量的聚羟基脂肪酸共聚物。所述方法包括在所述细胞中重组表达至少ー种食醚红球菌PHA合酶基因。在一些实施方案中，所述细胞产生具有至少约4mol %或5wt%的HHx含量的3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些实施方案中，所述食醚红球菌PHA合酶基因是编码SEQ ID NO 4的食醚红球菌124D12 PHA合酶基因和/或编码SEQ ID NO :2的食醚红球菌124 C09 PHA合酶基因。在ー些 实施方案中，所述食醚红球菌124 D12 PHA合酶基因包含SEQ ID NO :3或由其组成和/或其中所述食醚红球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO : I或起始密码子从TTG变为ATG的SEQ ID NO :1，或由其组成。 在一些实施方案中，所述方法还包括重组表达烯脂酰辅酶A水合酶基因。在ー些实施方案中，所述烯脂酰辅酶A水合酶基因是豚鼠气单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因或铜绿假单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因。在一些实施方案中，所述铜绿假单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因是铜绿假单胞菌phajl基因(基因PA3302)或铜绿假单胞菌phaJ2基因(基因 PA1018)。在一些实施方案中，所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因被扩增。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是雷氏菌中等链长、气单胞菌、根瘤菌、产碱菌或假单胞菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真养雷氏菌、豚鼠气单胞菌、大豆根瘤菌、真养产碱菌或食油假单胞菌细胞。在一些优选的实施方案中，所述细胞是真养雷氏菌细胞。在一些实施方案中，所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因表达自质粒。在一些实施方案中，将所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因整合到所述细胞的基因组中。在ー些方面中，本发明提供用于产生具有至少约4mol%或5wt%的中等链长单体含量的一种或更多种聚羟基脂肪酸酯共聚物的方法。所述方法包括根据任何前述的方法生产细胞并培养所述细胞群体。在一些实施方案中，所述共聚物中的一种或更多种是3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述细胞群体中收集ー种或更多种共聚物。在一些实施方案中，所述单体含量是至少约5mol %、至少约6mol %、至少约711101%、至少约IOmol%、至少约1511101%、至少约2011101%或更多。在一些实施方案中，所述单体含量是至少约6wt%、至少约8wt%、至少约10wt%、至少约15wt%、至少约20wt%、至少约25wt%或更多。在一些实施方案中，所产生共聚物的量是细胞干重的至少约20%、细胞干重的至少约30%、细胞干重的至少约40%、细胞干重的至少约50%、细胞干重的至少约60%或更多。在另ー些方面中，本发明提供分离的核酸分子，其编码SEQ ID NO :2或SEQ ID NO
4。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子包含SEQID NO :1或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列具有至少80%的百分比同一性、至少90%的百分比同一性、至少95%的百分比同一性或至少98%的百分比同一性或更高。在一些实施方案中，本发明提供由前述分离的核酸分子编码的分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供包含前述分离的核酸分子的载体。在一些实施方案中，本发明提供重组表达ー种或更多种前述分离的核酸分子的细胞。在一些实施方案中，所述核酸分子表达自载体。在一些实施方案中，所述核酸分子整合到所述细胞的基因组中。本发明的这些和其它方面以及其多种实施方案将根据附图和本发明的详细描述变得更为明显。


附图的目的不在于按比例绘制。在所述附图中，在各图中阐明的每ー相同或几乎相同的组分用同样的数字代表。为清楚的目的，不是每个组分都标记于每个附图中。在所述附图中图I示出PHA聚合物的结构和特性。上聚(HB);下聚(HB-co-HHx)。图2示出在PHA共聚物合成途径中PhaA、PhaB和PhaC的參与。图3图示脂肪酸β -氧化与PHA共聚物合成途径的相互作用以及单体作为脂肪酸分解代谢的副产物而制得。图4图示阻断PhaA和PhaB对PHA共聚物合成途径的影响以及单体作为脂肪酸分解代谢的副产物而制得。图5示出在果糖限定培养基中通过具有phaBl、phaB2和/或phaB3缺失的数种菌株实现的PHB合成。示出野生型以及具有单、双和三突变的菌株的結果。图6示出在果糖限定培养基中在具有phaBl、phaB2和/或phaB3缺失的数种菌株中用NADPH获得的还原酶活性。示出野生型以及具有单、双和三突变的菌株的結果。图7示出在果糖限定培养基中在具有phaBl、phaB2和/或phaB3缺失的数种菌株中对NADH的还原酶活性。示出野生型以及具有单、双和三突变的菌株的結果。图8示出对还原酶突变的回补对phaB缺失菌株的影响。将phaBl、phaB2和phaB3基因各自回加到菌株Re2115(APhaB123)的基因组。另ー个菌株具有回加到Re2115的fabG。示出在野生型、突变型以及互补的菌株中PHB合成的結果。图9示出图8中所描述的菌株的PhaA活性。图10示出由图8中描述的菌株产生的PHB聚合物的分子量。图11示出PhaB底物特异性。
图12示出PhaJ底物特异性。图13列出来自文献的数种菌株显示了使用的PHA合酶、碳源、PHA含量以及HHx的mol %。图14列出所构建的菌株和来自这些菌株的结果，显示了基因型(包括使用的PHA合酶)、PHA含量(表示为细胞干重的％ )以及HHx的wt %。图15示出用于菌株构建的方法，在其中扩增构建的PHA操纵子(phaCD12-phaA-phaJlPa)并克隆到质粒中,将质粒转化到菌株Re2133中。发明详述本发明部分涉及生产生物塑料(如具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酷共聚物)和在细菌发酵物以及其它细胞和生物中提高生物塑料产生的方法。能够发生共聚 合以产生聚羟基脂肪酸酯共聚物的単体包括3-羟基丁酸和碳链长度大于或等于5的3-羟基烃酸(參见，例如，美国专利7，341,856以及本文引用的參考文献，其每一公开内容通过引用合并到本文中用于这些指导)。作为其ー个例子，3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))尤其是具有高HHx含量的共聚物是有用的，这是由于它们的物理特性。本发明还部分涉及细胞(如真养雷氏菌菌株)，所述菌株在用脂肪酸或任意植物油作为碳源培养时能够积累高水平的具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物，如聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基己酸)。由这些细胞产生的共聚物中的3-羟基己酸含量与文献中所述产自植物油的任意材料相当或更高。