用dll4拮抗剂治疗自身免疫疾病的方法

专利名称：用dll4拮抗剂治疗自身免疫疾病的方法
用DLL4拮抗剂治疗自身免疫疾病的方法
背景技术：
发明领域此发明涉及使用δ样配体4(D114)拮抗剂治疗疾病、紊乱或病症的方法，其中增加调节T细胞(Treg细胞或Treg)的数量是有益的。更具体地,本发明的方法可通过用D114拮抗剂阻断D114与Notch受体的结合，从而增加Treg的数量，治疗多种自身免疫疾病，例如多发性硬化症和糖尿病，以及器官移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)。
本发明还涉及在具有疾病或紊乱倾向或容易患上疾病或紊乱的受试者中预防这样的疾病或紊乱发生或复发的方法。
相关领域的描述Notch受体及其配体之间的相互作用代表了一条在进化上保守的途径，此途径不仅对细胞命运的决定很重要，而且对调节在造血作用和发育中的胸腺中的·种系决定(lineage decision)很重要(Artavanis-Tsakonas 等人，1999, Science284:770-776;Skokos 等人，2007;J Exp Med 204:1525-1531;和 Amsen 等人，2004,Cellll7:515-526)。最近有研究显示，D114_Notchl抑制导致在T细胞发育的完全阻断，并伴随B细胞的异位出现(ectopic appearance)和树枝状细胞(DC)的扩增，DC是由胸腺内的原 T 细胞到 DC 的命运转化产生(Hozumi 等人，2008，J Exp Med 205(11) : 2507-2513; Koch等人，2008，J Exp Med 205 (11) : 2515-2523;和 Feyerabend等人，2009，Immunity30:1-13)。因此，越来越多的证据表明，Notch信号转导对决定造血祖细胞中的细胞命运决定是至关重要的。此外，已有研究显示了 DC对调节T细胞(Treg)体内平衡的体内反馈控制(Darrasse-JSze 等人，2009，J Exp Med 206 (9) : 1853-1862)。然而，Notch 信号转导在控制DC来源和发育，和因此在Treg体内平衡中的作用仍然未知。这是一个非常重要的问题，因为鉴定诱发Treg扩增的新方法可用于治疗自身免疫疾病和紊乱。人D114(hD114)的核酸和氨基酸序列分别显示在SEQ IDN0:1和2中。D114拮抗剂及其用途在 WO 2007/143689，W02007/070671, WO 2008/076379，WO 2008/042236，和W0/2008/019144 中公开。
发明概述本发明是部分基于发明人的如下观察，即特异性结合D114并阻断D114结合Notch受体的抗体能够完全预防在小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(此为人多发性硬化症的动物模型)的发展，而对照抗体没有预防EAE。此外，发明人已发现，抗D114抗体的此作用与增加的Treg细胞数有关。另外，还观察到，抗D114抗体避免了血糖水平的增加和保持了 NOD/ShiLtJ小鼠(I型糖尿病的动物模型)中的胰岛数和形态，且这些作用至少部分是通过Treg的扩增介导的。因此，在第一个方面，本发明涉及增加Treg细胞数的方法，其包括对有需要的受试者施用有效量的D114拮抗剂，其中所述D114拮抗剂阻断D114和Notch受体之间的相互作用，且Treg细胞数增加。在第二个方面，本发明涉及治疗或减轻疾病、紊乱或病症的方法，其中增加Treg细胞数是有益的，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的D114拮抗剂。本发明的方法可治疗的疾病或紊乱是任意疾病、紊乱或病症，其通过去除、抑制或降低D114活性，从而在治疗的受试者中增加Treg细胞数而受益，即改善、减轻、抑制或预防。这样的疾病、紊乱或病症包括，但不限于，多种自身免疫疾病，例如多发性硬化症，I型和2型糖尿病，类风湿性关节炎，克罗恩氏病，肺出血肾炎综合征，格雷夫斯氏病，格林-巴利综合征(GBS)，桥本病，特发性血小板减少性紫癜，肠易激综合征，红斑狼疮，混合性结缔组织病，重症肌无力，发作性睡病，寻常天疱疮，恶性贫血，多肌炎，原发性胆汁性肝硬化，干燥综合征(SjdgreY s syndrome ),溃疡性结肠炎,血管炎,韦格纳肉芽肿，等等，以及器官移植排斥和GVHD。在一个实施方案中，用于本发明的方法的D114拮抗剂是D114抗体或其片段(“抗D114Ab”或“D114Ab” )，其以高亲和力特异性结合Dl 14，并阻断Dl 14与Notch受体的结合 和/或阻断D114-Notch信号途径。抗体可为多克隆、单克隆(mAb)、嵌合、人源化或全人抗体或其片段。抗体片段可为单链抗体、Fab或(Fab’)2。