专利名称：用于产生和调节iPS细胞的方法及其组合物的制作方法
分化过程中表现出活性或表达的增加或减少。在一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少2倍。在另一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少3倍。在另一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少5倍。在一个方面，所述微RNA可以是miR-17、miR-25、miR-106a或 miR-302b 簇中的一种或多种微 RNA，包括 miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-let-7家族成员(例如，let-7a;miR 98)或它们的组合。在一个有关的方面，所述微RNA具有包含SEQ ID NO: I的多核苷酸序列，该序列已经被确定在不同的微RNA (例如，SEQ ID N0:2-ll的那些，它们对应着在miR-17、miR-25、miR-106a和miR_302b簇内的微RNA种类)之间是保守的。在一个方面，所述微RNA具有选自SEQ ID NO:2-11的多核苷酸序列。在不同的方面，所述细胞核重新程序化因子由在导入所述细胞中的重组载体中包含的基因编码。在另一个方面，所述试剂抑制p21、Tgfbr2, p53或它们的组合的表达或活性。在另一个方面，所述试剂调节Spry 1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。在不同的方面，所述细胞核重新程序化因子由下述基因中的一个或多个编码S0X家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、0CT4、NAN0G、LIN28或它们的组合。在一个示例性的方面，所述细胞核重新程序化因子是0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。在另一个方面，所述至少一种细胞核重新程序化因子包括c-Myc。在另一个方面，c-Myc通过抑制至少一种miRNA至少部分地增强重新程序化。在另一个实施方案中，本发明提供了 iPS细胞或使用本文所述的方法产生的这种细胞的群体。在另一个实施方案中，本发明提供了通过本文所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞的富集群体。类似地，在另一个实施方案中，本发明提供了通过诱导使用本文所述的方法产生的iPSC的分化而衍生出的分化的细胞。在一个方面，通过如下诱导分化而衍生出所述体细胞使所述iPSC接触RNA分子或反义寡核苷酸。在一个方面，所述RNA分子选自微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA 或 shRNA。在另一个实施方案中，本发明提供了一种使用通过本文所述的方法制备的iPS细胞治疗受试者的方法。所述方法包括使用本文所述的方法，将受试者的体细胞诱导成诱导的多能干(iPS)细胞，诱导所述iPS细胞的分化，以及将所述分化的细胞导入受试者中，从而治疗病症。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于评价试剂的生理功能的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的iPS细胞或它们的来源体细胞。在一个方面，所述方法包括处理使用本文所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞，以及评价由所述试剂引起的至少一种细胞功能的变化。在另一个方面，所述方法包括用试剂处理分化的细胞，所述细胞通过诱导本文所述的多能干细胞的分化而衍生出，以及评价由所述试剂引起的细胞功能的变化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种评价化合物的毒性的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的iPS细胞或它们的来源体细胞。在一个方面，所述方法包括用所述化合物处理使用本文所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞，以及评价所述化合物的毒性。在另一个方面，所述方法包括用所述化合物处理分化的细胞，所述细胞通过诱导本文所述的多能干细胞的分化而衍生出，以及评价所述化合物的毒性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法。所述方法包括使体细胞接触至少一种细胞核重新程序化因子；以及使所述细胞接触P21、Tgfbr2、p53的或它们的组合的表达或活性的抑制剂。在一个方面，所述抑制剂抑制p21的表达和/或活性。在另一个方面，所述抑制剂抑制Tgfbr2的表达和/或活性。在另一个方面，所述抑制剂抑制P53的表达和/或活性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法。所述方法包括使体细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的试剂，其中所述试剂诱导体细胞的多能性，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的方法。所述方法包括通过本文所述的方法，从受试者的体细胞产生诱导的多能干(iPS)细胞；诱导iPS细胞的分化；以及将所述细胞导入受试者中，从而治疗病症。在另一个实施方案中，本发明提供了微RNA用于提高iPS细胞的产生效率的用途。在一个方面，所述微 RNA 选自miR-17、miR-25、miR-93、miR_106a、miR_106b、miR-21、 miR-29a、miR-302b簇或它们的组合。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a 或 miR-302b 簇中。在另一个方面，所述微 RNA 是 miR-93、miR_106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明提供了选自下述的miR序列的组合miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b 簇、miR let-7 家族成员或它们的组合。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a*miR-302b簇中。在另一个方面，所述微RNA是miR-93、miR_106b、miR-21、miR_29a或它们的组合。
图I显示了 RNAi机制在小鼠iPSC诱导中的涉入。图la、lb和Ic分别图解了shRNA 对小鼠 RNAi 机制基因 Ago2、Drosha 和 Dicer 的敲除(knock-down)。通过 RT-qPCR(如在直方图中所示)和对应的蛋白印迹，分析了靶向的基因的mRNA和蛋白水平。用4种因子+靶向Drosha、Dicer和Ago2的shRNA转导原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。用慢病毒shRNA+4 ug/U I聚凝胺转导MEF，并在转导后第3天收获总RNA或蛋白。分别通过RT-qPCR和蛋白印迹法，分析靶向的基因的mRNA和蛋白水平。pLKO是shRNA慢病毒载体的空载体对照。pGIPZ是表达非靶向shRNA的慢病毒载体。图Id表明，Ago2的敲除会减少OSK的iPSC诱导。将集落染色，并在转导后第21天定量AP。误差棒代表来自一式两份的孔的标准差。图Ie显示了具有shAgo2的iPSC的GFP+集落定量。在转导后第21天定量GFP+集落。误差棒代表来自一式两份的孔的标准差。图If表明，Ago2的敲除会急剧减少4F的iPSC诱导。用4种重新程序化因子(OSKM (4F))+shRNA Ago2转导原代MEF。可以在转导后第14天对集落进行碱性磷酸酶染色，所述碱性磷酸酶是mES/iPS细胞的标志物。pLKO和pGIPZ载体充当阴性对照。图2显示了在重新程序化的早期，微RNA簇miR_17、25、106a和302b的诱导。图2a显示的图解表示描绘了在4种因子转导以后的早期，10个微RNA簇的表达诱导。使用miR RT-qPCR来定量在ES细胞中高度表达的10个簇的代表性微RNA的表达变化。分析了来自起始MEF和在4F转导后第4天的MEF的总RNA。直方图的黑色条显示了感染后第4天的MEF，而空白条显示了起始MEF。星号指示诱导的微RNA。图2b显示了在4F转导后第4天诱导的不同miR簇的种子区对比。类似的种子区标有下划线。图2c显示了微RNA的诱导的图解表示。4种因子的不同组合可以诱导代表性的微RNA。在转导后4天，定量微RNA表达。使用4F、OSK、OS和单一因子来分析哪种因子负责miR表达变化。图3显示了 miR-93和miR_106b对iPSC的增强的诱导。图3a的图形表示显示了重新程序化试验时间线。在第0天和第5天，以50nM的终浓度转染微RNA模仿物。在第11天(对于4F诱导)和第15-20天(对于OSK 3种因子iPSC诱导)，定量GFP+集落。图3b的图解表示显示了 miR-93和miR-106b模仿物会增强使用4F诱导的iPSC诱导。用50nM指示的微RNA转染0ct4-GFP MEF。在转导后第11天，定量GFP+集落。从使用一式三份的孔的3个独立实验计算出诱导倍数和误差棒。图3c的图解表示显示了使用OSK系统对miR-93和miR-106b的增强作用的鉴别。像在4F实验中一样，转染微RNA模仿物。在第15-20天，定量GFP+集落。误差棒代表来自使用一式三份的孔的3个独立实验的标准差。图3d的图解表示显示了微RNA的抑制对重新程序化效率的影响。miR-93和miR_106b的抑制剂会急剧降低重新程序化效率。也在50nM的终浓度转染微RNA抑制剂，并维持与miR模仿物转染相同的实验时间线。误差棒代表来自使用一式三份的孔的3个独立实验的标准差。 图4显示了源自miR模仿物实验的iPSC克隆的表征，其中通过不同的内源ES标志物的RT-PCR，分析了表达。在传代后第3天，从iPS细胞系分离出总RNA。通过RT-PCR，分析ES细胞特异性的标志物诸如Eras、ECat I、Nanog和内源0ct4的表达。图5显示了 miR-93和miR-106b对小鼠p21和Tgfbr2的靶向。图5a表明，miR-93和106b转染会降低p21蛋白水平。用50nM miR模仿物转染0ct4_GFP MEF,并在转染后48小时收获，用于蛋白印迹分析。使用肌动蛋白作为加载对照。图5b表明，siRNA会有效地敲除p21。在48小时时收获P21siRNA和对照转染的MEF，并进行RT-qPCR和蛋白印迹法以证实p21表达。将p21mRNA针对GAPDH标准化。图5c表明，siRNA对p21的敲除会增强iPSC诱导。用4F病毒感染MEF，并按照与微RNA模仿物转染相同的时间线，转染siRNA。在第11天，定量GFP+集落。误差棒代表使用一式三份的孔的至少2个独立实验。图5d表明，miR-93和106b转染会减少Tgfbr2表达。在48小时时，收获转染的细胞用于蛋白印迹。图5e表明，siRNA会敲除Tgfbr2。将相对Tgfbr2mRNA水平针对Gapdh的水平标准化。图5f表明，siRNA对Tgfbr2的敲除会增强iPSC诱导。误差棒代表使用一式三份的孔的至少3个独立实验。图6显示了微RNA对重新程序化的增强。图6a表明，miR-17和miR_106a可以提高重新程序化效率，但是miR-16不会。以50nM的终浓度，将MiR-17和miR_106a模仿物转染进MEF中。在转导后第11天，定量GFP+集落。误差棒代表使用一式三份的孔的2个独立实验。图6b表明，miR-17和106a靶向p21。在将微RNA模仿物转染进MEF中以后2天，进行P21蛋白印迹法。miR-17和miR-106a靶向Tgfbr2表达。以50nM终浓度，将微RNA模仿物转染进MEF中。图6c表明，miR-17和106a靶向Tgfbr2。在转染后2天，进行蛋白印迹法。图6d显示了微RNA在iPSC诱导过程中的作用的模型。在重新程序化的早期，诱导了几种微RNA，包括miR-17、25和106a簇。这些微RNA会促进完全重新程序化，这通过靶向拮抗该过程的因子(诸如P21)和其它未鉴定的蛋白来实现。向上和向下代表重新程序化过程期间的潜在的不同的阶段和屏障，虚线指示重新程序化的屏障，其在微RNA诱导以后在重新程序化的细胞中降低。
