专利名称：新型调节性t细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原特异性免疫、及其形成和调节的领域。
背景技术：
免疫系统是一种必须调节本身以避免不充分免疫、抑制过度应 答以及防止自身反应性应答的维持体内平衡的组织。这种有限的调
控是通过一组鉴定为调节性T细胞的T淋巴细胞部分地介导的。支 持存在多于 一 个涉及外周耐受保持的调节性T细胞种群的证据逐渐 积累。这些不同的调节性种群以不同方式起作用并且一部分是天然 产生的，而其他是局部地由于免疫应答i秀导的。尽管大量石开究才艮道 了在正常小鼠和人类的外周'淋巴纟且织中，总;林巴细力包的1-5%是 ap-TCR+ DN T纟田月包，并且MRL/Mpj-lpr/lpr小鼠中的a(3-TCR+ DN T 细胞的年龄相关积累，具有突变Fas基因和大量淋巴结病，夕卜周DN T细胞的起源仍然不清楚。由不同DN T细胞表达的标记物中的异 质性表明，可能存在多种突变/分化路径。在鼠类^^莫型中，多种研究 已经i正实，DN ap TCR+ T细月包可以直4妻来源于CD8+ T细月包。其他 研究表明DNapTCR+纟田胞来源于胸腺外器官，如骨髓。
由于调节性T细l包在保4寺外周耐受中起作重要作用，因此对于 调节性T细胞的转移的治疗潜力对于在自身免疫疾病和移4直中的应 用也4艮有意义。然而，将调节性T细胞种群用作用于治疗免疫调节 紊乱的潜在的以细胞为基础疗法的当前技术由于缺少精确细胞标记物、缺少抗原特异性、以及缺少调节性细胞的可行的来源而仅具 有有限的成功。
需要调节性T细胞的分离、体外回输(ex vivo )鉴定和扩增的 方法以改善目前用于治疗免疫调节紊乱的以细胞为基础的治疗方案。
发明内容
本发明的特征在于是一种用于分化调节性T细胞的独特路径， 所述细胞具有CD4-、 CD8-、 CD3+的表型(双阴性T纟田月包，DN T 细月包)并且表达标记物CD44+、 CD69+、或CD28+中的至少一种。
本发明的特征还在于是一种获得具有CD4-、 CD8—表型的调节 性T细胞的方法，所述方法包括从样品分离CD4+、 CD8-细月包； 将抗原和IL-2、或IL-15中的至少一种与所述CD4+、 CD8-细胞一 起培养；分离所述CD4-、 CD8-细胞；其中所述分离的CD4—、 CD8-
性。分离的CD4+、 CD8-前体细胞可以具有CD25+或CD25—表型， 并且来自4壬一前体的转化的CD4—、 CD8—细胞是Foxp3-。在另一优 选实施方式中，所述DN调节性T细胞由于CD4基因沉默而获得 CD4-表型。
本发明的另一特征在于，所述调节性T细胞还表达标记物 CD3+、 CD25+、 TCR卩+中的至少一种，但不表达NK1丄，并且是 Foxp3-。优选地，所述调节性T细胞还表达低水平的IL-2、 IL-4、 IFN-y、 CTLA-4、 TGF-p，以及高水平的穿孔素和颗粒酶B。
在本发明的另一实施方式中，所述CD《、CD8-细胞抑制抗原 特异性应答T细力包的增殖、或活化中的至少一种。这包4舌这样一种实施方式，其中所述调节性细胞在抑制初始CD4+、 CD25-应答T细 胞的抗原特异性增殖方面比在抑制初始CD4+、 CD25-应答T细月包的 抗原非特异性增殖上更有效。
在本发明的另一实施方式中，当利用抗原攻击时，所述调节性 T细胞是应答不足的，并且应答可以通过IL-2、或IL-15中的至少
一种恢复。
本发明的特征还在于是一种用于获得表达以下标记物CD3+、 TCR (3十、CD44+、 CD69+、或CD28+中的至少一种、并且表达蛋白 质穿孔素和颗斗立酶B的CD4\ CD8—调节性T细月包的方法。
本发明的特征还在于是一种通过至少4轮抗原刺激的增殖获得 CD4\ CD8-调节性T细月包的方法。所述CD4-、 CD8—调节性T细月包 抑制抗原特异性应答T细胞的增殖或活化中的至少一种。该应答T 细月包可以是CD4+、 CD25-、或CD8+。
本发明的另一特征是包括获得一种抗原特异性的CD4—、 CD8— 调节性T细胞，其中所述抗原是自身抗原、同种异型抗原或异种抗 原(anto陽，allo-, or xenoantigen )。 4尤选i也，这种4元原出玉见在CD3—成 熟的骨髓树突状细胞、B细胞或其他抗原呈递细胞上。
本发明的特4正还在于是一种分离所述CD《、CD8-调节性T细 胞的方法，其通过选4奪表达细月包表面标记物CD3而不表达细胞表面 标记物CD4的所述细胞。如果需要，分离所述CD4-、 CD8—调节性 T细月包的方法是利用富集柱、或细月包分选中的至少一种完成的。在 本发明的另一优选实施方式中，所述分离的CD4—、 CD8—调节性T 细月包是通过IL-2、或IL-15中的至少一种扩增的。本发明的特征还在于是 一 种抑制在对其有需要的对象内的抗
原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述CD《、CD8-调节'性T细月包。
本发明的特征还在于是一种治疗在对其有需要的对象内的抗 原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述CD4—、 CD8— 调节性T细月包。