在一个实施方案中，D114Ab或其抗原结合片段结合hD114(SEQ ID N0:2)的N-端结构域(残基 S27-R172)，或 δ/Serrate/Lag-2 (DSL)结构域(残基 V173-C217)，或N-端-DSL结构域(残基S27-C217)中的表位。在另一个实施方案中，D114Ab或其抗原结合片段结合hD114(SEQ ID NO: 2)的EGF结构域，即约氨基酸残基Q218-N251 (结构域I)，E252-D282 (结构域 2)，D284-E322 (结构域 3)，E324-E360 (结构域 4)，S362-E400 (结构域5)，K402-E438 (结构域6)，H440-E476 (结构域7)，或S480-E518 (结构域8)之一中的表位。在一些实施方案中，抗体或抗体片段可结合涉及超过一种上面枚举的表位的构象表位。用于本发明的方法的D114Ab或其片段能够以高亲和力结合人D114，并具有通过表面等离子共振测量的约InM或更低，约500pM或更低，约300pM或更低，约200pM或更低，约IOOpM或更低，或约50pM或更低的平衡解离常数(Kd)。在一个实施方案中，D114Ab或其片段包含重链可变区(HCVR)，其包含3个重链互补决定区，HCDR1，HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID NO: 22，24和26的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含轻链可变区(LDVR)，其包含3个轻链互补决定区，IXDRl，LCDR2和LCDR3，分别具有SEQ ID NO: 30，32和34的氨基酸序列。在另一个实施方案中，D114Ab或其片段包含重链和轻链CDR序列，所述CDR序列包含SEQ ID NO: 22，24，26，30，32和34的⑶R序列组合。在另一个实施方案中，D114Ab包含HCVR，其包含SEQ IDN0:20或116的氨基酸序列，或D114Ab包含LCVR，其包含SEQ IDNO: 28或118的氨基酸序列。在另一个实施方案中，D114Ab 包含 SEQID NO: 20/28 (REGN281)或 116/118 (REGN421)的 HCVR/LCVR组合。在某些实施方案中，D114Ab包含选自下述的重链⑶Rl/⑶R2/⑶R3组合和轻链 CDR1/CDR2/CDR3 组合SEQ ID NO:6/8/10 和 SEQ ID NO: 14/16/18，分别地；SEQ IDNO:38/40/42和 SEQ IDNO: 46/48/50，分别地；SEQ ID NO: 54/56/58和 SEQ ID NO:62/64/66,分别地；SEQ ID NO:70/72/74 和 SEQ ID NO: 78/80/82，分别地；SEQID NO: 86/88/90 和 SEQID NO: 94/96/98，分别地;和 SEQ IDNO: 102/104/106 和 SEQ ID NO: 110/112/114，分别地。在另一个实施方案中，D114Ab包含HCVR，其包含SEQ ID NO: 4，36，52，68，84，或100的氨基酸序列，或LCVR，其包含SEQ ID NO: 12，44，60，76，92，或108的氨基酸序列。在另一个实施方案中，D114Ab 包含选自SEQID NO: 4/12 (REGN279) ; SEQ ID NO: 36/44 (REGN290) ; SEQIDNO:52/60(REGN306);SEQ ID NO:68/76(REGN309);SEQ ID NO:84/92(REGN310);和SEQ IDNO: 100/108 (REGN289)的 HCVR/LCVR 组合。编码SEQ ID N0:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116 和 118 的氨基酸序列的核苷酸序列分别显示在 SEQ IDN0:3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115 和 117 中。
在另一个实施方案中，可用于本发明的方法的D114拮抗剂是融合蛋白，其包含与多聚化成分(multimerizing component)融合的至少一种可溶性Notch受体或其能够结合D114的片段。在一个实施方案中，可溶性Notch受体是人Notchl或Notch4。在另一个实施方案中，本发明的D114拮抗剂是能够结合Notch受体的修饰的D114蛋白，但这样的结合不导致受体的活化。在某些实施方案中，本发明的D114拮抗剂是融合蛋白，其包含与多聚化成分，例如免疫球蛋白结构域，例如，人IgG的Fe结构域融合的D114的细胞外结构域或其片段。在某些实施方案中，D114拮抗剂包括可阻断D114-Notch相互作用的小分子和其他试剂。在第三个方面,本发明涉及在具有患上疾病或紊乱的倾向或容易患上疾病或紊乱的受试者中预防或降低自身免疫疾病或紊乱发生或复发的方法，其包括对受试者施用预防有效量的D114拮抗剂。