图I的示意图描绘了 miR-93和miR_106b对小鼠iPSC诱导的剂量响应。用不同浓度(5、15和50nM)的微RNA转染0ct4_GFP MEF。使用模仿物对照siRNA作为对照。在转导后第11天，定量GFP+集落。数据代表12孔平板中的一式三份的孔。图8显示了在iPSC诱导过程中诱导的p21表达。图8a显示了使用p21表达的不同系统(从左向右0SKM、0SK、OS、Klf4、cMyc和MEF对照)的蛋白印迹分析。Klf4和cMyc会诱导P21表达。在转导后第5天，收获用4F、0SK、0S、Klf4和cMyc感染的MEF，用于蛋白印迹法分析。图8b显示的示意图显示了不同的转基因在感染的MEF中的表达确认。图9显示了 p21过表达对使用OSK 3种因子的重新程序化的抑制。图9a是来自OSK诱导和p21过表达的iPSC的AP+集落定量的示意图。在第21天，对诱导的细胞进行碱性磷酸酶染色。在与OSK相同的时间，导入p21病毒。图9b是来自OSK诱导和p21过表达的iPSC的GFP+集落定量的示意图。图10显示了 miRNA对p21表达的直接调节。图IOa的图形表示显示了在p2ImRNA3’ UTR中发现的2个潜在位点。将突变导入第一个位点(保守位点)中，以破坏miR-93和 106b的结合亲和力。图IOb的示意图显示了在Hela细胞中的pGL3-p21萤光素酶报道基因表达的定量。用pGL3-p21和pRL-TK以及微RNA转染Hela细胞，在48小时后收获。将结果针对转染的细胞中的PRL-TK水平标准化。图11显示了 miRNA对Tgfbr2表达的直接调节。图Ila的图形表示显示了在Tgfbr2mRNA 3’UTR中发现的2个潜在位点。图Ilb的示意图显示了在Hela细胞中的萤光素酶报道基因表达的定量，其与P21实验类似地进行。将结果针对转染的细胞中的pRL-TK水平标准化。图12显示了在有指示的不同miRNA存在下的相对Tgfbr2 mRNA水平。图13表明，shRNA在shAgo2感染的MEF中活跃地表达。图13a显示了 shAgo2水平，图13b显示了 shRNA水平。图13c显示了 ES特异性的标志物在Ago2感染的MEF中的表达。图14显示了在OSKM因子转导以后第0、4、8和12天时的相对miRNA表达。图15显示了 miR-93模仿物对miR-93的相对水平的影响。图16a表明，miR抑制剂可以减少祀miR表达。图16b进一步显示了 miR抑制剂在重新程序化过程的不同阶段的影响。图17显示了当导入miR-93或miR_106b时，内源Nanog基因座的启动子甲基化水平。图18a和18b表明，在miR-93转染以后显著减少的基因可以表现出在iPSC中低表达的基因的3倍富集，而在miR-93转染以后增加的基因不会表现出这样的富集。图19a显示了使用mRNA阵列或RT-qPCR分析导入miR-93以后的相对Tgfbr2mRNA水平。图19b显示了在导入miR-25、miR-93或miR-106b以后的相对mRNA水平。图20显示了 MEF富集的微RNA、miR_21和miR_29a的抑制会提高iPS细胞重新程序化效率。图20a表明，miR-29a、miR-21和let7a在MEF中高度表达。从0ct4_EGFP MEF和小鼠ES细胞中分离出总RNA，并通过凝胶电泳来分辨。使用针对指示的miRNA的特异性的放射性标记的探针来检测信号。U6snRNA充当加载对照。图20b表明，miRNA抑制会提高重新程序化效率。用OSKM转导0ct4-EGFP MEF。在转导后第14天，通过荧光显微术鉴定和计数GFP阳性的集落。将GFP+集落数针对抗miR非靶向对照处理的数目标准化，并报告为倍数变化。误差棒代表3个独立实验的标准差。* p值〈O. 05。图21表明，c-Myc在重新程序化过程中是MEF富集的miRNA的主要阻抑物。图21a显示了在重新程序化后第5天时选定的miRNA的RNA印迹分析。用指示的单一因子或重新程序化因子的不同组合转导0ct4-EGFP MEF。1F，1种因子；2F，2种因子；3F，3种因子；OSKM :0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc。U6用作加载对照RNA。来自胚胎干细胞(ES)的总RNA充当MEF和转导的细胞的阴性对照。使用不同的探针来检测特定miRNA，如在右侧所指示的。MiR-291印迹是ES RNA的阳性对照。图21b显示了在有不同的重新程序化因子存在下miRNA表达的定量表示。将信号强度针对U6snRNA的强度标准化。将表达比率计算为每种miRNA的表达相对于在MEF中的表达(将其独断地设定为100%)的百分比。定量不同的miRNA (从图A)，并指示在右侧。图21c显示了在OSK-或OSKM-重新程序化以后的不同时间点，在0ct4_EGFP MEF 中的选定的miRNA的实时RT-PCR分析。在转导后指定的天(D)，分离出RNA，用于实时RT-PCR分析。将信号针对U6标准化，并显示为在MEF中表达的miRNA (将其独断地设定为100)的百分比。误差棒代表2个独立实验的标准差。图22表明，miR-21或miR-29a的抑制会增强iPS细胞重新程序化，这通过降低p53蛋白水平以及增量调节p85 a和⑶C42途径来实现。图22a显示了在不同miRNA的抑制以后，P53、⑶C42和p85a的表达的蛋白印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染IXlO5个0ct4-EGFP MEF。在5天后，收获细胞，并进行分析。图22b显示了在有指示的miR抑制剂存在下，蛋白表达的定量表示。将信号强度针对GAPDH强度标准化，并显示为相对于在对照(NT)细胞中的表达(将其独断地设定为100)的百分比。误差棒显示了至少3个独立实验的标准差。*p值〈O. 05。图22c显示了在不同的miRNA和OSKM转导的抑制以后，p53、⑶C42和p85 a表达的免疫印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染IXlO5个0ct4-EGFP MEF。在5天后，收获细胞，并通过免疫印迹进行分析。如在(B)中所述标准化信号强度。误差棒显示了至少3个独立实验的标准差。吨值〈0.05。图22d表明，耗竭miR-29a或p53会提高重新程序化效率。用指示的siRNA和miRNA抑制剂以及OSKM重新程序化因子转染4X104个0ct4_EGFP MEF。在转导后第12天，计数GFP阳性的细胞。误差棒显示了至少3个独立实验的标准差。*p值〈O.05。图23表明，耗竭miR-21和miR_29a会促进重新程序化效率，这通过减量调节ERKI/2途径来实现。图23a显示了在抑制MEF中的不同miRNA以后，磷酸化的和总的ERK1/2的蛋白印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染IXlO5个0ct4-EGFP MEF，在5天后收获，并进行免疫印迹。将信号强度针对肌动蛋白标准化，并显示为相对于抗miR NT对照表达的百分比。误差棒显示了 3个独立实验的标准差。*p值〈O. 05; p值〈O. 005。图23b表明，耗竭miR-21和miR-29a会增加Spryl蛋白水平。显示了 Spryl表达比率的蛋白印迹分析。用指示的不同miRNA抑制剂转染MEF。在转染后第5天收获细胞，用于蛋白印迹分析。将信号强度针对肌动蛋白标准化，并显示为图23a所示。误差棒代表3个独立实验的标准差。邮值〈0.05; p 值〈O. 005。图23c显示了在ERK1/2或GSK3 ^敲除以后，重新程序化效率的倍数变化。用指示的siRNA以及OSKM转染4X104个0ct4_EGFP MEF。在2周后计数GFP阳性的细胞。使用SiNT的转染充当重新程序化效率的对照。误差棒指示3个独立实验的标准差。* * p值〈0.005。图23d显示了在抑制MEF中的不同miRNA以后，磷酸化的和总的GSK-3P的蛋白印迹分析。用指示的miRNA抑制剂转染IXlO5个0ct4-EGFP MEF,在5天后收获，并通过免疫印迹进行分析。如在图23a中所述，标准化信号强度。误差棒显示了 3个独立实验的标准差。图24显示的示意图说明，c-Myc会增强重新程序化，这通过减量调节MEF-富集的mi RNA, miR-21和miR_29a来实现。p53和ERK1/2途径的功能是作为重新程序化的屏障，且miR-21和miR-29a会通过减量调节⑶C42、p85 a和Spryl来间接地活化那些途径。也显示了 miR-21/p53和miR-29a/ERKl/2途径之间的串扰。c_Myc会抑制这些miRNA的表达，并接着危害ERK1/2和p53的诱导。虚线指示p53和ERK1/2对iPS重新程序化的影响。图25显示了 miR-21的抑制会增强OSK的iPS细胞重新程序化。在用OSK进行重 新程序化的过程中，将miRNA的抑制剂导入0ct4-MEF中。在转导后的不同时间点，计数GFP阳性的集落。误差棒代表2个独立实验的标准差。图26表明，miRNA的抑制不会改变重新程序化过程中的细胞凋亡或增殖速率。图26a表明，在用OSKM进行重新程序化的过程中，将miRNA的抑制剂导入0ct4_MEF中。在转导后8、天，收集细胞。使用PE膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I (BD Pharmingen ;目录号559763)和7-氨基-放线菌素(7-AAD)，评价细胞凋亡。通过FACS，检测信号。误差棒代表3个独立实验的标准差。图26b表明，在用OSKM进行重新程序化的过程中，将miRNA的抑制剂导入0ct4-MEF中。在转导后8、天，收集细胞。在收集前I天，使用Click-iT Edu成像试剂盒(Invitrogen ；目录号C10337),用5-乙炔基_2’ -脱氧尿苷(Edu)处理细胞。通过FACS，检测信号。误差棒代表3个独立实验的标准差。