本发明的特征还在于是一种调节在对其有需要的对象内的抗 原特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括给予所述CD4—、 CD8— 调节性T细月包。
在前述抑制、治疗或调节抗原特异性应答的方面中，所述抗原 特异性免疫应答可以是移4直排斥、自身免疫紊乱、移植物抗宿主病 (GVHD)、对肺瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应原 的应答。所述抑制、治疗或调节的方法包纟舌在对其有需要的患者体 内加强初始或激活应答T细胞的激活诱导细胞死亡(AICD )。所述 应答T细月包可以是CD4+、 CD25—或CD8+。优选i也，所述AICD的 方法是通过所述应答细胞的凋亡，其中所述A1CD部分地依赖于穿 孑L素或颗粒酶B。
图1A是由同种异型基因(allogeneic)成熟DC和细胞因子诱 导的CFSE标"i己的T细月包增殖的直方图。来自C57BL/6小鼠的 CD4+CD25- (Teff)和CD4+CD25+ ( Treg )纟田月包利用成熟DBA/2 DC+rlL-2或rIL-15刺激5天。CD3+ T细月包被门控(gated )并进行 CFSE分析。图IB是i正实来自C57BL/6 CD4+ T细月包的CD4-细月包经过成熟 DBA/2 DC刺激的转化的示意图。画轮廓区域旁的数值表示指定门 (designated gate )中的细月包百分凄t。
图1C是表明CD4—细胞仅在多个由同种异型基因成熟DC诱导 的细胞增殖周期之后出现的示意图。
图1D是证实在支持同种异型抗原(alloantigen )刺激004+ T 细胞增殖的相当的浓度下，rIL-2和rIL-15发挥类似的效力以增强 CD4+转化成CD4- T细胞的直方图和示意图。
图2A是i正实来自C57BL/6 ( CD45.1 ) CD4+ T细月包的CD《细 胞经由丝裂霉素C处理的DBA/2同种异型基因APC刺激的体外转 4匕的示意图。
图2B是i正实转化自C57BL/6 (CD45.1 ) CD4+ T细月包的CD4— 细胞经由同基因(syngeneic)成熟DC刺激的体外转化的示意图。
图2C是证实来自CD4+前体的CD4—细胞的体内转化和维持的 示意图。CFSE标记的同种异型基因C57BL/6 (CD45.1) CD4+T细 胞通过静脉注射转移到B6D2F1小鼠。流式细胞术是在第3天从 B6D2F1小鼠的月年和;林巴结富集而来的C57BL/6 (CD45.1 ) CD4+T 细胞转化的CD4—细胞。
图2D是i正实从CD4+前体细月包向CD41田月包的体内转化和4呆才寺 的示意图。CFSE标记的C57BL/6 ( CD45.1 ) CD4+ T细月包通过,争月永 注射转移到同基因Rag KO小鼠。流式细月包术是在第7天/人同基因 RagKO小鼠的脾和淋巴结的C57BL/6 (CD45.1 ) CD4+T细胞转化 的CD4—细月包。图3A示出了利用抗体转化的CD4-T细胞的染色以表明细胞表 面标i己物的直方图。
图3B是i正实在不同细胞种群上通过实时PCR的CD4和CD8
基因的相对表达的示意图。这里示出的结果^表三个独立实— 验。
图3C是证实大多数DN T细胞是膜联蛋白V—的直方图和示意 图，尽管激活的CD4+ T细胞的大多数是膜联蛋白V+。
图3D是证实转化的CD4-细胞表达独特的表达谱的示意图。来 自Foxp3-GFP葛支入(knockin) C57BL/6小鼠的CD4+CD25- (Teff) 和CD4+CD25+ ( Treg )细月包单独利用成熟DBA/2 DC或加上rIL-15 刺5敫6天。DN T纟田月包是GFP— ( Foxp3—)。
图3E是示出了在不同细胞种群上通过实时PCR确定的指定基 因的相对表达的示意图。这里示出的结果代表4个独立实验。
*Teff DN: 乂人CD4+CD25- T细月包转化的DN T纟田月包。
**Treg DN:从CD4+CD25+ T regs哞争4匕的DN T纟田月包。
图4A是示出了分离自通过DBA/2成熟DC加上IL-15刺激， 并通过成熟DBA/2 DC加上指定细胞因子再刺激4天的初纟及MLR 的DNT细胞和CD4+细胞的活化的示意图。增殖通过氖化胸苦([3H] TdR)并入确定并以三个独立实-睑的平均-f直示出。
图4B是i正实在有或没有IL-2或IL-15的情况下在用成熟DC 再刺激之后4天，DNT细胞保持DN表型的示意图。图4C是i正实通过成熟DBA/2 DC i秀导的C57BL/6 DN T细月包 潜在地抑制由相同同种异型抗原(成熟DBA/2 DC)引起的CFSE 标记的C57BL/6 (45.1 ) Teff增殖的直方图。
图4D是i正实通过成熟DBA/2 DC i秀导的C57BL/6 DN T细月包 以4交低效力抑制由第三方同种异型抗原(成熟C3H DC)触发的 CFSE才示i己的C57BL/6 (CD45.1) Teff增歹直的直方图。
图5A是i正实通过成熟DBA/2 DC刺〗敫的C57BL/6 Teff的月莫联 蛋白V染色的直方图。C57BL/6 DN T细胞才及大地增加在增殖 C57BL/6Teff中的膜联蛋白V+种群。