在相关的实施方案中，本发明的另一特征是在移植接受者中预防或降低器官移植排斥或GVHD的方法，其包括在移植前和/或移植后对接受者施用预防有效量的Dl 14拮抗剂。在第四个方面，本发明涉及预防、治疗或减轻自身免疫疾病或紊乱，或器官移植排斥的方法，其包括对有需要的受试者施用有效量的D114拮抗剂和另外的治疗剂的组合，例如，免疫抑制剂(immunosuppressive agent)或免疫抑制剂(immunosuppressant),抗炎剂，镇痛剂，降血糖剂(例如，胰岛素，胰岛素类似物，等等)，其中多种治疗剂可能具有彼此重叠的治疗效果。用于与D114拮抗剂组合的合适的免疫抑制剂包括，但不限于，糖皮质激素，环孢菌素，甲氨蝶呤，干扰素β (IFN-β)，他克莫司，西罗莫司，硫唑嘌呤，巯嘌呤，阿片样物质，霉酹酸酯，TNF结合蛋白，例如英夫利昔单抗(infliximab),依那西普(eternacept),阿达木单抗，等等，细胞毒性抗生素，例如放线菌素D，蒽环类，丝裂霉素C，博来霉素，光辉霉素，等等，靶向免疫细胞的抗体，例如抗CD20抗体，抗CD3抗体，等等。用于与抗D114拮抗剂组合治疗的合适的抗炎剂和/或镇痛药包括，皮质类固醇，非留体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林，布洛芬，萘普生等等，TNF-α拮抗剂，IL-I拮抗剂，IL-6拮抗剂，对乙酰氨基酚，吗啡类似物，等等。在第五个方面，本发明涉及药物组合物，其包含D114拮抗剂，至少一种另外的治疗剂，和可药用的载体。在一个实施方案中，D114拮抗剂是以高亲和力特异性结合D114并中和D114活性的D114Ab或其片段，至少一种另外的治疗剂是任意上述免疫抑制剂，抗炎
齐U，镇痛药，降血糖剂，等等。在第六个方面，本发明涉及试剂盒，其包含容纳本发明的药物组合物的容器，和具有使用说明的说明书(package insert)。在一个实施方案中,试剂盒可包含容纳特异性结合hD114的抗体或其片段的容器，和容纳至少一种上述另外的治疗剂的另一个容器。通过以下发明详述的综述，其他目的和优势将变得显而易见。
附图简述

图1A-1B显示了 Dl 14阻断对T细胞和B细胞发育的影响。对小鼠注射抗Dl 14抗体(REGN577)或对照人Fe片段(hFc)。14天后，收获胸腺，通过流式细胞术评估T细胞和 B细胞亚群。图1A:显示⑶4_CD8_(双阴性胸腺前体或“DN”)，^4+^8+(双阳性胸腺前体或“DP”)，CD4+或CD8+(单阳性胸腺前体或“SP”)，和DN/CD44+CD25—(处于DNl阶段的胸腺前体)T细胞数的点图。点图中的数字代表T细胞亚群在全部胸腺细胞中的百分比(平均值土SEM)。图1B:显示B细胞(B220+)在DNl细胞中的百分比(平均值土SD)的柱状图(即，用 CD4TD8XD44+CD25-门控)。图2A-2B显示了 Dl 14阻断对骨髓中的B细胞发育阶段(图2A)和对脾中的B细胞体内平衡(图2B)的影响。点图中的数字代表B细胞亚群在骨髓或脾中的全部细胞中的百分比(平均值土SEM)。GC:生发中心B细胞；T1和T2:B细胞亚群；M:边缘B细胞；和Fo:滤泡B细胞。图3A-3D显示了 D114阻断对树突细胞(DC)发育的影响。图3A:显示在抗D114Ab处理后，在胸腺中的传统 DC (“cDC”; B220XD1IC+)和浆细胞样 DC (“pDC”; roCAl+B220+CDl IC+)的扩增。点图中的数字代表在第14天时，DC在全部细胞中的平均百分比(平均值土SEM)。图3B:条形图显示在D114 Ab处理的小鼠(■)和hFc对照处理的小鼠(口)的胸腺中的cDC和pDC扩增的动力学。图3C:点图显示D114Ab对胸腺中的DC前体细胞(MHcnkcDllcintCDlSS+Sirp-Ciint)和晚期DC前体细胞(MHCnkCDllcint)的影响。点图中的数字代表在第14天时，DC前体细胞在全部细胞中的平均百分比(平均值土SEM)。图3D:点图显示MHCnlTDllcintDC在用D114Ab处理的小鼠的胸腺中的DNl (⑶4TD8XD44+⑶250原T细胞群中存在，但在用hFc对照Ab处理的小鼠的胸腺中不存在。点图中的数字代表在第3天时，MHCIIloCDlIcintDC在DNl原T细胞群中的平均数(平均值土SEM)。图4显示了 D114阻断对源自T/DC DNl共同祖细胞的胸腺内可变(alternative)DC系发育为未成熟DC(imDC)的影响。将DNl⑶45. I+LirT分选细胞转移到用D114Ab( ■)或hFc对照Ab ( □)处理的⑶45. 2+宿主小鼠的胸腺内。图5显示了 D114阻断对参与DC发育的关键细胞因子，CSF_1 (M-CSF)的血清水平的影响。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量未处理的(國)，或用同种型对照Ab(D)或D114Ab( ■)处理的小鼠的血清CSF-I水平。