与此相反，为了产生具有可接受HHx含量的共聚物，美国专利7，235，621中描述的方法需要使用在脂肪酸组成中具有月桂酸的特定植物油。即使如此，使用美国专利7，235，621中描述的方法生产的共聚物的HHx含量次于用本文描述的方法生产的所述共聚物的HHx含量。以下特征单独以及组合地包括于本发明中。在一些实施方案中，细胞中PHB的正常合成被破坏。例如，在如下的实施例中所示，在真养雷氏菌中通过缺失编码こ酰こ酰辅酶A还原酶的基因来破坏PHB。在本发明的某些实施方案中，phaB3被破坏；phaB3是之前没有在文献中表征并且不用于该特定目的的基因。但是，本发明不限于这些实施方案，并因而包括破坏正常PHB生物合成的其它方法，包括降低こ酰こ酰辅酶A还原酶的表达。在一些实施方案中，内源性PHA合酶基因被破坏并用替换为新的PHA合酶。但是，本发明不限于这些实施方案，并因而包括破坏正常内源性PHA合酶活性的其它方法，包括降低内源性PHA合酶的表达。例如，在如下的实施例中所示，将真养雷氏菌中的野生型PHA合酶基因缺失并将新的合酶基因加入到所述菌株中。所述新的PHA合酶能够掺入高比例的3-羟基己酸単体。在一些实施方案中，所述新的合酶基因来自食醚红球菌124这种生物(在本文中也成为“红球菌(Rhodococcus)C09合酶” (SEQ ID NO 1和2)或“红球菌(Rhodococcus)D12合酶”(SEQ ID N0:3和4))。但是，本发明不限于这些实施方案，因此具有掺入高比例中等链长单体(尤其是3-羟基己酸単体)的相似能力的其他PHA合酶基因也能够以相似的方式使用。在一些实施方案中，将特定的烯脂酰辅酶A水合酶基因引入细胞以提高待掺入所述共聚物中的单体的产生。例如，在如下的实施例中所示，将称作PhaJl的来自铜绿假单胞菌PAOl的(R)-特异性烯脂酰辅酶A水合酶基因(基因PA3302)引入所述真养雷氏菌菌株。所述PhaJl酶产生3-羟基丁酰辅酶A和3-羟基己酰辅酶A単体，之后由所述PHA合酶进行聚合。还可使用铜绿假单胞菌PAOl phaJ2基因(基因PA1018)。所述铜绿假单胞菌PAOl基因组的GenBank登录号是AE004091。但是，本发明不限于这些实施方案，因此具有相似能力以产生3-羟基丁酰辅酶A和3-羟基己酰辅酶A単体的一种或更多种其它的烯脂酰辅酶A水合酶基因也能够以相似的方式使用。在一些实施方案中，可以调节本文所述基因的拷贝数以改变所述细胞积累的PHA的量。例如，在如下的实施例中所示，首先将红球菌(Rhodococcus)D12合酶和铜绿假单胞菌phajl基因整合到真养雷氏菌基因组中。然后如下提高所述基因的拷贝数将所述基因克隆到质粒中，并将所述质粒引入真养雷氏菌菌株中，其中已将こ酰こ酰辅酶A还原酶基因和天然PHA合酶基因从其基因组中缺失。带有所述质粒的菌株比所述基因仅在基因组中的菌株显著地产生更多的聚合物。但是，本发明不限于这些实施方案，并因而包括调节(优选为增加)所述基因拷贝数的其它方法。本发明的ー些方面涉及通过细胞中的重组基因表达而生产具有高含量中等链长単体的聚羟基脂肪酸酯共聚物(如具有高HHx含量的3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx)))的方法和组合物。在一个实施方案中，本文描述的是在重组表达非内源性PHA合酶和烯脂酰辅酶A水合酶基因并且缺失编码こ酰こ酰辅酶A还原酶之基因的细胞中由作为碳源的植物油产生HHx含量多于5wt% (多于4mol%)的聚(HB-co-HHx)。这个系统代表了用于生产具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx)(其为具有广泛的各种应用的分子)有效的新方法根据本发明的ー些方面，本发明提供重组表达一种或更多种酶的细胞以及这些细胞用于产生具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物(如具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx))的用途。应理解，编码这些酶的基因(包括PHA合酶基因)可得自各种来源。如本领域普通技术人员所知，这些酶的同源基因可得自其它的物种，并且能够通过同源性检索来鉴定，例如通过NCBI网站(www. ncbi.nlm.nih. gov)上可用的蛋白质BLAST检索。可以通过PCR从包含特定基因的任何DNA来源的DNA中扩增这些基因。在一些实施方案中，基因序列是合成的和/或针对将引入细胞进行了密码子优化的。获得编码本文所述酶的基因的任何方法都与本发明相客。在一些实施方案中，蛋白质表达的优化还可需要编码酶的基因在引入细胞前进行修饰，如针对细菌细胞中的表达进行密码子优化。各种生物的密码子使用(codon usage)可在密码子使用数据库(Codon Usage Database) (www.kazusa.or.jp/codon/)获得。本发明描述的方法、酶、细胞和生物提供了具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸共聚物的生产。単体含量经常表示为摩尔百分数(mol%)。在一些实施方案中，产生的共聚物具有的中等链长单体(如3-轻基己酸)含量至少有411101%%、7mol%、8mol%、9mol%、IOmol %、llmol%、12mol%、13mol%、14mol%、15mol%、16mol%、17mol % λ 18mol % Λ 19mol %、20mol %、26mol %、34mol %、35mol%或更多。具有这样中等链长单体含量的共聚物可使用例如任意脂肪酸或油(例如，植物油)作为碳源产生。表达单体含量的另ー种方式是重量百分数)。摩尔百分数可通过用重量百分数值乘以O. 8而从重量百分数进行近似；相似地，重量百分数可通过将所述摩尔百分数值乘以I. 25而从摩尔百分数进行近似。因而，在一些实施方案中，产生的共聚物具有的中等链长单体(如3-轻基己酸)含量至少有Swt^jwt^Jwt^^Swt^jwt^^lOwt^i、Ilwt %、12wt %、13wt %、14wt %、15wt %、16wt %、17wt %、18wt %、19wt % >20wt % >21wt %、22wt %、23wt %、24wt %、25wt %、26wt % >27wt % > 28wt %、29wt %、30wt % >3 Iwt %、32wt %、33wt %、34wt %、35wt %或更多。具有这样中等链长单体含量的共聚物可使用例如任意脂肪酸或油(例如，植物油)作为生物或细胞的碳源而产生。在一些实施方案中，由细胞或生物产生的共聚体的量是所述细胞或生物干重(细胞干重)的至少约 20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。如上述，为了产生具有可接受HHx含量的共聚物，美国专利7，235，621中描述的方 法需要使用在脂肪酸组成上具有一定量的月桂酸的特定植物油。在美国专利7，235，621中报道的共聚物的最大HHx含量为13.8mol%。在无需使用如由美国专利7，235，621需要的在所述油或脂肪的脂肪酸组成上具有所述月桂酸含量的碳源的情况下，本文描述的方法、酶、细胞和生物用于产生具有更高HHx含量的共聚物。所述聚合物的有用的分子量包括大于10，OOO道尔顿的那些，如在约10，000道尔顿和4百万道尔顿之间，并且优选为在约50，000和一百五十万道尔顿之间。根据本发明，生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物。单体单元在本领域中已知，并包括羟基丁酸、羟基戊酸、羟基己酸、羟基庚酸、羟基辛酸、羟基壬酸、羟基癸酸、羟基十一酸以及羟基十二酸単元。