图5B是证实穿孔素在抑制抗原特异性应答中的作用的直方 图。CFSE标记的C57BL/6 ( CD45.1 ) Teff细月包通过成熟DBA/2 DC 刺激。比较了从野生型和穿孔素敲除小鼠转化的C57BL/6 DN T细
胞的抑制作用。这里示出的结果代表三个独立实验。
图5C是示出了 Teff细胞增殖的DN T细胞介导的抑制在没有 穿孔素的情况下 一皮减弱的示意图。这里示出的结果是三个独立实-验 的平均值。
图5D是示出了 Teff细胞增殖的穿孔素介导的抑制可能是该 Teff细胞的凋亡的示意图。通过成熟DBA/2 DC刺激C57BL/6 Teff 的膜联蛋白V染色。从野生型而不是穿孔素KO小鼠转化的DN T 细胞极大地增加了在增殖C57BL/6 Teff中的膜联蛋白V+种群。
图5E是通过颗粒酶B封闭减弱DN T细胞介导的对Teff增殖 的抑制的示意图。这里示出的结果是三个独立实验的平均值。图5F是通过成熟DBA/2 DC刺激的CFSE标i己的B6 Teff细月包 的示意图。B6 DN T细胞的抑制作用在颗粒酶B或对照抗体存在下 进行测试。
图6A是示出了 DN T细胞以同种异型抗原特异性方式抑制初 始T效应子刺激的皮肤同种异体移植物排斥的示意图。移植到 C57BL/6 RAG(-A)小鼠的来自DBA/2或C3H小鼠的皮月夫移才直物的 ^非斥由初始C57BL/6 Teff细月包的过继转移(adoptive transfer )所i秀 导。C57BL/6 DN T细胞的共转移(共过继，co-transfer )在4妾受DBA/2 移植物的小鼠中更有效地抑制排斥。利用Logrank试验实施统计分 析。
图6B是示出了 DN T细胞以同种异型抗原特异性方式显著地 延长免疫竟争性受体中的MHC 4告配岛同种异体移才直物存活的示意 图。给予13xl06 DN T细胞显著延长同种异型抗原特异性DBA/2(但 不是第三方C3H)胰岛(islet)同种异体移植物(allograft)存活。 利用Logrank 4全-3全(Logrank test)实施纟充计分冲斤。
图7A是示出了 DN T细胞防止NOD/SCID小鼠免受由致糖尿 病T细胞诱导的自身免疫糖尿病的示意图。NOD/SClD小鼠的糖尿 病由来自#唐尿病NOD小鼠的T细月包i秀导。NOD DN T细月包的共注 射显著地防止该小鼠免患糖尿病。利用Logrank 一全-睑实施统计分析。
图7B是示出了胰岛GAD65抗原特异性DN T细胞比抗原非特 异性DN T细月包在新发作辟唐尿病NOD小鼠中阻断自身免疫冲唐尿病 更有效的示意图。新发作糖尿病NOD小鼠利用GAD65特异性或非 特异性DN T细胞进行转化。利用Logrank检测实施统计分析。
图8是一个模型，其证实了在CD4+ T细胞的初始抗原诱导激 活期间发生的内在体内平衡机制控制免疫应答的程度和种类，包括TH1、 TH2、 TH17效应子以及CD4+CD25+Foxp3+、 Trl和CD4+转4b 的DN调节性细月包的出现。TH1和TH2 T细月包亚组的二分法、Treg 和TH17效应子的相互分化、以及随后活化诱导的细胞死亡i兌明内 在体内平#f才几制如何控制对感染有才几体和组织炎症的免疫应答的
程度和种类。分化之前未鉴定的DN调节性T细胞的新路径代表调 节免疫应答程度的负反馈机制。
具体实施例方式
不同的T细月包调节'1"生种群以不同方式起作用，并且一部分是天 然产生的，而其^f也是由于免疫应答而局部i秀导的。通过监4空在CD4+ T细胞增殖和分化期间的CD4表达，我们鉴定了 一种用于分化双负 (DN)调节性T细胞亚组的新^各径。本发明描述一种分离的调节 性T细月包，所述细胞具有独特的表型CD4—、 CD8、并且表达标记 物CD44+、 CD69+或CD28+中的至少一种，^f旦不表达NK1.1。在本 发明的一个优选实施方式中，CD4\ CD8—调节性T细月包是Foxp3—。
本发明进一步描述了表达不同于之前鉴定的调节性T细胞的 一组独特的表面标记物和基因谱的CD4—、 CD8—调节性T纟田胞。优 选地，所述CD4-、 CD8—调节性T细月包还表达叶氐水平的IL-2、 IL-4、 ifn-y、 ctla-4、 TGF-p,以及高水平的穿孔素和颗粒酶b。
在本发明的一个优选实施方式中，所述CD4-、 CD8、周节性T 细胞在抑制初始CD4+、 CD25—T细胞的抗原特异性增殖上比所述细 胞在抑制初始和活化CD4+、 CD25+上更有效。本发明进一步描述了 一种用于获得具有表型CD4\ CD8-的调节性T细胞的方法，所述 方法包4舌,人样品分离CD4+、 CD&细胞；用抗原和细月包因子IL-2、 或IL-15中的至少一种培养所述CD4+、 CD8—细月包；以及分离转化的 CD4-、 CD8—调节性T细胞。期望地，所述CD《、CD8-调节性T细 月包表达以下标记物CD3+、 TCR(3+、 CD44+、 CD69+、或CD28+中的至少一种，^旦不表达NK1.1。更加期望地，所述CD4-、 CD&调节性 T细胞是Foxp3-。转化的CD4\ CD8-调节性T细胞具有抑制对象 体内对所述抗原的抗原特异性免疫应答。分离所述CD《、CD83周 节性T细胞是通过选择表达细胞表面标记物CD3、并且缺少细胞表 面标i己物CD4的所述细力包。在本发明该实施方式的一个优选实施方 式中，所述分离是利用富集柱、或细胞分选中的至少一种完成的。