具体实施例方式本发明是基于在iPSC诱导中涉及的关键调节机制的发现。一个关键方面是，细胞微RNA与iPSC的诱导之间的连接的发现。这得到下述观察结果的证实即关键微RNA途径蛋白的敲除对微RNA生源说机制的干扰可以导致重新程序化效率的显著降低。具体地，揭示了至少3个微RNA簇miR-17 92、106b 25和106a 363，它们在重新程序化的早期被高度地诱导。具有非常类似的种子区的几种微RNA(诸如miR-93和miR_106b)极大地增强iPSC诱导，这通过靶向P21表达、允许被驱动的克隆达到完全重新程序化的状态来实现。本发明证实，微RNA可以在iPSC诱导中直接起作用，并且微RNA生源说机制的干扰会显著降低重新程序化效率。本发明提供了 3个微RNA簇miR-17、2、miR-106b^25和miR-106a 363，它们在重新程序化的早期被高度地诱导。功能分析证实，将这些微RNA导入MEF中增强了 0ct4-GFP+iPSC集落形成。本发明也证实，Tgfbr2和p21 (它们二者都抑制重新程序化)被这些微RNA直接地靶向，并且阻断它们的活性显著降低了重新程序化效率。本发明证实，miR-93和miR-106b是重新程序化活性的关键调节剂。在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所述的具体组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意进行限制，因为本发明的范围仅由所附的权利要求书限定。如在本说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，提及的“所述方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，它们在本领域技术人员阅读本公开内容以后显而易见，诸如此类。除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似的或等效的任意方法和材料可以用于实践或测试本发明，现在描述优选的方法和材料。如本文所讨论的，微RNA参与重新程序化过程和iPSC诱导效率的发现，导致通过操纵这些微RNA在细胞中的水平来极大地提高iPSC诱导效率的能力。因此，本发明提供了一种产生iPS细胞的方法，所述方法与已知方法相比具有提高的诱导效率。所述方法包括 使体细胞接触细胞核重新程序化因子和改变所述细胞内的微RNA水平或活性的试剂，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。本发明也基于直接地参与重新程序化过程和iPSC诱导效率的调节蛋白的发现。一种这样的蛋白是P21，即一种具有仅165个氨基酸的小蛋白，其长期以来已知为癌症发展过程中的肿瘤抑制剂，其通过造成P53依赖性的Gl生长停滞和促进分化和细胞衰老来起作用。在本文中已经证实，在iPSC诱导过程中微RNA对p21表达的抑制会提高诱导效率。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种通过使体细胞接触细胞核重新程序化因子和P21表达或活性的抑制剂而产生iPS细胞的方法。鉴于RNA在iPSC的产生中的调节性参与，预见到，使用除了细胞核重新程序化因子以外的调节RNA水平的试剂，可能发生诱导。因此，本发明提供了一种通过使体细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的试剂而制备诱导的多能干(iPS)细胞的方法，其中所述试剂诱导体细胞的多能性，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。在不同的实施方案中，所述RNA是非编码RNA (11(^嫩)，诸如微1^八。在不同的实施方案中，可以使用一种或多种细胞核重新程序化因子来诱导分化的细胞的重新程序化，无需使用卵、胚胎或ES细胞。通过在诱导过程中使用改变所述细胞内的微RNA水平或活性的试剂，会提高诱导过程的效率。所述方法可以用于方便地且高度再现地建立诱导的多能干细胞，所述干细胞具有与ES细胞类似的多能性和生长能力。例如，可以如下将细胞核重新程序化因子导入细胞中与包含编码RNA分子(诸如微RNA)的多核苷酸的重组载体一起，用包含编码细胞核重新程序化因子的基因的重组载体转导所述细胞。因此，所述细胞可以表达细胞核重新程序化因子(其作为在重组载体中含有的基因的产物而进行表达)以及表达所述微RNA (其作为在重组载体中含有的多核苷酸的产物而进行表达)，从而与使用单独的细胞核重新程序化因子相比以提高的效率诱导分化的细胞的重新程序化。本文使用的多能细胞包括这样的细胞其具有在体外长时间(大于I年)分裂的潜力，且具有分化成源自所有3个胚胎胚层(包括内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的独特能力。与本发明一起使用的体细胞可以是原代细胞或永生化细胞。这样的细胞可以是原代细胞(未永生化细胞)，诸如从动物新鲜分离的那些，或可以源自细胞系(永生化细胞)。在一个示例性的方面，所述体细胞是哺乳动物细胞，例如，人细胞或小鼠细胞。它们可以通过众所周知的方法从不同的器官(例如，但不限于皮肤、肺、胰腺、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道及其它泌尿器官)得到，或通常从含有活的体细胞的任意器官或组织得至IJ。可用于本发明中的哺乳动物体细胞包括作为实例，成年干细胞、塞尔托利细胞、内皮细胞、粒膜上皮细胞、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞( B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cel I)、成纤维细胞、心肌细胞、其它已知的肌细胞和通常的任意活的体细胞。在具体实施方案中，使用成纤维细胞。本文使用的术语“体细胞”也意图包括成年干细胞。成年干细胞是能够产生特定组织的所有细胞类型的细胞。示例性的成年干细胞包括造血干细胞、神经干细胞和间质干细胞。本文使用的重新程序化意在表示，改变或逆转部分地或终末地分化的体细胞的分化状态的过程。体细胞的重新程序化可以是体细胞的分化状态的部分或完全逆转。在一个示例性的方面，重新程序化是完全的，其中体细胞被重新程序化成诱导的多能干细胞。但是，重新程序化可以是部分的，诸如逆转至任何更低分化的状态。例如，将终末地分化的细胞逆转成更低分化状态的细胞，诸如多能细胞。在本发明的不同方面，细胞核重新程序化因子是这样的基因其诱导多能性，并用于将分化的或半分化的细胞重新程序化成比起始细胞更原始的表型，诸如多能干细胞的表型。这样的基因与改变所述细胞中的微RNA水平或活性和/或抑制p21表达或活性的试剂一起使用，以提高诱导效率。在已经整合进体细胞的基因组中的一个或多个这样的基因表达以后，这样的基因和试剂能够从体细胞产生多能干细胞。本文使用的“诱导多能性的基因”意图表示这样的基因其与多能性有关，且能够产生更低分化的细胞，诸如在所述基因的整合和表达以后从体细胞产生的多能干细胞。多能性基因的表达通常限于多能干细胞，且对于多能干细胞的功能同一性而言是至关重要的。本领域技术人员会理解，改变细胞中微RNA的水平或活性或者抑制p21表达或活性的试剂包括多种不同类型的分子。可用于本发明的任意方法中的试剂可以是任意类型的分子，例如，多核苷酸、肽、肽拟似物、类肽诸如插烯类肽(vinylogous peptoid)、化学化合物诸如有机分子或小有机分子等。因此，在一个方面，用于本发明的方法中的试剂是多核苷酸，诸如反义寡核苷酸或RNA分子。在不同的方面，所述试剂可以是多核苷酸，诸如反义寡核苷酸或RNA分子，诸如微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA和shRNA。在示例性的方面，所述试剂是这样的微RNA :其被导入所述细胞中，从而增加细胞中的微RNA的水平和活性和/或抑制p210微RNA (miRNA)是调节基因表达的单链RNA分子。miRNA由基因编码，它们从所述基因的DNA转录而成,但是miRNA不翻译成蛋白；作为替代，每种前转录物(pri_miRNA)被加工成短茎-环结构，称作pre-miRNA，并最终加工成有功能的miRNA。成熟的miRNA分子与一种或多种信使RNA (mRNA)分子完全地或部分地互补，它们的主要功能是减量调节基因表达。微RNA可以由独立的基因编码，但是也可以从多种不同的RNA种类(包括内含子、mRNA的3’ UTR、长非编码RNA、snoRNA和转座子)加工(经由酶Dicer)而成。本文使用的微RNA也包括“拟”微RNA,这意图表示这样的微RNA :其被外源地导入细胞中，具有与它们的内源相似物相同或基本上相同的功能。因而，尽管本领域技术人员会理解，试剂可以是外源地导入的RNA，试剂也包括增加或减少微RNA在细胞中的表达的化合物等。在不同的方面，所述微RNA可以是这样的微RNA:其被包括在簇中，所述簇在诱导iPSC或其分化的过程中表现出活性或表达的增加或减少。在一个方面，所述微RNA可以是下述中的一种或多种微 RNA :miR-17、miR-25、miR_106a 或 miR_302b 簇，诸如 miR-93、miR-106b或它们的任意组合。经证实，miR-17 92、miR_106b 25和miR_106a 363簇的诱导对于适当重新程序化而言是重要的。这样的微RNA似乎会降低在该过程中的重新程序化屏障，并因此可以操纵这些微RNA在细胞中的水平，以提高重新程序化效率。也可以操纵微RNA来指导iPSC的分化，因为微RNA被证实是重要的调节分子。在本文中鉴定出在iPSC诱导过程中被诱导的3个微RNA簇，并且已经确定，在这些簇内的几种微RNA具有相同的核苷酸种子区序列，这指示它们靶向类似的mRNA 。还已经确定，这样的共有相同种子区的核苷酸序列的微RNA会增强iPSC诱导，并同时减少p21表达。因而，在一个方面，所述微RNA具有包含SEQ ID NO: I (5’-AAGUGC-3’)的多核苷酸序列，已经确定该序列在不同的微RNA (例如，SEQ ID N0:2-ll的那些)之间是保守的。因而，在一个有关的方面，所述微RNA具有SEQ ID NO:2-11中的任一个的核苷酸序列。术语“小干扰RNA”和“siRNA”也在本文中用于表示短干扰RNA或沉默RNA，它们是一类起多种生物学作用的短的双链RNA分子。最值得注意的是，siRNA涉入RNA干扰(RNAi )途径，其中所述siRNA干扰特定基因的表达。除了它们在RNAi途径中的作用以外，siRNA也在RNAi相关途径中起作用(例如，作为抗病毒机制，或在使基因组的染色质结构成形中)。本发明的多核苷酸(诸如反义寡核苷酸和RNA分子)可以具有任意合适的长度。例如，本领域技术人员会理解要用于调节基因表达的反义寡核苷酸或RNA分子适用何种长度。这样的分子的长度通常是约5至100、5至50、5至45、5至40、5至35、5至30、5至25、5至20或10至20个核苷酸。例如，所述分子的长度可以是约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45 或 50 个核苷酸。这样的多核苷酸可以包括至少约15个至超过约120个核苷酸，包括至少约16个核苷酸、至少约17个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约19个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约21个核苷酸、至少约22个核苷酸、至少约23个核苷酸、至少约24个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约26个核苷酸、至少约27个核苷酸、至少约28个核苷酸、至少约29个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约55个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约65个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约85个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约95个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约Iio个核苷酸、至少约120个核苷酸或大于120个核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”在本文中用于泛指，通过磷酸二酯键连接到一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。这样，这些术语包括RNA和DNA，它们可以是一个基因或其一部分、cDNA、合成的聚脱氧核糖核酸序列等，而且可以是单链或者双链，也可以是DNA/RNA杂交分子。此外，本文使用的术语包括天然存在的核酸分子，它们可以从细胞中分离，也包括合成的多核苷酸，它们可以诸如通过化学合成方法或者通过酶学方法(如通过聚合酶链式反应(PCR))来制备。应当认识到，所用的不同术语仅仅是为了讨论的方便，诸如为了区分组合物的不同组分。