在一些实施方案中，所述产生的共聚物包括羟基丁酸和羟基己酸単体，如聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基己酸)。本发明包括表达由PHA合酶聚合之単体的基因的任何细胞类型，包括原核和真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，所述细菌细胞是雷氏菌、气单胞菌、根瘤菌、产碱菌或假单胞菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真养雷氏菌、豚鼠气单胞菌、大豆根瘤菌、真养产碱菌或食油假单胞菌细胞。在一个优选的实施方案中，所述细胞是真养雷氏菌细胞。在另ー些实施方案中，所述细胞是真菌细胞如酵母细胞，例如，酵母(Saccharomyces spp·)、裂通酵母(Schizosaccharomyces spp·)、毕赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Phaffia spp.)、汉逊酵母(Hansenula spp·)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母(Candida spp.)、蓝状菌(Talaromyces spp·)、酒香酵母(Brettanomyces spp·)、许旺酵母(Schwanniomyces spp·)、管囊酵母(Pachysolenspp.)、德巴利氏酵母(Debaryomyces spp.)、亚罗酵母(Yarrowia spp.)以及エ业多倍体酵母菌株。用于生产共聚物的酵母物种和菌株的例子在美国专利7，083，972中有所描述，其公开内容通过引用合并到本文中用于这些指导。真菌的其它例子包括曲霉(Aspergillusspp. ノ、## (Pennicilium spp. )> IftZI H (Fusarium spp. ノ 、丰艮# (Rhizopus spp.) >顶抱(Acremonium spp·)、麦抱菌(Neurospora spp.)、粪壳菌(Sordaria spp.)、巨座壳属(Magnaporthe spp·)、异水霉(Allomyces spp·)、黑粉菌(Ustilago spp.)、葡萄孢(Botrytis spp.)以及木霉(Trichoderma spp·)。在另ー些实施方案中，所述细胞是藻类细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。应理解，与本发明相容的ー些细胞可表达与本发明相关的ー种或更多种基因的内源性拷贝以及重组拷贝。在一些实施方案中，如果细胞具有与本发明相关的ー种或更多种所述基因的内源性拷贝，那么所述方法将不一定需要加入所述内源性表达基因的重组拷贝。在一些实施方案中，所述细胞可内源性表达来自本文描述途径的ー种或更多种酶并且可重组表达来自本文描述途径的一种或更多种其它的酶。应理解，与本发明相容的ー些细胞可表达内源性生化途径以及该途径、相似途径或回补途径的一种或更多种重组基因。例如，真养雷氏菌(R. eutropha)表达用于单体产生的基因。如实施例中示出，这些细胞还额外表达phaj，以增强通过PHA合酶聚合的单体产生。通过在植物中表达用于单体的产生和/或聚合的有关酶而生产PHA聚合物和共聚物的方法(包括使用组织专一性启动子)在例如美国专利5，534，432和美国专利7，341,856中有所描述，每ー专利通过引用合并到本文中用于这些指导。生物和细胞中的基因表达为本领域所熟知，其包括表达自插入所述生物或细胞的 基因组的基因和/或表达自ー种或更多种染色体外的核酸上的基因，如载体(例如，质粒)。用于构建修饰的基因组、染色体外核酸和包含这些修饰的基因组或染色体外核酸的生物或细胞的方法、材料以及技术为本领域所熟知，其中ー些方法、材料和技术在本文中有所描述。在一些实施方案中，可以有利的是使用针对生产具有高含量中等链长单体的ー种或更多种聚羟基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)进行了优化的细胞。例如，可以有利的是突变生化途径的一种或更多种组分，以消除竞争途径并且产生更多具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物，如聚(HB-co-HHx)共聚物。例如，在一些实施方案中，如通过突变或缺失有助于3HB-CoA合成的ー种或更多种基因而降低3HB-CoA合成。在一些实施方案中，这可通过降低こ酰こ酰辅酶A还原酶活性来实现。例如，在真养雷氏菌中，こ酰こ酰辅酶A还原酶活性(PhaB)可通过降低phaB表达(例如通过突变或缺失(部分或全部)ー个或更多个PhaB基因)来降低。如本文所示例的，这通过从所述真养雷氏菌基因组中缺失所述phaBl、phaB2和phaB3基因来实现。在一些实施方案中，对引起增强产生具有高含量中等链长单体的ー种或更多种聚羟基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)的突变体的筛选可通过随机诱变筛选或通过已知突变的筛选来进行。在一些实施方案中，可以使用基因组片段的鸟枪克隆(shotgun cloning)来鉴定提高具有高含量中等链长单体的一种或更多种聚轻基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)之产生的基因组区域，这通过对具有这些片段的细胞和生物筛选具有高含量中等链长单体的一种或更多种聚羟基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)的生产的提高来进行。在一些情况下，可在同一细胞或生物中组合一种或更多种突变。用于培养本文所述各种细胞的培养基为本领域技术人员所熟知。例如，通过引用合并到本文的美国专利5，534，432提供了适于细菌细胞培养的培养基的例子。如本领域技术人员所理解的，用于ー种或更多种羟基酸及其共聚物生产的最佳培养条件可受到包括细胞类型、生长培养基和培养条件等许多因素的影响。培养温度是所述生物或细胞能够生长的温度，并优选为从20°C至40°C。例如，所述温度可以是20摄氏度、21摄氏度、22摄氏度、23摄氏度、24摄氏度、25摄氏度、26摄氏度、27摄氏度、28摄氏度、29摄氏度、30摄氏度、31摄氏度、32摄氏度、33摄氏度、34摄氏度、35摄氏度、36摄氏度、37摄氏度、38摄氏度、39摄氏度或40摄氏度或其之间的任何值。培养时间没有特殊限制，但可以是大约从I天至10天。为了优化具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)的生产，可通过常规实验改变的其它非限制因素包括使用的特定碳源、培养基类型、培养基pH以及在收获聚(HB-co-HHx)之前的培养细胞时间。在一些实施方案中，在培养所述细胞数天(如3天至4天)后实现最佳生产。但是，应理解，改变并优化上述參数以及其它这些相似的參数是常规的实验。