本发明还描述了一种方法，其中所述CD4-、 CD8-调节性T细 胞是在细胞因子IL-2、或IL-15中的至少一种存在下，通过至少4 轮的抗原刺激获得的。在本发明的 一 个优选实施方式中，所述CD《、 CD8-调节性T细胞能够抑制抗原特异性应答T细胞的增殖、或活化 中的至少一种。经历4中制的应答T细月包种群可以表达CD4+、 CD25— 或CD4+、 CD25+表型。经历抑制的应答T细胞种群也可以是CD8+。 在所述CD《、CD8-调节性T细胞的产生过程中使用的抗原可以是 自身抗原、同种异型抗原或异种抗原。所述抗原的来源可以来自 CD3—成熟骨髓扭t突状细胞或抗原呈递细胞。
本发明还描述了一种方法，其中转化的CD《、CD8-T细胞上 的细胞表面CD4分子的消失是CD4基因沉默的结果。在本发明的 一个优选实施方式中，CD4-、 CD8-调节性T纟田月包是/人CD4+CD25- T 细胞转化来的。在本发明的另一个优选实施方式中，CD4\ CD8-调节性T细胞是从CD4+CD25+ T细胞转化来的。在本发明一个进 一步优选实施方式中，所述转化的CD4—、 CD8-调节性T细胞是通 过细月包因子IL-2、或IL-15中的至少一种扩增的。
本发明的特征还在于是一种用于抑制、治疗或调节对其有需要 的对象体内的抗原特异性免疫应答，其中所述方法包括给予所述分 离的CD4\ CD8—调节性T细胞。在一个优选实施方式中，抗原特 异性免疫应答可以包括移4直物排斥、自身免疫紊乱、移才直物抗宿主病(GVHD)、对肺瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应
原的应答。
在本发明的另 一个实施方式中，抗原特异性免疫应答的所述抑
制、治疗或调节是通过加强(augment)初始或-敫活应答T细月包的 活化诱导的细胞死亡(AICD )。所述应答T细胞优选地具有CD4+、 CD25-或CD4+、 CD25+、或CD8+表型，并且所述AICD是通过所述 应答的凋亡。优选地，所述应答T细胞的AICDi秀导的凋亡部分地 依赖于穿孔素。在另一个实施方式中，所述应答T细胞的AICDi秀 导凋亡部分地依赖于颗粒酶B 。
实施例
以下实施例用于举例描述本发明。它们不用于以任何方式限制 本发明。
实施例1:外周CD4+ T细胞转4匕成CD4""细胞
成熟骨髓来源的树突状细胞(BM DC)已经显示出触发同种异 型基因CD4+CD25+T调节性细胞(Treg )的体外剧烈增殖的能力。 在一个研究T细月包生长因子(TCGF )对CD4+CD25+ Treg和 CD4+CD25-丁细胞的体外激活和增殖的作用的工作中，我们在混合 淋巴细胞反应(MLR)中，在有或没有TCGF的情况下采用了 LPS 成熟同种异型基因BM DC。焚光CFSE标记的C57BL/6 CD4+CD25+ 和CD4+CD25—T细胞用在6天MLR中剧烈增殖的成熟同种异型基 因DC进行共培养，并且rIL-2、或rlL-15的加入进一步增强该增殖 (图1A)。有趣地，我们发现，大比例的增殖细胞是CD4阴性的。 CD4阴性细月包的百分比在19.3% (当CD4+CD25+T细月包用成熟DC 培养时)至84.3% (当CD4+CD25—T细月包利用成熟DC+rIL-15培养 时)的范围(图1B)。为了才企查这些CD4-细胞的来源，高度纯化的CD4+CD25- T细 月包(>99% )利用成熟DC+rIL-15 i咅养。CD4—细月包在MLR的第1 、 2和3天没有检测到，表明CD4-细胞不是来自培养物的可能污染物。 在MLR的第4天出现的CD4-伴随强大的细胞增殖，表明CD4-细月包 是从增殖的CD4+ T细胞转化的。增殖的T细胞的CFSE荧光强度 表明CD4+CD25- T细胞向CD4-细胞的转化仅在4-5轮的同种异型抗 原触发的CD4+T细月包增殖之后发生(图1C )。
为了定量地评《介rlL-2和rIL-15对CD4+ T细胞向CD4—细月包的 转化的影响，我们在MLR中逐步滴加rlL-2和rIL-15的剂量。注意 到在CD4+CD25+与CD4+CD25— T纟田月包的rlL-2和rIL-15同种异型4元 原触发的增殖之间的增强^t力的显著不同(图1D)。然而，我们通 过近似85%分开的CD4+CD25-或CD4+CD25+T细胞才企测，发现在 支持同种异型抗原触发的CD4+CD25-或CD4+CD25+T细胞增殖方 面相当的浓度。在门控的种群中，rlL-2和rIL-15发4军类似的效果 以增强近似70%的CD4+CD25-或20%的CD4+CD25+T细月包向CD4— 《田月包寿i^匕。