一般而言，组成多核苷酸的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸，诸如连接到2’ -脱氧核糖上的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或者核糖核苷酸，诸如连接到核糖上的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，根据用途，多核苷酸还可以含有核苷酸类似物，包括非天然存在的合成的核苷酸或修饰的天然存在的核苷酸。核苷酸类似物是本领域众所周知的且可商业得到的，含有这样的核苷酸类似物的多核苷酸也是如此。多核苷酸中连接核苷酸的共价键通常是磷酸二酯键。然而，根据多核苷酸要应用的目的，所述共价键也可以是众多其它键中的任一种，包括硫代二酯键、硫代磷酸酯键、肽样键或者本领域技术人员已知可用于连接核苷酸以产生合成的多核苷酸的任何其它键。含有天然存在的核苷酸和磷酸二酯键的多核苷酸或寡核苷酸可以化学合成，或者可以利用适当的多核苷酸作为模板使用重组DNA方法来产生。与此相比，含有核苷酸类似物或者非磷酸二酯键的共价键的多核苷酸通常化学合成，尽管诸如17聚合酶等酶也可以将某些类型的核苷酸类似物掺入多核苷酸中，并因此可以用于从合适的模板重组地产生这样的多核苷酸。在不同的实施方案中，反义寡核苷酸或RNA分子包括含有修饰的寡核苷酸。多种 修饰是本领域已知的，且被预见到用于本发明中。例如，预见到含有修饰的主链或非天然的核苷间连接的寡核苷酸。本文使用的具有修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子的那些以及在主链中没有磷原子的那些。为了本说明书的目的，而且有时候在本领域内参考，在其核苷间主链中没有磷原子的经修饰的寡核苷酸也可认为是寡核苷。在不同的方面，经修饰的寡核苷酸主链包括，例如，具有正常的3’-5’连接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’ -亚烷基膦酸酯、5’ -亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’ _氣基氣基憐酸酷和氣基烧基氣基憐酸酷)、硫擬氣基憐酸酷、硫擬烧基勝酸酷、硫擬烧基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，它们的2’-5’连接的类似物，及具有反向极性的那些，其中一个或多个核苷酸间连接是3'到3'、5'到5'、或2'到2'连接。具有反向极性的某些寡核苷酸包含在最3'端核苷酸间连接处的单个3'到3'连接，即可以是无碱基(核苷碱基缺失，或以羟基替代)的单一反向核苷残基。多种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。在不同的方面，其中不含磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有通过下述核苷间连接形成的主链短链烷基或环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子的或杂环的核苷间连接。这些包括具有吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它主链。在不同的方面，核苷酸单元的寡核苷酸模拟物(糖和核苷间连接，即主链)被新基团替代。保持碱基单元以与适宜的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物(即已显示出具有卓越杂交特性的寡核苷酸模拟物)称为肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链(特别是氨基乙基甘氨酸主链)替代。核苷碱基得到保留，并直接地或间接地结合主链的酰胺部分的氮杂氮原子。在不同的方面，寡核苷酸可以包括硫代磷酸酯主链和具有杂原子主链的寡核苷。经修饰的寡核苷酸还可以含有一个或多个被取代的糖部分。在有些实施方案中，寡核苷酸包含在2’位置处的如下之一 0H;F;0-、S-或N-烷基；0_、S-或N-稀基；0-、S-或N-块基；或O-烧基-0-烧基，其中所述烧基、稀基和块基可以是取代的或未取代的C1至Cltl烷基或C2至Cltl烯基和炔基。特别优选的是0[ (CH2)n0]mCH3、0 (CH2) n0CH3、0 (CH2) nNH2、0 (CH2) nCH3、0 (CH2) n0NH2 和 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3) ] 2，其中 n 和 m 是 I至约10。其它优选的寡核苷酸包含在2’位置处的如下之一C1至Cltl低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3>OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烧基、杂环烧芳基、氣基烧基氣基、聚烧基氣基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于提高寡核苷酸的药效动力学性质的基团以及具有相似性质的其它取代基。另一种修饰包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ OCH2CH2OCH3,也称作’ _0_(2_甲氧基乙基)或2’ -M0E)。在有关的方面，本发明包括使用锁定的核酸(LNA)来产生对靶多核苷酸具有增强的亲和力和特异性的反义核酸。LNA是这样的核酸其中2’-羟基与糖环的3’或4’碳原子相连，从而形成二环糖部分。所述连接优选地是桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(methelyne) (-CH2_)n 基团，其中 n 是 I 或 2。
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其它修饰包括2’ -甲氧基(2’ -0-CH3)、2’ -氛基丙氧基(2’ -OCH2CH2CH2NH2)、2’ -稀丙基(2’ -CH-CH-CH2)、2’ -0-稀丙基(2’ -O-CH2-CH-CH2)、2’ -氣(2’-F)、2’ -氛基、2’-硫代、2’-0甲基、2’-甲氧基甲基、2’-丙基等。2'-修饰可以是在阿拉伯糖(arabino)(上)位或核糖(ribo)(下)位。一种优选的2'-阿拉伯糖修饰是2' -F。也可在寡核苷酸上的其它位置进行类似的修饰，特别是3'末端核苷酸的糖上的3'位置或在2' -5'连接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，诸如用环丁基部分替代呋喃戊糖基糖。寡核苷酸还可以包括核苷碱基修饰或取代。本文使用的“未修饰的”或“天然的”核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核苷碱基包括其它合成的和天然的核苷碱基诸如5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它修饰的核苷碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(IH-嘧啶并[5，4-b] [I, 4]苯并噁嗪-n-2(3H)_酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4_b] [I, 4]苯并噻嗪-2 (3H)-酮)、G-夹子(G-clamp)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9- (2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b] [1，4]苯并噁嗪_2(3H)_酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5_b]吲哚_2_酮)、吡I啶并吲哚胞苷(H-嘧啶并[3，，2’ -A, 5]吡咯并[2，3-d]嘧啶_2_酮)。经修饰的核苷碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环(例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮)替代的那些核苷碱基。其它核苷碱基是本领域已知的。这些核苷碱基中的某些特别适用于提高本文所述的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证实，5-甲基胞嘧啶取代会将核酸双链体稳定性提高0. 6-1. 2C，而且是目前优选的碱基取代，甚至更具体地当与2’ -0-甲氧基乙基糖修饰组合时。本文所述的反义寡核苷酸的另一种修饰包括给寡核苷酸化学地连接一个或多个部分或缀合物，所述部分或缀合物会增强所述寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。反义寡核苷酸可包括与官能团(诸如伯羟基或仲羟基)共价结合的缀合物基团。缀合物基团包括嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚体的药效动力学性质的基团、以及提高寡聚体的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的上下文中，提高药效动力学性质的基团包括提高寡聚体摄取、增强寡聚体对降解的抗性和/或增强与RNA的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，提高药代动力学性质的基团包括提 高寡聚体摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分包括、但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分、胆酸，硫醚，例如，己基-5-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇，脂族链，例如，十二烷二醇或十一基残基，磷脂，例如，双十六烷基-消旋-甘油或1，2- 二 -0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵，聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷醋酸、棕榈基部分、或十八基胺或己基氨基羰氧基胆固醇部分。