将生物或细胞培养于包含允许产生共聚物的碳源的培养基中。在一些实施方案中，将任意油和/或脂肪酸用作碳源，如任意植物油、脂肪酸或脂肪酸衍生物或其组合。植物油的例子包括棕榈油、大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、花生油、椰子油和红花油；其他的油和脂肪酸为本领域所熟知。用于最佳共聚物生产的碳源的组成可取决于所述使用的生物或细胞的特定株系。在一些实施方案中，如本领域技术人员所知，培养基的其它组分包括氮源、无机盐、选择性组分(如抗生素)或其它营养源等的多种组合。用于培养本发明相关细胞的液体培养基可封装于本领域已知和使用的任何培养容器中。在一些实施方案中，可以利用通气反应容器(如搅拌釜反应器)中的大規模生产来大量产生本发明具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物，如聚(HB-co-HHx)共聚物。对本领域技术人员而言在连续的基础上生产PHA聚合物和共聚物的方法也是已知的；这些方法例如在美国专利5，534，432中有所描述，其通过引用合并到本文中用于指导。所述PHA共聚物可分离自生物、细胞或培养基，在它们中通过本领域已知的方法产生。一个例子在下文的实施例中有所描述，其中在氯仿中从冻干细胞提取聚合物48小时。还可參见，例如，美国专利 5，942，597,5, 918，747,5, 899，339,5, 849，854和 5，821，299 ；EP 859858A1 ；W0 97/07229、WO 97/07230 和 WO 97/15681 ;每ー专利都通过引用合并到本
文中用于这些指导。作为ー个非限制的例子，可使用在美国专利申请2009/0130731中描述的方法。培养后，通过离心分离器等将细菌细胞从培养基中分离，并且将细菌细胞用蒸馏水和甲醇等洗涤，并干燥。从干燥的细菌细胞中，使用有机溶剂如氯仿提取聚酷。通过过滤等将细菌细胞组分从该包含聚酯的有机溶剂溶液中移除，并且将不良溶剂(如甲醇或己烷)加入滤液以使所述聚酯沉淀。另外，将上清通过过滤或离心分离移除，并干燥。其它的方法将为本领域技术人员所知。根据本发明生产的共聚物能够用于任何本领域已知的许多用途。例如，美国专利7，455，999在题为“Applications for the Compositions”的章节中及其引用的參考文献中对PHA聚合物的大量用途及该聚合物的物理特性进行了描述。每一公开内容通过引用合并到本文中用于这些指导。在一些实施方案中，本发明包括分离的或基本上纯化的PHA合酶核酸或多肽、包含或表达这些核酸或多肽的构建体或载体以及包含这些核酸、多肽、构建体或载体的细胞或生物。如本文所公开的，能够掺入高比例3-羟基己酸单体的食醚红球菌124的PHA合酶通过分子克隆的方法确定和分离。所分离的PHA合酶也在本文中也称为如“红球菌(Rhodococcus) C09 合酶” (SEQ ID NO 1 和 2)或红球菌(Rhodococcus)D12 合酶” (SEQ IDNO 3 和 4)。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白或者其生物活性部分基本上不含其它的细胞材料或培养基(当通过重组技术生产吋)，或者基本上不含化学前体或其它化学品(当化学合成吋)。优选地，“分离的”核酸不含在该核酸来源生物的基因组DNA中天然位于所述核酸的侧翼(即，位于所述核酸的5’和3’端的序列)的序列(优选为蛋白质编码序列)。例如，在多种实施方案中，分离的核酸分子可包含在所述核酸的来源细胞中基因组DNA中天然位于所述核酸侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或O. Ikb的核酸序列。基本上不含细胞材料的多肽(也被称为蛋白质)包括多肽制备物，其具有少于约30%、20%、10%、5% (以干重计)的污染多肽。当所述多肽或其生物活性部分重组生产时，优选地，培养基占不是所述多肽的化学前体物或其它组分的少于约(以干重计)。因此，本发明还包含所公开核酸分子及其编码多肽的片段和变体。“片段”意为核 酸分子的核苷酸序列的一部分，或其编码多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码保持天然多肽的生物活性的多肽片段。或者，核苷酸序列的片段可用作通常不编码保持天然多肽生物活性的多肽片段的杂交探针。因而，核苷酸序列的片段可从约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸一直到编码本文公开的多肽的全长核苷酸序列。编码多肽的生物活性部分的本发明核苷酸序列片段可编码至少15个、25个、30个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个或550个连续的氨基酸，或一直到全长多肽中的全部数目的氨基酸(例如，对于SEQ ID NO :2而言为562个氨基酸或对于SEQ ID NO :4而言为561个氨基酸)。多肽的生物活性部分可通过如下方式制备分离本文公开的核苷酸序列之一的一部分、表达所编码的多肽部分(例如，通过体外重组表达)并且评价所编码的多肽部分的活性。作为本文所述核苷酸序列片段的核酸分子(不论是否编码多肽的生物活性片段)包含至少15个、20个、30个、45个、60个、75个、100 个、150 个、200 个、250 个、300 个、350 个、400 个、450 个、500 个、550 个、600 个、650 个、700 个、800 个、900 个、1000 个、1100 个、1200 个、1300 个、1400 个、1500 个或 1600 个核苷酸，或一直到本文公开的全长核苷酸序列中的核苷酸数目(例如，对于SEQ ID N0:1而言为1689个核苷酸或对于SEQ ID NO 3而言为1686个氨基酸)。“变体”意为与本文公开的序列显著相似的序列。对核苷酸序列而言，保守性变体包括由于遗传密码的简并性而编码參与本发明共聚物合成的多肽之ー或其它酶的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变体(如这些)可用熟知的分子生物学技术确定，例如如下文所述用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成产生的核苷酸序列，如通过例如使用定点诱变产生但仍然编码如本文公开的多肽的那些。通常，本发明特定核苷酸序列的变体与该特定核苷酸序列将具有至少约50 %、60 %、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性，这通过使用默认參数的本文别处描述的序列比对程序而确定。本文描述的核苷酸序列可用于不仅从其它生物(尤其是其它细菌)而且从如本文所描述的其它生物或细胞中分离相应的序列。以这种方式，可以基于与本文所述序列的序列同源性，用如PCR、杂交等方法鉴定这些序列。本发明包括基于其与本文所述完整核苷酸序列或其片段的序列同一性而分离的序列。这些序列包括作为所公开的序列的直系同源物的序列。“直系同源物”意为源自共同的祖先基因并且由于物种形成而存在于不同物种中的基因。当它们的核苷酸序列和/或它们编码的多肽序列具有如本文别处定义的显著同一性吋，则认为发现于不同物种的基因是直系同源物。直系同源物的功能在物种间常常是高度保守的。在基于PCR的方法中，可以设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，以从提取自任何目的生物的cDNA或基因组DNA中扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物或PCR克隆的方法通常为本领域公知并公开在例如Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed. , Cold bpring Harbor Laooratory Press, Plamview,N. Y. ) o 还参见，Innis et al. , ed. (1990)PCR Protocols A Guide to Methodsand Applications(Academic Press, New York) ；Innis and Gelfand ed. (1995)PCRStrategies (Academic Press,New York)以及 Innis and Gelfand ed. (1999) PCR MethodsManual (Academic Press, New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，将已知核酸序列的全部或一部分用作探针，所述探针与选定的生物或细胞的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群体(如基因组或cDNA文库)中所存在的其它相应核苷酸序列选择性杂交。