一种增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的抗原及其应用的制作方法

专利名称：一种增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的抗原及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种增加⑶4+⑶25+FOXP3+调节性T细 胞(Tregs)的血吸虫来源的抗原分子-日本血吸虫热休克蛋白60KDa (Schistosoma japonicum heatshock protein 60KDa, SjHSP60)及其应用。
背景技术：
上个世纪九十年代前后，西方发达国家提出来“卫生假说”，认为在卫生环境大大 改善的发达国家，一些过敏性疾病和自身免疫病的发病率大为增加，这是与发达国家卫生 条件改善，人群发生病原体感染的机会减少有关(Wills-Karp，et al, Nat Rev Immunol, 2001,1 69-75)。其后的若干年，科学家们通过一些过敏性疾病和自身免疫病的动物模型研 究证明，一些病原体的慢性感染确实可以预防这些免疫性疾病的发生或者减轻免疫病理损 伤(Dunne，Nat Rev Immunol, 2005, 5 420-426)如曼氏血吸虫感染可以预防或减轻I型糖 尿病，实验性脑炎，甲状腺炎；绦虫感染会减少实验性结肠炎的发病；链球菌感染可以抑制 胶原诱导型关节炎的发生发展，等等。从进化史的角度看，慢性感染是病原体和宿主在长期 共同进化彼此选择后，最终所形成的对双方都有利的一种平衡状态。在这种状态下，病原体 不会被宿主完全清除，可长期存在于宿主；宿主既可维持对病原体有一定抵抗力，也不会因 为过强的免疫反应而产生免疫病理损伤，而且还预防了自身免疫病的发生。随着免疫学的发展，在免疫系统中发现了一群天然存在的CD4+CD25+调节性T细 胞(Tregs) (Sakaguchi，et al.，J Immunol, 1995,155 :1151-64)，这群细胞主要由胸腺产 生，参与维持外周自身免疫耐受和免疫内环境稳定；后来进一步发现，一些病原体的感染 (病毒，细菌，寄生虫)也可以在外周从⑶4+T细胞中诱导产生⑶4+⑶25+Tregs (Bluestone and Abbas, Nat Rev Immunol，2003，3 :253_7)。如丙型肝炎病毒(HCV)感染人体后，可以 诱导特异性的 CD4+CD25+Tregs (Bolacchi，et al.，Clin Exp Immunol, 2006,144 188-96)； 小鼠百日咳杆菌感染模型中研究发现，⑶4+⑶25+Tregs发生增多(McGuirk，et al.，J Exp Med, 2002,195 :221_31)；寄生虫类感染中，曼氏血吸虫感染后4周，发现肠系膜淋巴结中 ⑶4+⑶25+Tregs发生了扩增，然后聚集到肝脏和脾脏中发挥免疫抑制效应(Wilson et al,. unpublished observaton)。进一步探究导致慢性感染的病原体是如何诱导调节性T细 胞，从而抑制免疫攻击，对于提高宿主抗感染力和治疗免疫病意义都非常重大。寄生虫中 的蠕虫类，是一类具有复杂生物学功能的多细胞真核生物，能够很好的逃避宿主免疫攻击， 长期存在于宿主机体中(Maizels，et al.，J ExpMed，2009，206 :2059_66)。蠕虫类中血 吸虫感染是一种非常典型的慢性感染，在其感染模型中研究发现，其虫卵抗原是刺激诱导 CD4+CD25+Tregs 产生的关键因素(Baumgart，et al.，JImmunol，2006，176 :5374_87)；此外， 本课题组也已发现，日本血吸虫虫卵抗原也可以刺激诱导⑶4+CD25+Tregs从而减轻哮喘所 导致的气道炎症反应(Yang, et al.，Immunology, 2006,120 :8_18)。关于特异性抗原在外周诱导免疫负调控的研究，在自身免疫研究领域已有一些报 道，有些自身抗原的自身反应性在逃避了胸腺中枢的阴性选择后，它们还可以在外周诱导自身反应性调节性T细胞，从而参与免疫调控。这些自身抗原包括一些组织抗原(谷氨酸 脱羧酶GAD，少突胶质细胞蛋白M0G，肌球蛋白等)；免疫调控分子(泛素，白介素，肌动蛋白 等)；应激蛋白(HSP40, HSP60, HSP70) (Merb 1, et al.，J Clin Invest，2007，117 :712_8)。 实际上，免疫系统天然就存在这些抗原的抗体或反应性T细胞，或其特定的受体(配体)， 它们会时刻监视着机体免疫系统，维持免疫内环境稳定(Cohen，Nat Rev Immunol, 2007, 7 569-74)。