通过使用丝裂霉素C处理的DBA/2同种异型基因APC或同基因成 熟DC，我们进一步一全查了 MLR中CD4+T细胞向CD4—T细月包的体 外转化。来自初始同源异基因(congenic ) CD45.1 C57BL/6小鼠的 脾和淋巴结的CFSE标记的CD4+CD25—和CD4+CD25+T细胞，在利 用丝裂霉素C处理的DBA/2同种异型基因APC (图2A)或同基因 成熟DC (图2B )刺激6天后在体外都可以被转化成CD(细胞。 在培养基中加入rlL-2或rIL-15显著增强所述转化(图2A )。此外， 为了跟踪在同种异型抗原触发或体内平衡增殖期间的体内CD4表 达，我们过继地将来自同源异基因CD45.1初始(naive) C57BL/6 小鼠的CFSE标记的高度纯化CD4+ T细胞(〉99% )转移到同种异 型基因B6D2F1或同基因免疫缺陷型RagKO小鼠。如图2C所示，同源异基因CD45.1+ CD4+ T细胞在过继转移后3天在同种异型基因B6D2F1宿主中经历强烈的增殖。在4-5轮的增殖之后，获自B6D2F1宿主的淋巴结和脾的5.87%和6.87%的CD45.1+ CD4+T细胞分别转化成CD4-T纟田月包(图2C)。在过继转移后7天，获自同基因RagKO宿主的CD45.1+ CD4+ T细胞的体内平衡增殖和转化的类似图形在图2D中示出。
实施例2:转化的CD4—细胞具有独特表型和基因表达i普
为了表征转化的CD4—细力包，我们4企查了细胞表面标记物的表达。转4匕的CD4—细月包表达一组独特的细月包表面才示记物，如图3A所示。CD4T细月包是CD4.、 CD8.、 CD3+、 TCR p+、 NKl.l.、 CD44+、CD25+、 CD69+、 CD28十。由于4争^匕的CD41田月包是CD8，口 CD3+,所以我们将它们命名为CD4+转化的双阴性(DN ) T纟田月包。
为了确定细力包表面上CD4表达消失的才几制，我们通过利用实时PCR分析了转化的CD4— T细胞的CD4基因表达。如图3B所示，
CD4基因在CD4+ T细l包中高度表达。相反，在專争化的CD( T细月包中没有可检测到的CD4基因表达。另夕卜，CD8基因在CD8+T细胞中高度表达，4旦在CD4+和转化的DN T细胞中不表达。因此，CD4基因在转化的DN T细月包中是沉默的。
之前的研究报道了，激活诱导的细胞死亡(AICD)是在个别(discrete )数量的T细胞分化之后出现的T细胞激活和凋亡事件的常头见结果。我们考察了增生CD4+和DN T细月包亚组之间的凋亡事件。在体外MLR 5天之后在增生的CD4+ T细胞中有54%的膜联蛋白V+染色的T细胞(图3C )。令人吃惊地，在转化的DNT细月包中仅有6.12%的膜联蛋白V+染色阳性细胞，即使它们已经经过了 4-8轮的细胞分化(图3C ),表明转化的DN T细胞耐受AICD。分支家力矣(forkhead family )转录因子Foxp3充当Treg细月包种系净争4匕因子(specification factor),并由ot匕独立于CD25表达而鉴定Treg细胞。利用之前描述的基因耙向方法，Foxp3^敲入小鼠传代，其中双顺反子(bicistronic ) EGFP才艮告子被引入到内源性Foxp3座位(Bettelli et al., Nature 441 (7090): 235-8 (2006))。通过利用来自Foxp3饰敲入 C57BL/6 小鼠的 CD4+CD25Toxp3gfi5+和CD4+CD25+Foxp3g*-T细胞，我们发现当它们转换到DNT细胞时，CD4+CD25Toxp3gfp+ T细月包丧失它们的Foxp3她表达，并且当它们转换到DN T细胞时CD4+CD25+Foxp3gfp- T细月包保持Foxp3饰阴性(图3D)。总之，来自CD4+CD25-和CD4+CD25+起源的转化DNT纟田月包是Foxp3阴'1"生的。
利用定量实时PCR技术来分析转化的DN T细胞的基因表达语。如图3D所示，/人CD4+CD25—和CD4+CD25+ T细月包净争化的DN T细月包不表达Foxp3，并且在^f氐水平上表达其他Treg相关的CTLA-4和TGF卩基因(图3E )。由活化的CD4+ T纟田月包以高水平表达IL-2、IL-4和IFNy基因，由DN T细月包在^f氐水平上表达。有趣地，DN T细胞表达高水平的细胞毒性淋巴纟田月包相关基因穿孔素和颗粒酶B。因此，,人CD4+CD25—或CD4+CD25+ T细胞转4匕的DN T细胞共有不同于初始CD4+CD25-、初始CD4+CD25+ Treg、以及;敫活的CD4+ T细月包的类似基因表达语。
实施例3:转化的DN T细胞是调节性T细胞
为了分析CD4+转化的DN T细胞的功能特性，我们通过细月包分选/人初步MLR分离了 CD4+和DN T细胞。在利用如在初步MLR中使用的成熟DC ( DBA/2 )的相同类的再刺〗敫之后，C57BL/6 CD4+T细月包剧烈增生，并且rlL-2、 rIL-4或rIL-15的加入进一步增强增生(图4A)。相反，DNT细胞当通过成熟DC再刺激时是应答不足(hyporesponsive )的。有趣;也，rlL-2或rIL-15能、^f旦rlL-4不能、完全恢复DNT细胞的应答性(图4A)。此外，DNT细胞在利用成 熟DC再刺激之后保持稳定的表型，即使在通过利用成熟DC+IL-2 或IL-15再刺激的强烈增生之后(图4B )。