如本领域所熟知的，杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可用任何可检测标志物进行标记。因此，例如用于杂交的探针可通过对基于本文所述核苷酸序列或其简并序列的合成寡核苷酸进行标记而制得。用于制备杂交探针以及用于构建cDNA和基因组文库的方法为本领域所公知并公开于，例如 Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。这些序列的杂交可在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”意为这样的条件，在该条件下探针与其目标序列以可检测的更高程度(与其他序列相比)发生杂交(例如，至少超过背景的2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下也将不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可鉴定与所述探针100%互补的目标序列(同源杂交(homologous probing))。或者,可调节严格条件到允许在序列中ー些错配以便检测较低的相似度(异源杂交(heterologous probing))。通常,探针在长度上少于约1000个核苷酸，优选地在长度上少于500个核苷酸。在严格杂交条件下用于杂交的各种技术、方法、条件和组合物为本领域所熟知并可发现于文献,如Ti jssen (1993) Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization witn Nucleic Acid Probes,Part I, Chapter 2 (Elsevier, N. Y.)和 Ausubel et al. ed. (1995)Current Protocolsin Molecular Biology, Chapter 2(Greene Publishing and ffiley-Interscience, NewYork) o 參见 Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y.)。本发明包括在严格条件下与本文公开的PHA合酶序列或其片段杂交的分离的序列。在一些实施方案中，这些序列将与本公开内容的序列有至少约
80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同源性。也就是说，所述序列的序列同一性可与本文公开的序列有至少约50 %、60 %、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一,I"生。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。使用数学算法可以完成任何两个序列之间序列同一性百分数的測定。这些数学算法的非限制性例子是Myers and Miller (1988)CABIOS 4 :11-17 的算法、Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2 :482 的局部同源性算法、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453 的同源性比对算法、Pearsonand Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :2444-2448 的相似性检索方法、如在 Karlinand Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 中修改的 Karlin andAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268 的算法。这些数学算法的计算机工具可用于序列比较以确定序列同一性。这些工具包括但不限于PC/Gene 程序中的 CLUSTAL (购于 Intelligenetics, Mountain View,Calif.) ;ALIGN程序(2. O版)和第8版威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA (购于 Genetics Computer Group (GCG), 575Science Drive, Madison, ffis. , USA)。还可通过互联网在美国国家生物技术信息中心(NCBI ；參见,例如，www. ncbi. nlm. nih. gov 或 blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast, cgi)的网站上利用BLAST和相关程序(如其它序列比较程序)。使用这些程序的比对可使用默认參数进行。Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215 :403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul (1990)的算法。例如，BLAST核苷酸检索可用BLASTN程序(分数=100，字长=12)进行以获得与编码本文所述多肽的核苷序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用BLASTX程序(分数=50，字长=3)进行以获得与本文所述多肽的氨基酸序列同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的缺ロ比对，可使用如在Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 中描述的 Gapped BLAST(在 BLAST 2· O 中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2. O中)可用于进行检测分子间远亲关系的迭代搜索。參见Altschulet al. (1997)。当使用 BLAST、Gapped BLAST、PSI_BLAST 时，可使用各自程序(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)的默认參数。在一些实施方案中，本文描述的ー种或更多种基因在一种或更多种重组表达载体中表达。这些载体可単独地或组合地(如在操纵子排列中)包含基因。如本文所使用的“载体”可以是任何数量的核苷酸，其中可通过限制性酶处理和连接而将期望的序列插入，用于在不同遗传环境中的转移或用于在宿主细胞中的表达。载体通常由DNA构成，但也有RNA载体可用。载体包括但不限于质粒、福斯质粒(fosmid)、曬粒(phagemid)、病毒基因组和人工染色体。克隆载体是能够在宿主细胞中自主复制或整合到基因组中的载体，其进ー步特征在于所述载体可通过ー种或更多种限制性核酸内切酶位点以确定的方式切开，并可将期望的DNA序列连接到其中，以使新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。