早些年就有研究发现，人自身HSP60或其多肽可预防或减轻I型糖尿病(Elias and Cohen, Diabetes，1996，45 :1168_72)，且于两年前已经开始应用于临床III期实验 (Eldor, et al.，DiabetesMetab Res Rev, 2009, 25 :316_20)；通过大鼠佐剂性关节炎模型 研究发现，鼠自身HSP60也可减轻关节炎症病理反应(Durai，et al.，J Autoimmun, 2009, 33:208-13)。而且非常特别的是，HSP60属于进化上最为保守的分子家族-热休克蛋白家 族，在所有真核和原核生物中高度同源。因此，病原体很可能会利用这个分子去模拟宿主 HSP60的作用，诱导免疫调控，抑制宿主免疫攻击，维持慢性感染。如果能够鉴定和验证出这 些病原体来源的“模拟分子”，不仅可以找到打破慢性感染的靶标，还可应用于预防或治疗 免疫性疾病。对于过敏性疾病和自身免疫病的治疗，临床上很长时间以来一直在用一些直接抑 制免疫应答行为的化学药物，如激素类，或者联合应用硫唑嘌呤(抗胸腺球蛋白类药物)， 环孢素 A 等(Bougneres, et al.，Diabetes, 1990,39 1264-72)。但是其中有些药物不仅 价格比较贵，会让患者产生难以忍受的副作用，而且一旦停止用药，自身免疫反应会立即反 弹，疾病会卷土重来。而廉价的纯化蛋白分子，不仅安全没有毒副作用，更重要的是，它是通 过免疫学途径去启动其自身的调控机制，从根本上解决了问题；相比较于同类的短肽疫苗， 氨基酸序列较长而不易被降解，且具有多个表位，可以联合发挥作用，更易被机体免疫系统 所识别；此外，蛋白分子的制备，一般都是通过生物表达系统(原核或真核表达系统)，而不 是生物合成，这有助于形成蛋白质的高级空间结构，能更有效地形成免疫学表位。已公开的日本血吸虫热休克蛋白60KDa(Schistosoma japonicum heat shock protein60KDa, SjHSP60)基因在 Genebank 中序列号为 AY813151。总之，利用慢性感染中病原体来源的抗原，寻找诱导调节性T细胞的特异分子，不 仅有利于鉴定出导致慢性感染主要因素，从而可以针对性地提高宿主抗感染力，而且在进 一步研究应用于治疗过敏性疾病或自身免疫病方面具有更广阔的前景。

发明内容
本发明旨在提供一种增加⑶4+⑶25+FoXp3+调节性T细胞的蛋白。本发明所说的增加⑶4+CD25+FOXp3+调节性T细胞的蛋白，是日本血吸虫热休克蛋 白60KDa(SjHSP60)，其全长氨基酸序列SEQ. ID. NO. 1所示，由572个氨基酸构成。本发明所说的增加⑶4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的蛋白，还包括缺失了一段多肽 的SJHSP60,即SJHSP60 (D)，SJHSP60 (D)的序列如SEQ. ID. NO. 3所示，由548个氨基酸组成。本发明SEQ. ID. NO. 1所示的蛋白与Genebank中SjHSP60基因(序列号为 AY813151)的蛋白质序列并不完全相同(一致性为87%)。但是SEQ. ID. NO. 1分别 与其它种属同源蛋白中曼氏血吸虫HSP60 (SmHSP60, Genebank号AF310263)和人 类 HSP60 (HomoHSP60, Genebank 号:BC003030)的一致性更高，分别为 92 % 和 72 %，而AY813151的蛋白质序列与SmHSP60和HomoHSP60的一致性分别为81%和65%。这是单克 隆测序与大规模测序的差异所在，本发明是经过“Primer walking”测序拼接后翻译出来的 序列，所以更精确。本发明所说的蛋白SjHSP60，主要通过以下两个途径增加⑶4+⑶25+FOXp3+TregS， 从而增强机体免疫抑制力1.上述所说蛋白诱导⑶4+⑶25T细胞转化为⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs ；2.上述所说蛋白直接使⑶4+⑶25+Tregs发生扩增；本发明公开了 SjHSP60和SjHSP60⑶作为增强CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞抑 制效应的免疫抑制剂的应用。本发明公开了 SjHSP60和SjHSP60(D)在制备治疗免疫反应引起的炎症性疾病药 物中的应用。特别是在制备防治关节炎所致的炎性症状和免疫病理药物中的应用。本发明所说的SjHSP60和SjHSP60 (D)蛋白使扩增后的CD4+CD25+TregS的免疫抑 制力增强。本发明所说的蛋白应用于实验性炎症动物模型中有抑制炎性症状和免疫病理反 应的作用，在治疗免疫性疾病方面具有比较广阔的应用前景。