已经发现几个基因与多能性有关，且适用于本发明中作为重新程序化因子。这样的基因是本领域已知的，包括作为实例，SOX家族基因(S0X1、S0X2、S0X3、S0X15、S0X18)、KLF 家族基因(KLF1、KLF2、KLF4、KLF5)、MYC 家族基因(C-MYC、L-MYC、N_MYC)、SALL4、0CT4、NANOG, LIN28、STELLA、NOBOX或STAT家族基因。STAT家族成员可以包括例如STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5 (STAT5A 和 STAT5B)和 STAT6。尽管在某些情况下，可能使用仅一个基因来诱导多能性，一般而言，需要表达超过一个基因来诱导多能性。例如，可以将2、3、4或更多个基因作为多顺反子构建体同时掺入体细胞基因组中，以允许这样的基因的同时表达。在一个示例性的方面，使用4个基因来诱导多能性，包括0CT4、S0X2、KLF4和C-MYC0在美国专利申请号10/997，146和美国专利申请号12/289,873 (通过引用并入本文)中公开了其它基因，已知它们是适用于本发明的重新程序化因子。所有这些基因通常存在于哺乳动物(包括人)中，因而，来自任意哺乳动物的同系物可以用于本发明中，诸如源自包括、但不限于小鼠、大鼠、牛、羊、马和猿等哺乳动物的基因。另外，除了野生型基因产物以外，也可以使用突变型基因产物，其包括几个(例如，I至10、I至6、I至4、I至3和I或2个)氨基酸的置换、插入和/或缺失，并具有与野生型基因产物类似的功能。此外，因子的组合不限于使用野生型基因或基因产物。例如，可以使用Myc嵌合体或其它Myc变体来替代野生型Myc。本发明不限于细胞核重新程序化因子的任何具体组合。如在本文中所讨论的，细胞核重新程序化因子可以包括一种或多种基因产物。细胞核重新程序化因子也可以包括本文讨论的基因产物的组合。每种细胞核重新程序化因子可以单独使用，或与本文公开的其它细胞核重新程序化因子组合使用。另外，可以通过筛选方法来鉴定本发明的细胞核重新程序化因子，例如，如美国专利申请号10/997，146所讨论的，它通过引用并入本文。另外，本发明的细胞核重新程序化因子可以含有一种或多种与分化、发育、增殖等有关的因子、和具有其它生理活性的因子以及可以起细胞核重新程序化因子的功能的其它基因产物。所述细胞核重新程序化因子可以包括蛋白或肽。所述蛋白可以从本文所讨论的基因产生，或者，以与所述蛋白与另一种蛋白、肽等的融合基因产物的形式生成。所述蛋白或肽可以是荧光蛋白和/或融合蛋白。例如，也可以使用具有绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白或具有肽(诸如组氨酸标签)的融合基因产物。另外，通过制备和使用具有源自HIV病毒的TAT肽的融合蛋白，可以促进细胞核重新程序化因子穿过细胞膜的细胞内摄取，从而仅通过将所述融合蛋白加入培养基中来实现重新程序化的诱导，因而避免了复杂的操作诸如基因转导。由于这样的融合基因产物的制备方法是本领域技术人员众所周知的，技术人员可以根据目的容易地设计和制备适当的融合基因产物。如本文所讨论的，通过使体细胞接触与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂相组合的细胞核重新程序化因子，可以诱导iPSC。本领域技术人员会理解，通过本领域已知的任意合适的方法，可以进行向体细胞的递送。在一个方面，使用 包含编码细胞核重新程序化因子的基因的重组载体，可以将细胞核重新程序化因子导入细胞中。类似地，使用包含编码RNA分子(诸如微RNA、shRNA、反义寡核苷酸等)的多核苷酸的重组载体，可以将改变微RNA的试剂导入细胞中。类似地，使用包含编码肽抑制剂或RNA分子(诸如微RNA、shRNA、反义寡核苷酸等)的多核苷酸的重组载体，可以将p21的抑制剂导入细胞中。因此，所述细胞可以表达细胞核重新程序化因子(其作为在重组载体中含有的基因的产物而进行表达)以及表达试剂或P21抑制剂(其作为在重组载体中含有的多核苷酸的产物而进行表达)，从而与使用单独的细胞核重新程序化因子相比以提高的效率诱导分化的细胞的重新程序化。使用多种众所周知的技术，诸如基于非病毒的细胞转染，可以将本发明的核酸构建体(诸如重组载体)导入细胞中。在一个示例性的方面，将所述构建体掺入载体中，并导入细胞中，以允许表达所述构建体。通过本领域已知的任意基于病毒的或非病毒的转染，可以导入细胞中，所述转染是例如，但不限于，电穿孔、磷酸钙介导的转移、核转染、声致穿孔、热激、磁转染、脂质体介导的转移、显微注射、微射弹介导的转移(纳米颗粒)、阳离子型聚合物介导的转移(DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(PEG)等)或细胞融合。其它转染方法包括专有的转染试剂诸如 Lipofectamine 、Dojindo Hilymax 、Fugene 、jetPEI 、EfTectene11^P DreamFect 。在其它方面，通过本领域已知的任意方法，可以在诱导过程中使体细胞接触与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂相组合的细胞核重新程序化因子。例如，跨细胞膜直接递送蛋白、RNA分子等。与使用单独的重新程序化因子相比，与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂组合地使用细胞核重新程序化因子会提高诱导效率。在不同的方面，与常规方法相比，诱导效率可以提高 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400或甚至500%。例如，诱导效率可以高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或50% (例如，诱导的细胞相对于起始体细胞的总数的百分比)。在诱导过程中，可以在使体细胞接触改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21的抑制剂的同时或之前，使所述细胞接触细胞核重新程序化因子。在不同的方面，在使体细胞接触任意其它试剂或抑制剂之前约1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，使所述细胞接触重新程序化因子。在一个示例性的方面，在使体细胞接触任意其它试剂或抑制剂之前约1、2、3、4或5天，使所述细胞接触重新程序化因子。可以进行其它分析，以评估重新程序化的细胞的多能性特征。可以分析所述细胞的不同的生长特征和胚胎干细胞样形态学。例如，通过加入已知会驱动分化成特定细胞类型的某些生长因子，可以在体外分化细胞。能够仅形成身体的少数细胞类型的重新程序化细胞是多能的(multipotent)，而能够仅形成身体的任意细胞类型的重新程序化细胞是多能的(pluripotent)。也可以进行重新程序化的体细胞的表达绘谱分析(Expressionprofiling),以评估它们的多能性特征。也可以检查与多能性有关的单个基因的表达。另外，可以分析胚胎干细胞表面标志物的表达。本领域已知的与多能干细胞有关的多种基因的检测和分析，可以包括下述基因的分析例如，但不限于，0CT4、NANOG, SALL4、SSEA-U SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81或它们的组合。iPS细胞可以表达任意数目的多能细胞标志物，包括碱性磷酸酶(AP);ABCG2 ;时期特异性的胚胎抗原-I (SSEA-I) ；SSEA-3 ;SSEA_4 ；TRA-l-60 ； TRA-1-81 ；Tra-2-49/6E ；ERas/ECAT5, E-钙粘着蛋白；^ -微管蛋白 III ; a -平滑肌肌动蛋白(a-SMA);成纤维细胞生长因子4 (FGF4)，Cripto，Daxl ;锌指蛋白296 (Zfp296)；N-乙酰基转移酶-I (Natl) ；ES 细胞有关的转录物 I (ECATl) ;ESG1/DPPA5/ECAT2 ；ECAT3 ；ECAT6 ；ECAT7 ；ECAT8 ；ECAT9 ；ECAT10 ；ECAT15-1 ；ECAT15-2 ；Fthll7 ；Sall4 ;未分化的胚胎细胞转录因子(Utfl) ；Rexl ；p53 ;G3H)H;端粒末端转移酶，包括TERT ;沉默的X染色体基因；Dnmt3a ；Dnmt3b ；TRIM28 ;含有 F-框的蛋白 15 (Fbxl5) ；Nanog/ECAT4 ；0ct3/4 ；Sox2 ；Klf4 ；c-Myc ；Esrrb ；TDGFI ；GABRB3 ；Zfp42, FoxD3 ；CYP25A1 ;发育多能性相关的 2(DPPA2);T-细胞淋巴瘤断点I (Tell) ;DPPA3/Stella ；DPPA4 ;以及多能性的其它一般标志物，例如在诱导过程中用于重新程序化细胞的任意基因。通过诱导出iPS细胞的分化细胞特有的标志物的减量调节，也可以表征IPS细胞。本发明另外提供了使用本文所述的方法产生的iPS细胞以及这种细胞的群体。本发明的能够分化成多种细胞类型的重新程序化的细胞具有多种应用和治疗用途。干细胞的基本性质(无限自我更新的能力和分化成体内的每种细胞类型的能力)使得它们对于治疗用途而目是理想的。因此，在一个方面，本发明另外提供了一种治疗或预防受试者的障碍和/或病症的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的诱导的多能干细胞。所述方法包括从受试者得到体细胞，以及使用本文所述的方法，将所述体细胞重新程序化成诱导的多能干(iPS)细胞。然后在适合使所述细胞分化成适用于治疗所述病症的所需细胞类型的条件下，培养所述细胞。然后可以将分化的细胞导入所述受试者中，以治疗或预防所述病症。在一个方面，可以如下在体外分化使用本文所述的方法生产的iPS细胞以及这种细胞的群体通过用改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂处理或接触所述细胞。由于微RNA已经被鉴别为iPSC诱导中的关键调节剂，预期单个微RNA或微RNA群体的操纵可以用于指导这样的iPSC的分化。这样的处理可以与本领域通常已知会驱动分化成特定细胞类型的生长因子或其它试剂和刺激物组合使用。本发明的一个优点是，它会提供适用于移植的同基因的或同源的人细胞的基本上无限的供给。针对患者特异性地定制iPS细胞，从而避免免疫排斥。因此，会避免与当前的移植方法有关的重大问题，例如，因为宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而可能发生的移植组织排斥。几类iPS细胞或从iPS细胞(来自源自健康人的体细胞)制备的完全分化的体细胞可以储存在iPS细胞库中作为细胞文库，所述文库中的一类或几类iPS细胞可以用于制备患者不会排斥的体细胞、组织或器官，用于进行干细胞治疗。