对于质粒的情况，期望序列的复制可随着质粒在宿主细胞(宿主细菌)中拷贝数的増加发生许多次，或在仅在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主仅发生一次。对于噬菌体的情況，复制可在裂解阶段主动地发生，或在溶原阶段被动地发生。表达载体是可通过限制性酶处理及连接将期望的DNA插入其中以使该序列与调控序列有效连接并可表达成RNA转录本的载体。载体可进ー步包含适于鉴别细胞是否转化或转然染有该载体的一种或更多种标记序列。标记包括如编码提高或降低对抗生素或其它化合物之抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码可通过本领域已知的标准试验检测酶活性的酶(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因和以可见方式影响转化或转染细胞、宿主、克隆或菌斑(plaque)的表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。优选的载体是这样的载体，其能够自主复制，并表达与该载体有效连接的DNA片段中存在的结构基因产物。如本文所使用的，当编码序列和调控序列以将所述编码序列的表达或转录置于所述调控序列的影响或控制下的方式共价连接时，则称它们是“有效”连接。如果期望将编码序列翻译成功能性蛋白质，那么在这种情况下称两DNA序列为有效连接，即在对5’调控序列中启动子的诱导引起编码序列转录，并且两DNA序列之间连接的性质不会⑴引起移码突变的引入，(2)干涉启动子区指导所述编码序列转录的能力或(3)干涉相应RNA转录本翻译成蛋白质的能力。因而，如果启动子区能够实现该DNA序 列的转录以致所得转录物能翻译成期望的蛋白质或多肽，那么启动子区就是与编码序列有效连接的。在细胞中表达编码本发明的任何酶的核苷酸分子时，各种转录控制序列(例如，启动子/增强子序列)可用于指导其表达。所述启动子可以是天然启动子，即所述基因在其内源环境中的启动子，其提供所述基因表达的正常调控。在一些实施方案中，所述启动子可以是组成型的，即所述启动子不受调控，以允许其相关基因的持续表达。还可使用多种条件性启动子，如通过分子的存在与否来控制的启动子。基因表达所需调控序列的确切性质在物种或细胞类型之间可以不同，但是必要时一般应包括分别涉及转录和翻译起始的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。尤其是，这些5’非转录调控序列将包含启动子区，其包含用于有效连接之基因的转录控制的启动子序列。调控序列还可包括如期望的增强子序列或上游激活序列。本发明的载体可任选地包括5’前导或信号序列。合适载体的选择和设计在本领域技术人员的能力和判断之内。包含用于表达的所有必需元件的表达载体是市售的，并为本领域技术人员所知。參见，例如，SambrooK: et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。通过将外源DNA(RNA)引入到细胞中而对细胞进行基因工程。所述外源DNA (RNA)置于转录元件的有效控制下，以允许在所述宿主细胞中表达所述外源DNA。在实施例章节显示了基因序列的外源表达，以促进生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物，尤其是具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx)。用于生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物(如具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx))的新方法还可在其它细菌细胞、古细菌细胞、真菌(包括酵母细胞)、哺乳动物细胞、植物细胞等中进行。可使用本领域中的标准方法和技术将编码本文所述酶的核酸分子引入细胞。例如，可通过标准的方案(如转化包括化学转化和电穿孔、转导、粒子轰击等)将核酸分子引入。编码本发明酶的ー种或更多种核酸分子的表达还可通过将所述核酸分子整合到细胞的基因组中来实现。
实施例实施例I :具有降低PhaB活性的菌株
単体3-羟基丁酰-辅酶A(3HB_CoA)通过β -酮硫酶(PhaA)和こ酰こ酰辅酶A还原酶(PhaB)合成自こ酰辅酶Α。真养雷氏菌基因组中的蛋白质序列分析预测到了这些蛋白的已充分研究形式的许多潜在同源物(PhaA，H16_A1438 ；PhaBI, H16_A1439)。为了防止3HB-CoA合成，我们干净地从真养雷氏菌基因组中缺失了基因phaBl、phaB2和phaB3。使用修改自York[l]的方法进行无标记缺失。通过PCR扩增目的基因的上游和下游DNA序列。通过重叠(overlap)PCR将该序列组合成单个连续DNA区段。设计这个过程期间使用的引物，使得将BamHI位点加入到该DNA的末端并且将SwaI位点插入该上游和下游区域之间。将该构建体克隆到PGY46骨架的BamHI位点，以产生可用于在真养雷氏菌中产生目的基因的无标记缺失的质粒[2]。将该质粒转化到大肠杆菌(E.coli)S17-l中并通过接合引入到真养雷氏菌中。使用能与目的基因的上游和下游杂交的诊断引物(diagnosticprimer)通过PCR确认缺失。构建了一系列菌株，在其中所有的phaB基因都各自地或组合地缺失(參见下文表I)。之后将这些菌株在果糖是唯一的碳源的限定培养基中培养。通过氮限制来诱导PHB积累。表I :菌株列表
权利要求
1.一种细胞，其使用任意植物油作为碳源产生具有至少约4mol%或5wt%的中等链长単体含量的聚羟基脂肪酸酯共聚物。
2.根据权利要求I所述的细胞，其中所述细胞使用任意植物油作为碳源产生具有至少约4mol %或5wt% HHx含量的3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co_HHx))。
3.根据权利要求I或2所述的细胞，其中所述细胞中3-羟基丁酸的正常合成被破坏。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中編码こ酰こ酰辅酶A还原酶的基因被缺失。
5.根据权利要求4所述的细胞,其中所述细胞是真养雷氏菌(Ralstoniaeutropha)细胞，并且PhaBl基因、phaB2基因和phaB3基因中的ー种或更多种破坏。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中phaB3基因被破坏。
7.根据权利要求I至6中任一项所述的细胞，其中所述细胞重组表达非内源性PHA合酶基因。
8.根据权利要求7所述的细胞，其中所述非内源性PHA合酶基因是豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae) PHA合酶基因或食醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans) PHA合酶基因。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中所述食醚红球菌PHA合酶基因是编码SEQID NO4的食醚红球菌124 D12 PHA合酶基因或编码SEQ ID NO :2的食醚红球菌124 C09 PHA合酶基因。
10.根据权利要求9所述的细胞，其中所述食醚红球菌124D12 PHA合酶基因包含SEQID NO :3或由其组成，和/或其中所述食醚红球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO:I或起始密码子从TTG变为ATG的SEQ ID NO :I或者由其组成。