图ISjHSPeo序列同源性比对分析，天然表达分析。A SjHSP60的全长氨基酸序列，与宿主(人，小鼠)的HSP60进行序列比对；B SjHSP60在虫体中的天然表达情况；表lSjHSP60与宿主(人，小鼠)自身HSP60的交叉性T细胞表位分析。图 2SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。A用SjHSP60体内免疫小鼠，小鼠脾和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例显著增 加；B用SjHSP60体内免疫小鼠，检测小鼠脾和淋巴结中⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例的 流式细胞术检测图；C用SjHSP60体外处理小鼠脾和淋巴结细胞，⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例均发生增 加；D用SjHSP60体外处理小鼠脾和淋巴结细胞，检测⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例的流 式细胞术检测图；图3SjHSP60减轻CIA(胶原性关节炎)小鼠炎性症状和病理损伤。A SJHSP60体内免疫可减轻CIA小鼠关节炎性症状；B SJHSP60体内免疫可减轻CIA小鼠踝关节肿胀度；C SjHSP60体内免疫可减轻CIA小鼠关节周围软组织肿胀和骨关节损害；D SjHSP60体内免疫可减轻CIA小鼠关节及其周围软组织的炎症病理反应；图4SJHSP60增加CIA小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例，抑制炎症抗原 (CollagenII, CII)的特异性体液和细胞免疫应答。A SJHSP60体内免疫CIA小鼠，小鼠脾和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例显著 增加；
B SjHSP60体内免疫CIA小鼠，检测小鼠脾和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例 的流式细胞术检测图；C SjHSP60体内免疫后，CIA小鼠体内针对炎症抗原C II的特异性体液免疫应答 水平明显降低；D SjHSP60体内免疫后，CIA小鼠体内针对炎症抗原CII的特异性细胞免疫应答水 平明显降低图 5HSP60 增力卩 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通过诱导 CD4+CD251 转化为 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。A 用 SjHSP60 处理小鼠 CD4+T，CD4+CD25T 细胞，SjHSP60 诱导 CD4+CD25T 转化为 CD4+CD25+Foxp3+Tregs ；B 用 SjHSP60 处理小鼠 CD4+T，CD4+CD25T 细胞，SjHSP60 诱导 CD4+CD25T 转化为 ⑶4+CD25+Foxp3+Tregs的流式细胞术检测图； 图 6S jHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通过直接扩增 CD4+CD25+Tregs，且扩增 后的⑶4+⑶25+Tregs免疫抑制力更强。A SjHSP60 直接扩增 CD4+CD25+Tregs ；B扩增后的⑶4+CD25+TregS具有更强的免疫抑制力；图 7 :SjHSP60(D)仍可显著增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。A SjHSP60的蛋白质空间结构和表面功能残基(蛋白质-蛋白质作用位点)的预 测和分析；B通过两次PCR得到了接头部分重叠且缺失了 SJMHEl的两个PCR产物；C通过第三次PCR得到了缺失SJMHEl的SjHSP60 (D)；D用SjHSP60⑶体内免疫小鼠，小鼠脾和淋巴结中⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs比例显 著增加；E用SjHSP60(D)体内免疫小鼠，检测小鼠脾和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比 例的流式细胞术检测图；F用SjHSP60(D)体外处理小鼠脾和淋巴结细胞，CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例显著 增加；G用SjHSP60 (D)体外处理小鼠脾和淋巴结细胞，检测CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例 的流式细胞术检测图；图8 去除SjHSP60全长序列中一段多肽(第435到第458个氨基酸，SJMHE1)的 引物设计法和三步PCR示意图。