通过本领域已知的方法，可以使本发明的iPS细胞分化成许多不同的细胞类型，以治疗多种障碍。例如，可以诱导iPS细胞，以分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、泌尿道细胞、神经元细胞等。然后可以将分化的细胞移植回患者体内，以预防或治疗病症。因而，本发明的方法可以用于治疗具有下述病症的受试者心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血、外周血管病、酒精性肝病、硬化、帕金森病、阿尔茨海默氏病、糖尿病、癌症、关节炎、伤口愈合、免疫缺陷、再生障碍性贫血、贫血、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、溶酶体贮存疾病、多发性硬化、脊髓损伤、遗传障碍和类似的疾病，其中特定细胞类型/组织或细胞去分化的增加或替换是合乎需要的。在不同的实施方案中，与对应的未处理的对照组织或器官相比，所述方法会使组织或器官的细胞数目增加至少约5%、10%、25%、50%、75%或更多。在另一个实施方案中，与对 应的未处理的对照组织或器官相比，所述方法会使组织或器官的生物活性增加至少约5%、10%、25%、50%、75%或更多。在另一个实施方案中，与对应的未处理的对照组织或器官相比，所述方法会使组织或器官中的血管形成增加至少约5%、10%、25%、50%、75%或更多。在另一个实施方案中，将所述细胞直接地施用于受试者的需要增加细胞数目的部位。本发明另外提供了一种用于使用通过本文所述的方法得到的不同细胞而评价试剂、化合物、药剂、毒物等的生理功能或毒性的方法。通过4种转录因子0ct4、Sox2、Klf4和cMyc的异位表达,可以将体细胞重新程序化至ES-样状态，以建立诱导的多能干细胞(iPSC)。本发明证实，细胞微RNA会调节iPSC产生。关键性的微RNA途径蛋白的敲除可以导致重新程序化效率的显著降低。经证实，3个微RNA簇miR-17 92、106b 25和106a 363在重新程序化早期被高度地诱导。具有非常类似的种子区的几种微RNA (包括miR-93和miR_106b)极大地增强了 iPSC诱导，抑制这些微RNA显著降低了重新程序化效率。此外，miR-iPSC克隆可以达到完全重新程序化的状态。本发明证实，这些微RNA直接地靶向Tgfbr2和p21，这2个基因的siRNA敲除实际上增强了 iPSC诱导。本发明也证实，miR-93和它的家族成员直接地靶向TGF-P受体II，以增强iPSC重新程序化。本发明证实，微RNA在重新程序化过程中起作用，通过调节细胞中的微RNA水平，可以极大地提高iPSC诱导效率。尽管诱导的多能干细胞(iPSC)对于定制再生药物而言具有巨大前景，重新程序化的分子基础在很大程度上不明。克服维持细胞同一性的屏障，是分化的细胞的重新程序化中的关键步骤。因为微RNA (miRNA)组织特异性地调节靶基因，本发明证实，不同的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)-富集的miRNA会在转录后调节起重新程序化屏障功能的蛋白。抑制这些miRNA会影响细胞信号传递，以降低那些屏障。本发明证实，耗竭miR-21和miR_29a会提高MEF中的重新程序化效率。本发明证实，p53和ERK1/2途径受miR-21和miR_29a调节，并在重新程序化中起作用。本发明另外证实，c-Myc会增强重新程序化，这部分地通过抑制MEF-富集的miRNA诸如miR-21和miR_29a实现。本发明提供了在调节iPSC重新程序化所涉及的多个信号传递网络中起作用的miRNA。
作为4种重新程序化因子(4F:0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)之一的C-Myc，在细胞增殖和肿瘤发展中起重要作用。C-Myc是细胞郁滞和细胞凋亡的关键调节剂，其通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(⑶K)抑制剂p21eipl来起作用。通过废除Miz-I功能和抑制pl5INK4b，c-Myc在原代细胞的永生化中起关键作用。c-Myc的许多转录功能需要与Max或Miz-I协作。作为原癌基因，c-Myc会极大地提高重新程序化效率，尽管它对于重新程序化而言是非必需的。因此，确定在重新程序化过程中位于c-Myc下游的分子途径，可以增强iPS细胞的治疗应用，而不危害重新程序化效率。在D13. 5，从小鼠衍生出0ct4_GFP小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，所述小鼠携带位于pou5fl (Jackson lab, Stock#008214)的终止密码子下游的IRES-EGFP融合盒。在含有10%FBS (Invitrogen) + 谷氨酰胺和 NEAA 的 DMEM (Invitrogen, 11995-065)中，培养这些MEF0对于iPSC诱导，仅使用在0至4代的MEF。据报道，C-Myc起维持ES细胞更新的作用，这部分地通过调节微RNA (miRNA)表达来实现。微RNA是22个核苷酸的非编码的小RNA，其被装载进RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，以发挥总体的基因沉默功能。c-Myc会在ES细胞中诱导miR-141、miR-200和miR-429 的表达，以拮抗分化。C-Myc也会促进肿瘤发生，这是通过增量调节miR-17-92微RNA簇或通过抑制已知的肿瘤抑制剂(诸如let-7家族、miR-15a/16-l、miR-29家族和miR_34a)来实现。克服确保体细胞同一丨丨生并由诸如Ink4-Arf、p53和p21等因子介导的屏障,是重新程序化的限速步骤。由于miRNA组织特异性地调节靶基因，本发明证实，不同的MEF miRNA会在转录后调节起重新程序化调节剂的功能的蛋白。抑制这些miRNA可以影响细胞信号传递，以降低那些屏障。本发明证实，耗竭MEF中的丰富的miRNA miR-21和miR_29a会使重新程序化效率提高约2. I至2. 8倍。本发明也证实，c-Myc会抑制miRNAmiR-21和miR_29a，以增强MEF的重新程序化。本发明另外证实，miR-21和miR-29a会在重新程序化过程中通过间接地减量调节p53水平和ERK1/2磷酸化来调节p53和ERK1/2途径。提供下面的实施例来进一步例证本发明的实施方案，但是无意限制本发明的范围。尽管它们是可以使用的那些实施例的典型，但是可以替代性地使用本领域技术人员已知的其它操作、方法或技术。实施例I细胞培养、载体和病毒转导在D13. 5，从小鼠衍生出0ct4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，所述小鼠携带位于pou5fl (Jackson lab, Stock#008214)的终止密码子下游的IRES-EGFP融合盒。在含有10%FBS (Invitrogen) + 谷氨酰胺和 NEAA 的 DMEM (Invitrogen, 11995-065)中，培养这些MEF0对于iPSC诱导，仅使用在0至4代的MEF。质粒pMXs_0ct4、Sox2、Klf4 和 cMyc 购自 Addgene。通过将 N-端标记的 p21 插 pMX载体的EcoRI位点中，产生质粒pMX-HA_p21。pLKO-shRNA的克隆购自Open-Biosystems。为了产生逆转录病毒，将PLAT-E细胞接种在IOcm平板中，次日使用Lipofectamine (Invitrogen, 18324-012)和 PLUS (Invitrogen, 11514-015)转染 9 u g的每种因子。2天后，收获病毒，并组合。对于iPSC诱导，将MEF接种在12孔平板中，次日用4 u g/ml聚凝胺转导4种因子病毒。转导后I天，将培养基更换为新鲜的MEF培养基，并在3天后更换为补充了 LIF (Millipore，ESG1107)的mES培养基。在转导后第14天，挑取GFP+集落，并在含有15%FBS (Hyclone)+LIF、硫代甘油、谷氨酰胺和NEAA的DMEM中培养成功地繁殖的克隆。使用经辐照的CFlMEF作为饲养层，用于培养mES和衍生的iPSC克隆。为了产生shRNA慢病毒，将shRNA慢病毒载体与pPACKHl包装系统(SBI，目录号LV500A-1) 一起共转染进293FT细胞中。在转染后第2天，收获慢病毒，并以4，OOOrpm在室温离心5min。为了产生病毒，将4iigpLK0或pGIPZ载体和10 y g包装混合物转染进在IOcm组织培养板中的293FT细胞(Invitrogen)中。转染后2天，收获含有病毒的上清液，并用于使用4 y g/ Ul聚凝胺的进一步转导。以I: I: I: I: I的体积比，与4因子病毒一起加入ShRNA病毒。如下进行MEF的微RNA、siRNA和转染微RNA模仿物和抑制剂、siRNA购自Dharmacon0 为了转染 MEF,在 Opti-MEM (Invitrogen, 11058-021)中稀释微 RNA 模仿物至希望的终浓度。然后以 2 u I/孔，将 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019)加 入混合物中，并在室温温育20min。对于12孔转染，将80 u I miR混合物加入含有320 U IOpti-MEM的每个孔中。3小时以后，将0. 8ml病毒混合物(对于iPSC)或新鲜的培养基加入每个孔中，次日将培养基更换为新鲜的MEF培养基。如下进行蛋白印迹法使用在冰上的MPER缓冲液(PIERCE, 78503)制备总细胞裂解物20min，并通过以13，OOOrpm离心IOmin进行澄清。将等体积的裂解物加载到10%SDS-PAGE凝胶中，并使用半干燥的系统(Bio-Rad)将蛋白转移至PVDF膜(Bio-Rad, 1620177)上。然后用在TBST中的5%乳封闭PVDF膜在室温至少I小时或在4°C过夜。使用的抗体包括抗_p21 (BD, 556430)、抗-mNanog (R&D, AF2729)、抗-h/mSSEAl(R&D, MAB2156),抗-HA (Roche, 11867423001)、抗 _mAgo2 (ffako, 01422023),抗-Dicer(Abeam, ab 13502)、抗-Drosha (Abeam, ab 12286)、抗-肌动蛋白(Thermo, MS1295P0)、抗-AFP (Abeam, ab7751)、抗微管蛋白 III (R&D systems, MAB1368)、抗-a 辅肌动蛋白(Sigma, A7811)。如下进行mRNA和微RNA RT和定量PCR :通过Trizol方法(Invitrogen)提取总RNA。提取以后，将I ii g总RNA用于通过Superscript II (Invitrogen)进行的RT。使用Roche LightCycler480II 和来自 Abgene 的 Sybrgreen 混合物(Ab-4166),进行定量 PCR。小鼠Ago2、Dicer、Drosha、Graph和p21的引物列出在下面的表I中。其它引物已经描述在Takahashi, K.和 S. Yamanaka (2006) Cell 126 (4) :663_76。对于微RNA定量分析，使用上述的方法提取总RNA。提取后，将I. 5 3 y g总RNA用于微RNA反转录，其中按照生产商的方案(SBI，RA420A-1)使用QuantiMir 试剂盒。然后将RT产物用于定量PCR，其中使用成熟的微RNA序列作为正向引物和与试剂盒一起提供的通用引物。如下进行免疫染色用PBS洗涤细胞2次，并用4%低聚甲醛在室温固定20min。用0. l%Triton X-100透化固定的细胞5min。然后在5%BSA (其在含有0. l%Triton X-100的PBS中)中在室温封闭细胞I小时。根据生产商的建议，在含有0. l%Triton X-100的