11.根据权利要求I至10中任一项所述的细胞，其中所述细胞重组表达烯脂酰辅酶A水合酶基因。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述烯脂酰辅酶A水合酶基因是豚鼠气单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)烯脂酰辅酶A水合酶基因。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述铜绿假单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因是铜绿假单胞菌PhaJl基因(基因PA3302)或铜绿假单胞菌phaJ2基因(基因PA1018)。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的细胞，其中所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因是经扩增的。
15.根据权利要求I至14中任一项所述的细胞，其中所述单体含量为至少约5mol%。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述单体含量为至少约6mol%。
17.根据权利要求16所述的细胞，其中所述单体含量为至少约7mol%。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述单体含量为至少约10mol%。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述单体含量为至少约15mol%。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述单体含量为至少约20mol%。
21.根据权利要求I至14中任一项所述的细胞，其中所述单体含量为至少约6wt%。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述单体含量为至少约Swt%。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中所述单体含量为至少约10wt%。
24.根据权利要求23所述的细胞，其中所述单体含量为至少约15wt%。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述单体含量为至少约20wt%。
26.根据权利要求25所述的细胞，其中所述单体含量为至少约25wt%。
27.根据权利要求I至26中任一项所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。
28.根据权利要求27所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞或真菌细胞。
29.根据权利要求28所述的细胞,其中所述细胞是雷氏菌(Ralstoniaspp.)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、产碱菌(Alcaligenes spp.)或假单胞菌(Pseudomonas spp.)的细胞。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞是真养雷氏菌、豚鼠气单胞菌、大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)的细胞。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述细胞是真养雷氏菌细胞。
32.根据权利要求7至31中任一项所述的细胞，其中所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因表达自质粒。
33.根据权利要求7至31中任一项所述的细胞，其中所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因整合到所述细胞的基因组中。
34.用于生产具有高含量中等链长单体的聚羟基脂肪酸酯共聚物的方法，所述方法包括培养根据权利要求I至33中任一项所述的细胞以生产具有至少4mol%或5wt%的中等链长单体含量的共聚物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法包括培养根据权利要求2至33中任一项所述的细胞以生产具有至少约4mol%或5wt%的HHx含量的聚(HB-co-HHx)，其中生产3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其还包括从所述细胞中回收所述共聚物。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约20%。
38.根据权利要求37所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约30%。
39.根据权利要求38所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约40%。
40.根据权利要求39所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约50%。
41.根据权利要求40所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约60%。
42.用于产生细胞的方法,所述细胞产生具有至少约4mol%或5wt%的中等链长单体含量的聚羟基脂肪酸共聚物，所述方法包括在所述细胞中重组表达至少ー种食醚红球菌PHA合酶基因。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述细胞产生具有至少约4mol%或5 セ％的HHx含量的3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述食醚红球菌PHA合酶基因是编码SEQID NO 4的食醚红球菌124 D12 PHA合酶基因和/或编码SEQ ID NO 2的食醚红球菌124C09 PHA合酶基因。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述食醚红球菌I24D12PHA合酶基因包含SEQ ID NO :3或由其组成，和/或其中所述食醚红球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO :1或起始密码子从TTG变为ATG的SEQ ID NO :I或者由其组成。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其还包括重组表达烯脂酰辅酶A水合酶基因。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述烯脂酰辅酶A水合酶基因是豚鼠气单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因或铜绿假单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因。
48.根据权利要求47所述的细胞，其中所述铜绿假单胞菌烯脂酰辅酶A水合酶基因是铜绿假单胞菌PhaJl基因(基因PA3302)或铜绿假单胞菌phaJ2基因(基因PA1018)。
49.根据权利要求42至48中任一项所述的方法，其中所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因是经扩增的。