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解为这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相
6同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。本发明实施例中所提及的表达载体pGEX-6p_l可从GE Healthcare公司购买(货 号28-9546-48)。日本血吸虫总cDNA的获取日本血吸虫感染性钉螺(阳性钉螺)购自江苏省血吸 虫病防治研究所。感染性钉螺可以释放出具有感染性的尾蚴(日本血吸虫发育阶段之一， 此阶段具有感染性)从而用来攻击感染实验性小鼠。然后尾蚴在小鼠体内可以继续发育为 童虫，最终发育为日本血吸虫成虫，寄居在小鼠的门静脉系统。剖杀小鼠后，可以通过灌注 小鼠门静脉系统取出成虫，从而可以用来抽提日本血吸虫总RNA，最后再逆转录成日本血吸 虫总cDNA。实施例一 SjHSP60同源性的序列比对分析，交叉性表位分析，及其天然表达的检 测。1、根据Genebank中SjHSP60基因(序列号为:AY813151)全长cDNA序列，先行 设计引物上游引物为5，-cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag-3，(含BamHI酶切位点及 起始密码字 ATG),下游引物为 5，-ccgctcgagattaagagcaggcagtgtttac-3，(含 XholI 酶 切位点及终止密码子TAA)，由上海英潍捷基贸易有限公司(Invitrogen)合成；通过PCR 方法从日本血吸虫总cDNA中扩增SjHSP600RF全长序列，送生物技术公司(上海英潍捷基 贸易有限公司，Invitrogen)测序，并回收PCR产物；测序结果如SEQ. ID. NO. 2所示，再通 过在线生物学工具Biology WorkBenchftittp://workbench, sdsc. edu/)将其翻译成氨基 酸序列；并与人和小鼠的HSP60 (Genebank中基因序列号分别为人HSP60-BC003030，小鼠 HSP60-NM010477)进行序列比对。SJHSP60开放阅读框ORF的全长序列，如SEQ. ID. NO. 2所示，共1719bp。SJHSP60开放阅读框ORF的全长序列翻译后的氨基酸序列为如SEQ. ID. NO. 1所示， 共572个氨基酸。2、综合应用在线表位预测软件IEDB(http://tools, immune印itope. org/main/ index, html)，SYFPEITHI(http://www. syfpeithi. de/home. htm)分析 SjHSP60 分别与人 HSP60,小鼠HSP60的交叉性T细胞表位。3、用 BamHI (NEB, #R3136V)和 XholI (NEB, #R0146V)将质粒 pGEX_6P_l 和此上(1) 中回收的PCR产物进行双酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定后，再分别割胶 回收质粒和PCR片断的双酶切产物；通过T4DNA连接酶(NEB，#M0202S)进行载体和PCR产 物的连接，构建重组表达载体pGEX-SjHSP60 ；转化Ε. coli BL21感受态细胞，37°C培养过 夜后，挑取单克隆菌落，接种于含Amp的LB培养液中，37°C振摇培养过夜后，抽提质粒后行 双酶切鉴定，进一步送测序公司鉴定。鉴定成功后，将菌液进行1 100扩大培养，至OD 值达0. 6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为0. 