2.5%BSA PBS中，将第一抗体从1:100稀释至1:400。然后用第一抗体将细胞染色I小时，再用PBS洗涤3次。以1:400稀释第二抗体，并将细胞在室温染色45min。如下进行胚状体(EB)形成和分化试验用胰蛋白酶将iPS细胞制成单细胞悬浮液，并使用悬滴方法来产生胚状体。对于每一滴，使用在20 u IEB分化培养基中的4000个iPS细胞。在悬滴中培养EB 3天，然后重新接种到明胶包被的平板中。重新接种以后，进一步培养细胞，直到第14天，这时可以鉴别出明显的搏动区。表I.用于qPCR分析的引物mmuAgo2正向5，-gcgtcaacaacatcctgct-3，反向5，-ctcccaggaagatgacaggt-3，mmuDrosha !￡( 5，_cgtctctagaaaggtcctacaagaa_3，反向5’ -ggctcaggagcaactggtaa-3'mmuDicerl !￡( 5， _gggctgtatgagagattgctgatg_3，反向5，-cacggcagtctgagaggatttg-3，mmuP21正向5，-tccacagcgatatccagaca-3，反向5，-ggacatcaccaggattggac-3’mmuGAPDH正向5，_atcaagaaggtggtgaagcggaa_3’反向5’ -tggaagagtgggagttgctgttga-3’如下进行启动子甲基化分析按照以前描述的相同规程(Takahashi, K.和S. Yamanaka (2006) Cell 126 (4) :663_76)，分析 Nanog 和 Pou5fl 启动子的 CpG 甲基化。简而言之，使用Qiagen 试剂盒，提取衍生的克隆的基因组DNA。然后按照生产商的方案(EZDNA甲基化-直接试剂盒，Zymo Research, D5020)，将I y g DNA用于基因组修饰分析。修饰以后，进行选定区域的PCR，并将产物克隆进pCR2. 1-T0P0 (Invitrogen)中。对于每个基因，测序10个克隆。实施例2畸胎瘤形成、嵌合体产生和微阵列分析如下进行畸胎瘤形成和嵌合体制备为了产生畸胎瘤，用胰蛋白酶处理iPS细胞，并以IxlO7细胞/ml的浓度重新悬浮。首先用阿佛丁麻醉无胸腺的裸鼠，然后将大约150 Ul细胞悬浮液注射进每只小鼠中。每周检查小鼠的肿瘤，持续3 4周。收获肿瘤，并在锌福尔马林溶液中在室温固定24小时，然后进行石蜡包埋以及苏木精和伊红染色。为了测试衍生的iPSC克隆对嵌合体做出贡献的能力，将iPS细胞注射进C57BL/6J-Tyr (C^2J)/J (白变种)胚泡中。通常，每个胚泡接受12-18个iPS细胞。将雌性ICR受体用于胚胎转移。供体iPS细胞是刺鼠色或黑色。如下进行mRNA微阵列分析将miR-93和siControl转染进MEF中，并在转染后48小时收获总RNA。通过在Sanford-Burnham研究所的微阵列设备,进行mRNA微阵列。通过经由火山图(volcano map)过滤,产生潜在功能祀标(倍数变化>2,p〈0. 05)和总祀标(倍数变化>25%，p〈0. 05)的基因列表。然后将基因列表用于本体论分析，其中按照公司的指南使用GeneGo软件。
如下进行双萤光素酶试验将p21和Tgfbr2的3’ UTR克隆进pGL3对照载体的XbaI位点中。对于12孔平板的每个孔，将200ng得到的载体和50ng pRL-TK (renilla萤光素酶)转染进IxlO5个Hela细胞中，所述细胞在转染前I天接种。将50nM微RNA用于每次处理，并在转染后第2天收获细胞裂解物。然后按照生产商的方案OCl营光素酶 报道试验系统Promega，E1910)，将20 裂解物用于双萤光素酶试验。如下进行细胞增殖试验将3000MEF接种在96孔平板的每个孔中，并用4F病毒和shRNA慢病毒转导(或用微RNA抑制剂转染)。从转导/转染后第I天开始，每2天，在组织培养箱中用mES培养基温育细胞I小时，所述mES培养基含有Celltiter 96Aqueous one溶液(Promega，G3580)。然后使用平板读数器，测量每个孔在490nm的吸光度，并将收集的数据用于产生相对增殖曲线，其中使用来自转导/转染后第I天的信号作为参照。实施例3在重新程序化体细胞中涉及转录后调节途径、经测定，转录后调节途径涉入MEF向iPS细胞的重新程序化。为了研究转录后基因调节在iPSC诱导过程中的作用，使用祀向小鼠Dicer、Drosha和Ago2的慢病毒shRNA载体进行原代0ct4_GFP MEF的稳定敲除。通过蛋白印迹和RT-qPCR，验证这些shRNA构建体的敲除效率(图la、Ib和lc)。常规地观察到每种shRNA的大约70%-80%的mRNA水平敲除以及蛋白水平的显著降低。然后以1:1:1:1:1的体积比，将所述shRNA单独地用于与表达4种因子OSKM(0ct4.Sox2.Klf4和cMyc)的病毒一起转导MEF。14天以后，固定集落，并进行碱性磷酸酶(AP)活性染色，该酶是广泛使用的ES细胞标志物。定量每次处理的AP+集落，关键RNAi机制蛋白Dicer、Drosha和Ago2的敲除导致与pLKO和pGIPZ对照相比AP+集落的急剧减少。通过使用OSK (3种因子3F)转导，观察到类似的结果。GFP+和AP+集落定量证实，敲除Ago2会急剧降低重新程序化效率，而转导的成纤维细胞的增殖不受影响(图ld、le和If)。尽管在Ago2敲除以后重新程序化效率降低，在shAgo2中的有些GFP+集落是感染的MEF，并且进一步的表征确定，这些集落是shRNA整合阳性的，其中活跃地表达shRNA (图13a和13b)。这些细胞也表达所有测试的ES特异性的标志物，且已经开启内源0ct4基因座(图13c)。这些数据强烈地提示，转录后调节(特别是微RNA)在重新程序化过程中起重要作用。实施例4在体细胞的重新稈序化过稈中诱导了微RNA簇经测定，微RNA miR-17、25、106a和302b簇在重新程序化的早期被诱导。由于这4种转录因子在iPSC诱导过程中诱导大量基因表达变化，推论出这些因子可能诱导一些ES特异性的微RNA，它们将有助于MEF成功地重新程序化。最近的关于ES特异性的微RNA增强iPSC诱导的公开也支持该假设，尽管在重新程序化的非常晚期之前没有发现表达报道的微RNA。通过分析公开的结果，选择9个经确定在小鼠ES细胞中高度表达的微RNA簇用于分析，并如表2所示。使用基于miR qPCR的方法，评价来自每个簇的2个代表性的微RNA，以定量在不同的重新程序化阶段(包括OSKM因子转导后第0天、第4天、第8天和第12天)的表达变化。在第8天之前，没有诱导许多ES特异性的微RNA，诸如miR-290簇和miR-293簇(图14)，在该阶段，GFP+集落已经可检测到。在4种因子转导后第4天之前，几种其它的微RNA簇(包括miR-17 92、25 106b、106a 363和302b 367)以不同的程度表达(图2a)。在这4个微RNA簇中，miR-302b"367在MEF中的水平最低。第4天在重新程序化时高度诱导的3个簇中，一些共有非常类似的种子区(图2b)，这提示，它们在重新程序化中起作用，并可以靶向类似
的基因集合。表2.用于iPSC实验的微RNA的列表
mmu-miR-290 簇mmu-miR-290
mmu-miR-291a mmu-miR-292 mmu-m 丨 R-291b mmu-miR-293 鍰mmu-miR-293
mmu-miR-294
nirnu-miR-295mmu-miR-302 鍰mmu-miR-302b
mmu-miR-302cmmu-miR-302ainmu-miR-302dmmu-miR-367mmu-mlR-17-92 蔟； m mu-rniR-17
mmu-niiR-18a mmu-miR-19a mmu-miR-20a rn mu-rniR-19b mmu-miR-92a mmu-miR-106a 襄 inmu-miR-106a
mmu-miR-18b mmu-miR-20b mmu-miR-19b mmu-miR-92a mmu-miR-363 mmu-miR-93 襄mmu-miR-106b
mmu-miR-93 mmu-miR-25 mmu-miR-15b 蔟 mmu-miR-15b
mmu-miR-16
mmu-miR-130a
mmu-miR-32然后进行分析，以确定4种因子中的哪一种负责诱导这些微RNA。通过用相同剂量的4种因子的不同组合转导MEF，在转导后第4天收获总RNA，用于miR qPCR分析(图2c)。该分析证实，单独的cMyc可以诱导miR-17 92、miR-25 106b和miR_106a 363簇表达。但是，在所有情况下，所有4种重新程序化因子的组合诱导了微RNA簇的最丰富表达，并且稳健表达与最闻的重新程序化效率相关联(图2c)。这些结果鉴定出，在重新程序化的早期诱导3个微RNA簇(包括miR_17、2、 25 106b、106a 363)，且进一步，4种因子一起最高度地诱导这些微RNA的表达，尽管单一因子也可以在较低的程度上诱导它们的表达。实施例5微RNA增强IPSC诱导经测定，微RNA miR-93和miR-106b会增强小鼠iPSC诱导。由于所述4种鉴定的微RNA簇含有几个具有类似种子区的微RM,进一步分析miR-106lT25簇，因为该簇包括3个微 RNA (BP,miR-25,miR-93 和 miR_106b)。MiR-93 和 miR_106b 具有相同的种子区，且二者被4种重新程序化因子高度地诱导(图2a)。假定，如果这些微RNA在重新程序化的细胞中起作用，通过在该过程中诱导这些微RNA，预见到提高的iPSC诱导效率。使用将微RNA模仿物直接转染进MEF中的策略，进行这些诱导的微RNA的功能测试(图3a)。在第0天和第5天与4种因子(或0SK)病毒一起导入微RNA 2次，并使用具有 在内源0ct4启动子控制下的GFP表达的报道MEF。例如，在第0和5天，用表达所有4种因子(4F，OSKM)或仅表达0ct4、Sox2和Klf4 (OSK)的载体，将微RNA模仿物直接转染进携带Oct-4-GFP的MEF中，并基于GFP表达来测定重新程序化。当这些细胞被成功地重新程序化成iPSC时，它们变成GFP阳性的(+ )。在约第11天，定量GFP+集落，以评价重新程序化效率(图3b ;表3)。实际上，miR-93和miR_106b模仿物的转染导致GFP+集落在4F和OSK转导中增加约4飞倍(图3c)，这证实了在iPSC诱导过程中诱导的这些微RNA会促进MEF重新程序化。表3.用于iPSC诱导的具有miR的GFP+集落的数目
权利要求