我们进一步分4斤了 dn t细月包对同种异型抗原触发的初始 CD4+CD25—T细胞增生的影响。如图4C所示，CFSE标记的初始同 源异基因CD45.1 C57BL/6 CD4+CD25— T细胞在利用同种异型基因 DBA/2或C3H来源的成熟DC的MLR 5天其月间经历剧烈增歹直(图 4C和图4D )。在利用DBA/2成熟DC的初步MLR中，当在以1:1 比率具有t效应子的dn t细月包的混合物中共i咅养时，乂人^刀始 C57BL/6 CD4+CD25—和CD4+CD25+ T细胞转4匕的DN T细胞发4军原 始CD4+CD25—T效应子的相同同种异型抗原触发的增生的强抑制。 有趣地，rIL-2和rIL-15加入原代培养物中(其显著增强CD4+向 DN T纟田月包的转化)对DN T细月包抑制次级(secondary ) MLR中的 同种异型抗原触发的初始CD4+CD25— T细胞增殖的效力的有害影 响(图4C)。此外，DN T细胞抑制的效力趋于是同种异型抗原特 异性的。如图4D所示，由DBA/2同种异型4元原刺潮j秀导的DN T 细月包以4交低效力抑制次级MLR中的C3H同种异型抗原初始的初始 T步支应子增殖。当T效应子利用DN T细月包以1:0.25比率(100,000 T效应子25,000 DN T细月包，图4D)共培养时，效力的差异是更 显著(profound )的。
激活-秀导的细力包死亡(AICD)是控制免疫应答禾呈度的一种重 要内在机制。通过分析在有或没有DNT细胞的情况下利用成熟DC 共培养增殖的CD4+T细胞中的凋亡事件，我们寻求确定DN T细胞 对增殖CD4+T细月包的AICD的影响。如图5A所示，当CD4+CD25— T细胞仅用成熟同种异型基因DC共培养时，在增殖的CD4+T细胞 中有24.8%的月莫耳关蛋白V+细胞。相反，当CD4+CD25— T细月包用以 1:1比率(T效应子:DNT细胞)的成熟同种异型基因DC+DN T细胞共培养时，在增殖的CD4+T细胞中有75.7%的膜联蛋白V+细月包。 因此，DN T细胞增大成熟DC刺激的MLR中的增殖CD4+ T细月包 的细月包死亡。
穿孔素( 一种细胞毒性淋巴细胞相关的细月包因子)由DNT细 胞高度表达(图3D )。为了研究DN T纟田月包抑制CD4+CD25-增殖的 机制，我们考察了穿孔素在DN T细胞介导的抑制中的作用。我们 比專支了 乂人野生型C57BL/6小鼠转化的DN T细月包的抑制作用和来自 穿孔素基因敲除C57BL/6小鼠的DNT细胞的抑制作用。来源于穿 孔素KO小鼠的DN T细月包抑制成熟DC刺;敫的初始CD4+CD25- T 效应子增殖的效力显著低于野生型小鼠(图5B和5C)。当T效应 子以1:1的比率与DNT纟田胞共培养时，抑制速率从71.6%降<氐至 29.2%，当T效应子以1:0.25的比率与DNT细月包共3备养时，4中制速 率从55.3%降低至13.3%,(图5C)。图5Di正实了在共培养物中， 来源于穿孔素KO小鼠而不是来源于野生型小鼠的DN T细力包不增 加活化T效应子中的膜耳关蛋白V+细胞，表明穿孔素在DNT细月包介 导的细胞死亡和抑制中至少部分地起作用。我们进一步证实了颗粒 酶B在DN T细胞介导的抑制中起作用。通过特异性抗体对颗粒酶 B的封闭减少了活化T效应子中的膜联蛋白V+细胞(图5E ),其表 示为活化T效应子抑制的百分凄t降4氐(图5F )。
实施例4:转化的DN调节性T细胞能够抑制体内同种免a答
为了进一步测试转化DN T细胞的体内功能潜力，我们利用了 之前描述的皮肤同种异体移植物的过继转移4莫型(Sanchez-Fueyo et al" J Immunol. 168:2274-2281 (2002))。在有或没有100,000 DN T细 胞的情况下，C57BL/6 (H-2b) RAG (-A)受体接受100,000初始 C57BL/6效应子T细月包，其中的DN T纟田月包是/人通过在MLR中利 用成熟DBA(H-2d) DC+rIL-15共i咅养6天的初始C57BL/6小鼠的 CD4+CD25-T细胞转化的。同种异型抗原特异性DBA/2或对照第三方株C3H (H-2k)尾部皮肤移植物在随后几天置入。如图6A所示， 100,000初始C57BL/6 CD4+CD25- T细胞的过继转移能够以分别20 天和10天的平均移才直物存活时间触发DBA/2或C3H皮肤同种异体 移植物的急性排斥。相反，相同数量的转化C57BL/6 DN T细胞的 过继转移不会刺激DBA/2或C3H皮肤同种异体移植物的排斥，表 明DN T细胞在同种异型抗原再刺激后是无反应性的。然而，当/人 用DBA/2成熟DC+IL-15的MLR 6天后的初始C57BL/6 CD4+CD25-T细胞转化的相等数量的初始C57BL/6 CD4+CD25—和DN T细月包共 转移时，DBA/2皮肤同种异体移植物(allograft)的明显延长出现 (图6A， p=0.0067)。相反，DNT细胞的共转移不会防止第三方才朱 C3H皮肤同种异体移植物的急性排斥(图6A)。因此，DNT细胞 能够以同种异型抗原特异性方式抑制体内初始Cd4+CD25- T细月包触 发的皮肤同种异体移植物排斥。