05mmol/L，37°C诱导表达5h ；收集菌液，4°C 高速离心20min，用IXPBS重悬细菌沉淀；通过超声破碎仪和反复冻融法裂菌；再次4°C 高速离心20min，分别取上清和沉淀，以及未裂解的总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析蛋白的 表达量及分布情况；鉴定为可溶性表达后，通过融合蛋白GST亲和层析法，用Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare, 17-0751-01)进行融合蛋白 GST_SjHSP60 的纯化；并用蛋白 酶PreScission Protease(GE Healthcare, 270843)对融合蛋白进行酶切，最后得到纯化的 SJHSP60 ；经过SDS-PAGE电泳分析纯化结果，纯度> 95%。纯化的SjHSP60交由上海中科院英沐生物科技有限公司制备抗SjHSP60的单克隆抗体(mti-SjHSP60mAb)。制备可溶性 的成虫(SWA)和虫卵抗原(SEA)，通过Weatern Blot实验检测mti_SjHSP60mAb的特异性 和抗体效价；验证成功后，再用mti-SjHSP60mAb，通过免疫组织化学方法，检测日本血吸 虫成虫(雌虫和雄虫)和虫卵中SjHSP60的天然表达和分布情况。结果如图1和表1所示，SjHSP60与人、小鼠HSP60序列上具有高度的同源性，序 列的一致性分别达到72%和70% ；通过T细胞表位预测后，发现SjHSP60，与人HSP60，与小 鼠HSP60，均具有一系列相同或高度相似的MHCI和MHCII类交叉性T细胞表位。表 1 实施例二 SjHSP60体内免疫小鼠或体外剌激小鼠淋巴细胞，观察SjHSP60对 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的影响。1.将实施例一(3)中纯化的 SjHSP60，滤菌并通过 Polymyxin B-Agarose (Sigma， P1411)去除其中的类毒素及其相关分子，然后再通过Limulus amebocyte Iysate(LAL)检 测试剂盒E-TOXATE Kits (Sigma, ET0200)，验证纯化蛋白的内毒素去除效果，< 0. 001FU/ ml(0. lpg/ml)，最后用 DC Protein Assay (BIA-RAD，500-0111)进行蛋白定量。将 SjHSP60 与不完全弗氏佐剂IFA (Sigma，F5501)等体积混合，使SjHSP60浓度为250ug/ml，反复涡悬 振荡混勻。对BALB/c小鼠(SPF级，6-8周龄，雌性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公 司)进行腹股沟皮下免疫，剂量为25ug/100ul/只，首次免疫后，隔两周再同样免疫一次， 设PBS免疫组为对照组。整个过程小鼠饲养于SPF级动物房(南京医科大学实验动物中 心)。末次免疫结束后一周，剖杀小鼠，分离各组小鼠的脾和淋巴结，研磨过滤后，制备成单 细胞悬液；再经红细胞裂解液去除红细胞，制备成单淋巴细胞悬液；进行细胞计数后，对各 组每只小鼠取 IXlO6 个细胞，按 MouseRegulatory T Cell Staining Kit (eBioscience， 88-8111-40)操作说明书进行淋巴细胞的染色标记，再经流式细胞仪FACSCalibur检测 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。2.分离正常BALB/c小鼠的脾和淋巴结，按此上(1)中方法，制备成单淋巴细胞悬液；细胞计数后，分别转移至96孔圆底培养板，5X IO5个细胞/孔；再分三组进行刺激，分 别是 SJHSP60 组(0. lug/ml) /PBS 组 / 无刺激(Medium)组，每组设 4 孔；在 37°C，5% CO2 细 胞孵箱培养3天后，收集各组细胞并进行计数，每组取IX IO6个细胞，同此上(1)中方法检 测 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。结果如图2所示，体内外实验均证明，SJHSP60可以增加⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比 例。实施例三探究SjHSP60能否在炎症模型中发挥抑制炎症及免疫病理反应的作用。1.按实施例二(1)中方法，分两组SjHSP60组/PBS组，体内免疫DBAl小 鼠(南京大学国家遗传工程小鼠资源库，6-8周龄，雌性)。建立胶原诱导型关节炎 (CIA)小鼠模型混合牛源 II 型胶原(CII)Bovine Collagen Type II (BD, 354257)和 Mycobacteriumtuberculosis H37RA(Difco, 3114),用 IXPBS 稀释，使两者浓度分别为 2mg/ml,3mg/ml ；在混合体系中再加入等体积的不完全弗氏佐剂CFA，涡悬振荡仪上混勻 2min,反复6-8次，每隔30min —次；于首次免疫SjHSP60/PBS后一周，在两组小鼠尾部皮 下免疫混合抗原诱导CIA，IOOul/只。