50.根据权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞或真菌细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述细胞是雷氏菌、气单胞菌、根瘤菌、产碱菌或假单胞菌的细胞。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞是真养雷氏菌、豚鼠气单胞菌、大豆根瘤菌、真养产碱菌或食油假单胞菌的细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞是真养雷氏菌细胞。
55.根据权利要求42至54中任一项所述的方法，其中所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因表达自质粒。
56.根据权利要求42至54中任一项所述的方法，其中所述非内源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰辅酶A水合酶基因整合到所述细胞的基因组中。
57.用于生产具有至少约4m0l%或5wt%的中等链长单体含量的一种或更多种聚羟基脂肪酸酯共聚物的方法，所述方法包括根据权利要求Cl至C14中任一项所述方法产生细胞，以及培养所述细胞的群体。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述共聚物中的一种或更多种是3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其还包括从所述细胞的群体中收集ー种或更多种 共聚物。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述单体含量为至少约5mol%。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述单体含量为至少约6mol%。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述单体含量为至少约7mol%。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述单体含量为至少约IOmol%。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述单体含量为至少约15m0l%。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述单体含量为至少约20mol%。
66.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述单体含量为至少约6wt%。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述单体含量为至少约Swt%。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述单体含量为至少约10wt%。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述单体含量为至少约15wt%。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述单体含量为至少约20wt%。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述单体含量为至少约25wt%。
72.根据权利要求57至71中任一项所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约20%。
73.根据权利要求72所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约30%。
74.根据权利要求73所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约40%。
75.根据权利要求74所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约50%。
76.根据权利要求75所述的方法，其中产生的共聚物的量为细胞干重的至少约60%。
77.一种分离的核酸分子，其编码SEQ ID NO:2。
78.一种分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO : I或将起始密码子从TTG改变为ATG的SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。
79.—种分尚的核酸分子,其与SEQ ID NO :I所不核苷酸序列具有至少80%的百分比同一,I"生。
80.根据权利要求79所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子与SEQID NO:I所示核苷酸序列具有至少90%的百分比同一性。
81.根据权利要求80所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子与SEQID NO:I所示核苷酸序列具有至少95%的百分比同一性。
82.根据权利要求81所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子与SEQID NO:I所示核苷酸序列具有至少98%的百分比同一性。
83.一种分离的多肽，其由根据权利要求77至82中任一项所述的核酸分子编码。
84.ー种载体，其包含根据权利要求77至82中任一项所述的分离的核酸分子。
85.一种细胞，其重组表达根据权利要求77至82中任一项所述的分离的核酸分子。
86.根据权利要求85所述的细胞，其中所述核酸分子表达自载体。
87.根据权利要求85所述的细胞，其中所述核酸分子整合到所述细胞的基因组中。
88.一种分离的核酸分子，其编码SEQ ID N0:4。
89.—种分尚的核酸分子,其包含SEQ ID NO :3所不核苷酸序列。
90.—种分尚的核酸分子,其与SEQ ID NO :3所不核苷酸序列具有至少80%的百分比同一,I"生。
91.根据权利要求90所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子与SEQID NO:3所示核苷酸序列具有至少90%的百分比同一性。
92.根据权利要求91所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子与SEQID NO:3所示核苷酸序列具有至少95%的百分比同一性。
93.根据权利要求92所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子与SEQID NO:3所示核苷酸序列具有至少98%的百分比同一性。
94.一种分离的多肽，其由根据权利要求88至93中任一项所述的核酸分子所编码。
95.ー种载体，其包含根据权利要求88至93中任一项所述的分离的核酸分子。
96.一种细胞，其重组表达根据权利要求88至93中任一项所述的分离的核酸分子。
97.根据权利要求96所述的细胞，其中所述核酸分子表达自载体。
98.根据权利要求96所述的细胞，其中所述核酸分子整合到所述细胞的基因组中。
全文摘要
本发明涉及通过重组基因表达生产具有高3-羟基己酸单体含量的聚羟基脂肪酸酯共聚物。
文档编号C12P7/62GK102822349SQ201080061115
公开日2012年12月12日 申请日期2010年11月10日 优先权日2009年11月11日
发明者查尔斯·福里斯特·布德, 超坤·瑞哈, 安东尼·约翰·辛斯基 申请人:麻省理工学院