基于发现DN T细月包在皮月夫同种异体移才直物的体内过继T细月包 转移模型中的同种异型特异性抑制作用，我们努力确定作为单一疗 法给予相对少量的DN T细胞是否对免疫竟争性MHC完全错配的 移植模型中的移植物存活具有任何作用。我们选择胰岛移植才莫型， 其中将13xl0"人用成熟DBA/2 (H-2d) DC+rIL-15在MLR中共i备养 6天的初始C57BL/6小鼠的CD4+CD25- T细月包转化来的DN T细月包， 在胰岛细胞移植时转移到链脲霉素诱导的糖尿病C57BL/6受体中。 ^口图6B戶斤示，才目比于未处5里的只于照纟且(P=0.005 )， 13xl()6DNT纟田 胞的转移导致同种异型抗原特异性DBA/2抹(但不是第三方C3H 才朱)力夷岛的同种异体移植物存活的统计学显著性延长。这i正实在 MHC错配胰岛同种异体移才直才莫型中，离体回输(ex vivo)的CD4+ T 细胞转化的同种异型抗原特异性DN调节性T细胞#皮用作防止同种 异体移植排斥的免疫调节疗法。我们进一步证实，DN调节性T细 胞能够防止自身免疫糖尿病的形成。如图7A所示，DNT细胞4呆护 NOD/SCID小鼠免受由来自糖尿病NOD小鼠的致糖尿病T细月包诱导的自身免疫糖尿病。NOD/SCID小鼠的糖尿病是由来自糖尿病 NOD小鼠的T细胞i秀导的。NOD DN T细胞的共注射显著地/隊护 该小鼠免患糖尿病。此外，我们证实了这是一种抗原特异性保护， 因为胰岛GAD65抗原特异性DN T细胞比抗原非特异性DN T细月包 在新发作糖尿病NOD小鼠中在阻断自身免疫4唐尿病方面更有岁丈力 (图7B )。
其他实施方式
在本说明书中引述的所有出版物和专利都通过引用结合于本 文中，如同每一个单独的出片反物或专利特别;也和单个i也指明通过弓1 用并入一才羊。尽管上述发明已经通过为了清楚理解的目的举例i兌明 和实施例的方式进4亍部分i,细i也4笛述，4旦是^J"于本々页i或4支术人员来 说明显的是，^f衣据本发明的教导，可以进行某些改变和变形而不背 离所附权利要求的精神或范围。
虽然本发明已经结合特定实施方式进4亍了描述，^f旦是应当J里
解，本发明能够进一步变形。因此，本申请将^a盖所有依照本发明
的原理所作的本发明的任何变形、用途或修饰，包括来自本领i或中
的已知或常规实践的偏离本披露内容的那些。 其他实施方式在所附冲又利要求中。
权利要求
1.一种分离的调节性T细胞，所述细胞具有CD4-、CD8-表型，所述细胞表达CD44+、CD69+和CD28+中的至少一种。
2. 根据权利要求1所述的调节性T细胞，其中所述细胞也表达 CD3+、 CD25+和TCR(3+中的至少一种。
3. 根据权利要求1所述的调节性T细胞，其中所述细胞具有 NKl.r表型。
4. 根据权利要求1所述的调节性T细胞，其中所述细胞具有 Foxp3—表型。
5. 根据权利要求1所述的调节性T细胞，其中所述细胞表达《氐 K平的IL-2、 IL-4、 IFN，、 CTLA-4禾口 TGF-P,并且表达高7K 平的穿孔素和颗粒酶B 。
6. 根据权利要求1所述的调节性T细胞，其中所述细胞的CD4— 表型是CD4基因沉默的结果。
7. 根据权利要求1所述的调节性T细月包，其中所述细胞抑制初 始CD4+、CD25—T细胞的抗原非特异性增殖比抑制初始CD4+、 CD25，细胞的抗原特异性增殖更有效。
8. —种获得CD《、CD8—调节性T细胞的方法，所述方法包括a) 乂人才羊品分离CD4+、 CD81田月包；b) 将所述CD4+、 CD8-细胞用抗原和IL-2或IL-15中的至少一种培养；c) 分离戶斤述CD4-、 CD8.;d) 其中所述分离的CD4-、 CD8—细胞具有抑制对象体内对 所述抗原的抗原特异性免疫应答的特性。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述分离的CD4+、 CD8—细 胞是CD25+。
10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述分离的CD4+、 CD8-细 月包是CD25\
11. 根据权利要求8所述的方法，其中所述分离的CD4+、 CD8—细 月包是Foxp3-。
12. 根据权利要求8所述的方法，其中由所述培养步骤b )得到的 所述CD4\ CD8—细月包至少经过4 4仑的抗原刺激。
13. 才艮据^f又利要求8所述的方法，其中所述CD4-、 CD8-细胞抑制 抗原特异性应答T细胞的增殖或活化中的至少 一 种。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述应答T细胞是CD4+、 CD25-或CD4+、 CD25+。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
16. 根据权利要求8所述的方法，其中所述CD4-、 CD8-表达蛋白 质穿孔素和颗4立酶B。
17. 冲艮据权利要求8所述的方法，其中所述CD4-、 CD8-细胞表达 以下才示i己物CD3+、 TCR (3+、 CD44+、 CD69+、或CD28+中的 至少一种。
18. 根据权利要求8所述的方法，其中所述CD4—、 CD8-细胞具有 NKl.r表型。
19. 根据权利要求8所述的方法，其中所述抗原是一种自身抗原、 同种异型抗原或异种抗原。
20. 根据权利要求8所述的方法，其中所述抗原是出现在CD3-的 成熟骨髓树突状细胞或抗原呈递细胞。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述抗原呈递细月包是B细 胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