诱导后一周，对两组小鼠再分别免疫SjHSP60/PBS — 次。诱导后4周，开始动态观察两组小鼠关节炎症表现，隔天一次；按如下标准进行炎性症 状严重程度评分O分正常，无症状；1分红斑，只有踝关节轻微肿胀；2分红斑，从踝关节到跖骨、掌指关节轻微肿胀；3分红斑，从踝关节到掌指关节中度肿胀；4分红斑，从踝关节到指尖严重肿胀；每侧肢体最高分为4分，最低分为0分；每只小鼠总得分最高为16分，最低为0分。2.与此上(1)中观察时间点同步，使用电子数显游标卡尺(购自温州三和量具仪 器有限公司)测量各组小鼠左后肢踝关节直径。3.诱导后7周剖杀各组小鼠，取各组小鼠前爪固定于含10%福尔马林的IXPBS 中，送标本至上海瑞金医院伤骨科研究所进行X光检测。4. X光检测后，将标本继续固定于含10%福尔马林的IXPBS中，交由江苏省人民 医院病理科进行标本脱钙、石蜡包埋、切片及病理HE染色；显微镜下观察HE病理结果。结果如图3所示，SjHSP60免疫组的CIA小鼠，其关节的炎性症状，关节肿胀度，关 节损害程度以及病理炎症反应都显著减轻。实验例四观察SjHSP60能否增加CIA小鼠⑶4+⑶25+FOXp3+TregS，从而发挥免疫 抑制作用。1.分离CIA诱导后3W和7W各组(HSP60组/PBS组)小鼠脾和淋巴结，按实施例 二(1)中方法，检测各组小鼠⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs比例。2.在剖杀此上(1)中各组小鼠前，对各组小鼠采血，并分离出血清；再经ELISA 检测各组血清中CII特异性抗体(IgG，IgG2a, IgGl)，具体操作是用高亲和力酶标板预 包被CII，5ug/ml，4°C包被过夜；弃去包被液，PBS-T洗板2_3遍；5%脱脂牛奶进行封闭， 200ul/孔，37 °C孵育2小时；弃去封闭液，PBS-T洗板2_3遍；1 20稀释各组血清后，加入酶标板，IOOul/孔，4°C孵育过夜；弃去血清，PBS-T洗板3-4遍；加入稀释后的二抗HRP anti-mouse IgG (Boster，BA1050) 1 10000 稀释，HRP anti-mouse IgG2a (BD, 553391) 和 HRP anti-mouse IgGl (BD，559626)均 1 1000 稀释，IOOul/孔，37 °C 孵育 1 小时；弃 去二抗，PBS-T洗板4-5遍；加入TMB显色液(eBioscience，00-4201-56)，室温避光放置 10-15min后，加入2N H2SO4终止反应，IOOul/孔；最后在酶标仪上进行读值。3.取此上(1)中分离后得到的各组每只小鼠的淋巴细胞，分别转移至96孔圆底 细胞培养板，4 X IO5个/孔，每只小鼠设9个孔，再各分为三组处理=Medium组(不刺激)/ ConA刺激组(2ug/ml)/CII刺激组(5ug/ml)，3孔/组；按实施例四(5)中方法，通过3H掺入 法检测各组淋巴细胞增殖情况培养至56小时，加入氚胸腺嘧啶(3H-thymidine,3H-TDR)， 0. 5 μ Ci/孔；继续培养16小时(总计培养3天)后，经Beckman液体闪烁计数仪检测细胞 的3H-TDR掺入情况，从而反映出CII特异性的细胞免疫应答水平。结果如图4所示，SjHSP60使CIA模型小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例显著增 加；进一步的实验也证明，针对C II特异性的体液和细胞免疫应答都有明显的抑制。实施例五SjHSP60体外分别刺激小鼠CD4+T细胞，⑶4+⑶25—T细胞，进一步观察 SjHSP60 如何增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。分离正常BALB/c小鼠脾和淋巴结，制备成单淋巴细胞悬液；用试剂盒⑶4+T celllsolation Kit (MACS, 130-090-860)分选出 CD4+T 细胞；剩余的 CD4-淋巴细胞经 50ug/ ml丝裂霉素，37°C，5% CO2处理30min后，作为抗原递呈细胞(APC)使用。再取部分⑶4+T 细胞，进一步再用 CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit (MACS, 130-091-041)去除 ⑶4+CD25+TregS，从而分离出⑶4+⑶25—T细胞。