1.一种产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法，所述方法包括 a)使体细胞接触细胞核重新程序化因子；以及 b)使(a)的所述细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的微RNA，从而产生iPS细胞。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA或RNA经过修饰。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA是在载体中。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR_106a、miRlet-7家族成员或miR_302b簇中。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA具有包含SEQIDNO: I的多核苷酸序列。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA具有选自SEQIDNO:2-11的多核苷酸序列。
8.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA调节p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA调节Spry1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。
10.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子由在载体中包含的基因编码。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、0CT4、NANOG, LIN28或它们的组合。
12.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。
13.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子包括c-Myc。
14.根据权利要求I所述的方法，其中在接触所述微RNA之前、同时或之后，使所述体细胞接触所述重新程序化因子。
15.根据权利要求I所述的方法，其中所述体细胞是哺乳动物细胞。
16.一种使用根据权利要求I所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞。
17.一种根据权利要求I所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞的富集群体。
18.—种通过诱导根据权利要求I所述的方法产生的多能干细胞的分化而衍生出的分化的细胞。
19.一种治疗受试者的方法，所述方法包括 a)通过根据权利要求I所述的方法，从所述受试者的体细胞产生诱导的多能干(iPS)细胞； b)诱导步骤(a)的所述iPS细胞的分化；以及 c)将(b)的所述细胞导入所述受试者中，从而治疗病症。
20.微RNA用于提高iPS细胞的产生效率的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述微RNA选自:miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b 簇、miR let-7 家族成员或它们的组合。
22. miR序列的一种组合,其选自下述的至少2种或更多种miR_17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b 簇、miR let-7 家族成员或它们的组合。用于产生和调节i PS细胞的方法及其组合物技术领域
本发明一般地涉及诱导的多能干(iPS)细胞领域，更具体地涉及从体细胞产生这样的细胞的方法以及通过这样的方法产生的iPS细胞的临床和研究用途。
技术背景
诱导的多能干细胞(iPSC)表现出胚胎干(ES)细胞的性质，最初通过4种细胞核重新程序化因子(4F:0ct4、Sox2、Klf4和cMyc)在小鼠体细胞中的异位表达来产生。在人细胞中，除了最初的4种Yamanaka因子以外，iPSC也可以用4种因子的替代集合(例如，0ct4Nanog Lin28和Sox2)来产生。尽管已经证实来自不同组织的许多细胞类型是可重新程序化的，iPSC衍生化和进一步的治疗用途的主要瓶颈是，重新程序化的低效率，通常0. 01%至0.2%。尽管大量工作已经聚焦于筛选提高重新程序化效率的小分子以及开发iPSC衍生化的新方法，原代成纤维细胞如何重新程序化为ES-样状态的机制在很大程度上仍然不明。
为了理解细胞重新程序化的机制，已经使用了不同的方案。基于小分子的方法已经鉴定出，通过用Dnmtl抑制剂处理细胞，可以加速重新程序化过程。还已经发现，TGF3抑制能够更快地且更有效地诱导iPSC，其可以替代Sox2和cMyc。进一步的阵列分析已经证实，当提供用诸如甲基转移酶抑制剂等因子的处理时，可以推动部分地重新程序化的iPSC进一步变成完全重新程序化的。4种重新程序化因子的启动子结合和表达诱导的基因组范围的分析证实，这些因子在iPSC和mES细胞中具有类似的靶标，且可能调节类似的基因集合，并且重新程序化因子的靶向在部分的iPSC中也被改变。
最近，几个研究组已经鉴定出，P53-介导的肿瘤抑制剂途径可以拮抗iPSC诱导。P53和它的下游效应物p21在重新程序化过程中均被诱导，且两种蛋白的减少的表达可以促进iPSC集落形成。由于这些蛋白在表达4种重新程序化因子(4F)的大多数细胞中被增量调节，且据报道cMyc会阻断p21表达，仍然不清楚这4种因子(4F)的异位表达如何克服了针对癌基因/转基因过表达的细胞应答和为什么仅非常小的细胞群体变得完全重新程序化。
微RNA是与称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)的蛋白复合物相关的18-24个核苷酸的单链小RNA。这些小RNA经常从基因转录物的非编码区产生，其功能是通过翻译阻遏来抑制基因表达。近年来，已经发现微RNA参与许多不同的重要过程，诸如人ES细胞的自我更新基因表达、胚胎干(ES)细胞的细胞周期控制、选择性剪接、心脏发育以及许多其它过程。此外，最近已经报道，ES细胞-特异性的微RNA可以增强小鼠iPSC衍生化，并在重新程序化过程中替代cMyc的功能。还提示,hES特异性的miR-302会减轻由人成纤维细胞中的4种因子表达导致的衰老应答。但是，由于这些微RNA在重新程序化过程的非常晚期之前不表达，以前仍然不知道微RNA是否在iPSC诱导中起重要作用。发明内容
本发明是基于下述有潜力的发现，即在iPSC诱导过程中涉及微RNA。微RNA生源说机制的干扰导致重新程序化效率的显著降低。鉴别出在重新程序化早期高度诱导的微RNA簇，且功能实验表明，将这样的微RNA导入体细胞中会提高诱导效率。另外，鉴别出重新程序化细胞使用的关键调节剂，它们可以被有利地靶向，以显著增加重新程序化效率以及指导iPS细胞的分化。
因此， 在一个实施方案中，本发明提供了一种产生iPS细胞的方法。所述方法包括使体细胞接触细胞核重新程序化因子，并使所述细胞接触微RNA，所述微RNA改变所述细胞内的RNA水平或活性，从而产生iPS细胞。在一个方面，所述微RNA或RNA被修饰。在另一个方面，所述微RNA是在载体中。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR_106a、miR let_7 家族成员(例如，let_7a、miR 98)或 miR_302b 簇中。在另一个方面，所述微 RNA 是 miR-93、miR_106b、miR-21、miR_29a 或它们的组合。
在一个方面，所述微RNA具有包含SEQ ID NO: I的多核苷酸序列。在另一个方面，所述微RNA具有选自SEQ ID N0:2-ll的多核苷酸序列。在另一个方面，所述微RNA调节p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。在另一个方面，所述微RNA调节Spry 1/2、p85、CDC42 或 ERK1/2 途径。
在一个方面，所述细胞核重新程序化因子由在载体中包含的基因编码。在另一个方面，所述细胞核重新程序化因子是SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、0CT4、NANOG, LIN28或它们的组合。在另一个方面，所述细胞核重新程序化因子是0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。在另一个方面，所述细胞核重新程序化因子包括C-Myc0在另一个方面，诱导效率是没有微RNA时的至少2倍。
在一个方面，在接触微RNA之前、同时或之后，使所述体细胞接触重新程序化因子。在另一个方面，所述体细胞是哺乳动物细胞。在另一个方面，所述体细胞是人细胞或小鼠细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过使体细胞接触细胞核重新程序化因子和p21表达或活性的抑制剂而产生iPS细胞的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过使体细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的试剂而产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法，其中所述试剂诱导体细胞的多能性，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。在不同的实施方案中，所述RNA是非编码RNA (ncRNA)，包括微RNA。
在上述方法的一个方面，所述试剂是多核苷酸、多肽或小分子。在另一个方面，所述多核苷酸是反义寡核苷酸、化学修饰的寡核苷酸、锁定的核酸(LNA)或DNA。在另一个方面，所述多核苷酸是RNA。在另一个方面，所述RNA选自微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA或shRNA。在另一个方面，所述体细胞是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
在不同的方面，所述改变RNA的试剂可以抑制p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。在一个方面，所述试剂可以是多核苷酸、多肽或小分子。在另一个方面，所述试剂或p21、Tgfbr2和/或p53的抑制剂是RNA分子，包括微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA或shRNA或反义寡核苷酸。在一个示例性的方面，所述试剂或p21、Tgfbr2和/或p53的抑制剂是微RNA分子，并由在导入所述细胞中的重组载体中包含的多核苷酸编码。
在不同的方面，所述微RNA可以是包括在簇中的微RNA，所述簇在iPSC的诱导或其
全文摘要
本发明提供了产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法，其与常规方法相比具有提高的诱导效率。所述方法包括用与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21抑制剂组合的细胞核重新程序化因子处理体细胞。本发明另外提供了通过这样的方法产生的iPS细胞以及这样的iPS细胞的临床和研究用途。
文档编号C12N5/074GK102712904SQ201080061064
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月10日 优先权日2009年11月11日
发明者T·M·拉那 申请人:桑福德—伯恩哈姆医学研究协会