22. 根据权利要求8所述的方法，其中所述CD4—、 CD8-细胞的分 离通过选冲奪表达细月包表面标i己物CD3和不表达细月包表面标i己 物CD4的所述细月包。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述分离是使用富集柱或 细月包分选中的至少 一种完成的。
24. 根据权利要求8所述的方法，其中所述CD4—、 CD8-细胞是通 过IL-2或IL-15中的至少一种扩增的。
25. —种抑制在对其有需要的对象内抗原特异性免疫应答的方法， 其中所述方法包括给予权利要求8所述的CD4\ CD8-细胞。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答 是移植排斥、自体免疫紊乱、移植物抗宿主病(GVHD)、对 肿瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应原的应答。
27. 根据权利要求25所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答 的抑制是通过加强的活化导致的初始或活化的应答T细胞的 细胞死亡(AICD)。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述应答T细胞是CD4+、 CD25或CD4+、 CD25+。
29. 根据权利要求27所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
30. 根据权利要求27所述的方法，其中所述AICD是通过所述应 答细力包凋亡。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述AICD是通过部分依 赖穿孔素的凋亡。
32. 根据权利要求30所述的方法，其中所述AICD是通过部分依 赖颗冲立酶B的凋亡。
33. —种治疗在对其有需要的对象内抗原特异性免疫应答的方法， 其中所述方法包括给予权利要求8所述的CD4\ CD8-细胞。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答 是移植排斥、自体免疫紊乱、GVHD、对感染的应答、对肿瘤 细月包的应答、以及对变态反应原的应答。
35. 冲艮据权利要求33所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答 的治疗是通过加强初始或活化的应答T细力包的AICD。
36. 才艮据权利要求35所述的方法，其中所述应答T细胞是CD4+、 CD25或CD4+、 CD25+。
37. 根据权利要求35所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
38. 根据权利要求35所述的方法，其中所述AICD是通过所述应 答细胞的凋亡。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述AICD是通过部分依 赖穿孔素的凋亡。
40. 才艮据斥又利要求38所述的方法，其中所述AICD是通过部分依 赖颗4立酶B的凋亡。
41. 一种调节在对其有需要的对象内抗原特异性免疫应答的方法， 其中所述方法包4舌乡合予4又利要求8所述的CD4—、 CD8-细月包。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答 是移植排斥、自体免疫紊乱、GVHD、对感染的应答、对肿瘤 细胞的应答、以及对变态反应原的应答。
43. 才艮据4又利要求41所述的方法，其中所述抗原特异性免疫应答 的调节是通过加强初始或活化的应答T细月包的AICD。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述应答T细胞是CD4+、 CD25-或CD4+、 CD25+。
45. 根据权利要求43所述的方法，其中所述应答T细胞是CD8+。
46. 根据权利要求43所述的方法，其中所述AICD是通过所述应 答细胞的凋亡。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述AICD是通过部分依 赖穿孔素的凋亡。
48.4艮据权利要求46所述的方法，其中所述AICD是通过部分依 赖颗4立酶B的凋亡。
全文摘要
本发明提供一种分离的调节性T细胞以及获得调节性T细胞的方法。本发明也提供在需要给予对象分离的调节性T细胞的对象体内抑制抗原特异性免疫应答的方法(即，移植排斥、自体免疫紊乱、移植物抗宿主病、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答、以及对变态反应原的应答)。本发明也提供了在需要给予对象分离的调节性T细胞的对象体内治疗或调节抗原特异的免疫应答反应。
文档编号C12N5/0783GK101631851SQ200780050645
公开日2010年1月20日 申请日期2007年11月28日 优先权日2006年11月29日
发明者栋 张, 郑心校 申请人:贝斯以色列护理医疗中心