具体分选步骤均参照产品说明书。通过流 式细胞术检测⑶4+Τ细胞和⑶4+⑶25—Τ细胞纯度，纯度分别> 90%和> 95%。将两种细胞 分别转移96孔圆底培养板，2 X IO5个细胞/孔，再加入APC, 2 X IO5个/孔；CD4+T细胞和 CD4+CD25—T细胞再各自分两组处理，刺激组(SjHSP60，0. lug/ml)/不处理组(Medium)；在 37°C,5% CO2细胞孵箱培养3天后，收集各组细胞并计数；每组取1 X IO6个细胞，流式细胞 术检测⑶4+⑶25+FOXp3+TregS比例。此实例中相关具体方法可参考实施例二(1)。结果如图5 所示，SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通过诱导 CD4+CD25T 细 胞转化而来。 实施例六观察SJHSP60增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs是否可通过直接扩增 CD4+CD25+Tregs，扩增后的CD4+CD25+Tregs免疫抑制力如何。1.按实施例二(2)中方法分离正常BALB/c小鼠的脾和淋巴结，制备成单淋 巴细胞悬液；用CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit按照说明书步骤分选出 ⑶4+CD25+TregS。参照实施例五中方法，流式细胞术检测⑶4+⑶25+Tregs的细胞纯度，纯度 >95%。转移⑶4+CD25+TregS至96孔圆底细胞培养板，2乂105个细胞/孔；再分三组处 理anti-CD3(BD，553057)刺激组(lug/ml)/SjHSP60 刺激组(0. 5ug/ml)/SjHSP60 (0. 5ug/ ml)+anti-ra3(lug/ml)刺激组，均为5孔/组。按实施例四(3)中方法，通过3H掺入法检 测各组⑶4+⑶25+Tregs的增殖情况。2.按此上(1)中具体方法分选并刺激处理⑶4+CD25+Tregs，培养3天后，收集并计 数；转移至96孔圆底细胞培养板，1 X IO5个/孔，4孔/组。再按实施例五中方法分选正常 BALB/C小鼠⑶€细胞(作为APC使用)和⑶4+CD25T细胞，分别加入每孔⑶4+⑶25+Tregs，IXlO5个/孔。共培养3天后，同样按实施例四(3)中方法，通过3H掺入法检测各组 ⑶4+CD25-T细胞的增殖情况，进而反映各组⑶4+CD25+TregS的抑制力。结果如图6所示，SJHSP60还可通过直接扩增CD4+CD25+Tregs，增加 ⑶4+CD25+Foxp3+Tregs ；且扩增后的⑶4+⑶25+Tregs具有更强的免疫抑制力。实施例七去除SjHSP60全长序列中第435到第458氨基酸的多肽(SJMHEl)后， 得到SjHSP60(D)，观察SjHSP60(D)是否还能增加小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例。1.应用在线蛋白质结构和功能预测软件Phyre server (http//www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre/)，预测SjHSP60蛋白分子的空间结构以及表面功能残基(蛋白_蛋白作 用位点)O2.按附图中图8所示设计引物Pl (5，_3，) cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgagP2(5， _3， ) :cacacctgttcgctgtatgccttcctcaattgctP3(5， _3， ) :attgaggaaggcatacagcgaacaggtgtgcgP4(5， _3， ) ccgctcgagattaagagcaggcagtgttta以实施例一(3)中构建的重组表达载体pGEX_SjHSP60为模板以P1/P2为上下游 引物进行PCR I ；以P3/P4为上下游引物进行PCRII ；两次PCR后，得到了缺失SJMHEl且有 部分重叠的两个PCR产物。3.等摩尔混合此上⑵中PCR I和PCRII产物(质量比大约为3. 5 1)，以此为 模板，以P1/P4为上下游引物，进行PCRIII，得到了缺失SJMHEl的SjHSP60(D)，共1816bp。 其全长cDNA序列和经过翻译出来的氨基酸序列分别为SEQ. ID. NO. 4和SEQ. ID. NO. 3所示。4.回收此上(3)中PCR III产物；按实施例一(3)中方法，用回收的PCR III 产物和PGEX-6P-1构建重组表达载体pGEX-SjHSP60(D)；诱导表达和纯化SjHSP60 (D)； 再进行内毒素的去除和定量验证，最后进行蛋白定量。按实施例二(1)中具体方法，用 S JHSP60 (D)以及多肽SJMHE1(由上海生工公司合成，纯度> 99%，序列如SEQ. ID. NO. 5 所示)体内免疫正常BALB/c小鼠，设PBS免疫组为对照组，检测各组小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。5.按实施例二⑵中方法，用SjHSP60⑶/多肽SJMHE1/PBS体外刺激正常BALB/ c小鼠的脾和淋巴结细胞，检测各组小鼠脾和淋巴结中⑶4+⑶25+FOXp3+TregS比例。结果如图7所示，经过软件预测发现，SjHSP60的三维空间结构表面，除了 SJMHE1， 还存在其它一些功能性残基(蛋白_蛋白作用位点)；进一步体内外实验证明，缺失SJMHEl 的SJHSP60 (D)仍可增加小鼠脾和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例。结合图2分 析，可以发现与SJMHEl相比较，SJHSP60和SJHSP60 (D)体内免疫小鼠(in vivo)增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例的能力更强一些；而体外刺激淋巴细胞(in vitro), SJMHE1, SJHSP60和SjHSP60(D)三者增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例的能力无明显差异。本发明不限于这些公开的实例方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以 及权利要求范围的各种变型和等效变化。
权利要求
一种增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的抗原，是日本血吸虫热休克蛋白60KDa，它的全长氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.权利要求1所说的增加⑶4+⑶25+FoXp3+调节性T细胞的抗原作为增强 ⑶4+CD25+FOXp3+调节性T细胞抑制效应的免疫抑制剂的应用。
3.权利要求1所说的增加CD4+CD25+FOXp3+调节性T细胞的抗原在制备治疗免疫反应 引起的炎症性疾病药物中的应用。
4.权利要求1中所说的增加CD4+CD25+FOXp3+调节性T细胞的抗原在制备防治关节炎 所致的炎性症状和免疫病理药物中的应用。
5.一种增加⑶4+CD25+FOXp3+调节性T细胞的抗原，是缺失了第435至第458个氨基酸 的日本血吸虫热休克蛋白60KDa，它的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
6.权利要求5所说的增加⑶4+⑶25+FoXp3+调节性T细胞的抗原作为增强 ⑶4+CD25+FOXp3+调节性T细胞抑制效应的免疫抑制剂的应用。
7.权利要求5所说的增加CD4+CD25+FOXp3+调节性T细胞的抗原在制备治疗免疫反应 引起的炎症性疾病药物中的应用。
8.权利要求5中所说的增加CD4+CD25+FOXp3+调节性T细胞的抗原在制备防治关节炎 所致的炎性症状和免疫病理药物中的应用。
全文摘要
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种可以增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的血吸虫来源的蛋白抗原分子-日本血吸虫热休克蛋白60KDa(SjHSP60)及其应用。SjHSP60全长氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，与感染宿主的HSP60具有一系列相同或高度相似的交叉性T细胞表位。用SjHSP60体内免疫小鼠或体外刺激小鼠脾、淋巴结细胞，均可显著增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs。在实际应用上，SjHSP60可有效地减轻关节炎所致的炎性症状和免疫病理反应，因此在诱导免疫抑制，应用于治疗免疫性疾病方面具有广阔的前景。
文档编号A61P37/06GK101921325SQ20101013314
公开日2010年12月22日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者刘丰, 周莎, 汪雪峰, 苏川, 贺蕾 申请人:南京医科大学