图6显示了在用三苯氧胺(TAM)处理后，遗传D114缺失对包含三苯氧胺诱导的Cre重组酶构建体，CreERT2的DLL4C0IN小鼠中的B细胞和DC体内平衡的影响。点图中的数字代表B细胞、以及pDC和cDC 二者在胸腺中的全部细胞中的平均百分比(平均值土 SEM)。图7A-7C显示了 Dl 14阻断/缺失对Treg体内平衡的影响。图7A:点图显示相比用hFc对照Ab处理的小鼠，在用D114-Ab处理2周的小鼠的胸腺内的Treg的扩增。点图中的数字代表Treg在胸腺中的CD3+CD4+T细胞中的平均百分比(平均值土 SEM)。图7B:条形图分别显示在用D114Ab(_)和hFc对照Ab(D)处理的小鼠的胸腺(上图)和脾(下图)中的Treg发育的动力学。图7C:点图显示相比用玉米油对照处理的对照DLL4C0IN，在用三苯氧胺(TAM)处理的DLL4C0IN小鼠的胸腺内的Treg的扩增。点图中的数字代表Treg在胸腺中的⑶3+⑶4+T细胞中的平均百分比(平均值土SEM)。图8A-8B显示了在每周2次持续2周用D114_Ab (REGN421)处理(lmg/kg或5mg/kg)或hFc处理(5mg/kg)后，在第7和14天，和在处理停止后第28天观察到的D114阻断对表达人D114(hD114)的小鼠胸腺中的DC(图8A)和Treg体内平衡(图8B)的影响。点图中的数字代表PDC和cDC(图8A)或Treg (图8B)在胸腺中的全部细胞中的平均百分比(平均值土 SEM)。图9A-9B显示了 D114阻断在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中的影响。图9A:图表显示了每个处理组的EAE发病率(%)。图9B:图表显示了基于平均疾 病评分的EAE的发展。处理为用抗D114Ab(REGN577)预诱导(▼);同种型对照Ab预诱导(□ ) ； REGN577 后诱导(▲);或抗 VLA-4AL· (PS/2)预诱导(■)。图10显示了 D114阻断对EAE小鼠淋巴结中的IL-17和IFN-Y产生的影响。通过ELISA在第12和18天测量了用D114Ab ( ■)或hFc对照Ab ( □)处理的EAE小鼠淋巴结中的IL-17(左图)和IFN-Y (右图)的水平。图11A-11E显示了 D114Ab在NOD小鼠糖尿病模型中的影响。图IlA显示了接受hFC对照Ab ( ·)或抗D114Ab (REGN577) ( ■)的9周龄小鼠中的％糖尿病发生率(血糖水平2次连续测定高于250mg/dL)。也显示了用D114Ab处理和之后在20周时注射PC61Ab的5只小鼠的％糖尿病发生率(□ )。PC61Ab是抗⑶25抗体并消耗Treg细胞。图IlB显示了通过ELISA测量的相比未处理的野生型(WT)小鼠，在用D114Ab或hFc对照处理的NOD小鼠中的抗胰岛素自身抗体(口 )和抗谷氨酸脱羧酶65(GAD65)自身抗体(■)的产生。图IlC显示了用D114Ab (左图)或hFc对照(右图)处理的NOD小鼠的苏木精和伊红(H&E)染色的胰腺切片。黑色箭头指示单独的胰岛，白色箭头指示胰岛内的浸润细胞(右图)。图IlD显示了在用hFc对照处理的(□)或D114Ab处理的(■)小鼠胰腺中的胰岛数(左图)或％浸润的胰岛(右图)。图IlE显示了在处理后42天在疾病发作时用D114Ab( ·)或hFc对照(口)处理的小鼠中的血糖水平的改变。
发明详述在描述本方法以前，应当理解，此发明不受限于描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可改变。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，无意为限制性的，因为本发明的范围仅受限于随附的权利要求书。如在此说明书和随附的权利要求书中所使用的，单数形式“一个”，“一种”，和“所述”包括复数形式，除非上下文明确地另外指出。因此例如，提及“一种方法”包括本文描述的，和/或在阅读了此公开后对本领域技术人员显而易见的类型的一种或多种方法，和/或步骤。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与此发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。尽管可使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任意方法和材料实践或检验本发明，现在描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物以其整体引入本文作为参考。
定义术语“D114拮抗剂”，如本文使用的，包括能够阻断D114结合Notch受体(例如Notchl和Notch4)和/或阻断Dl 14-Notch信号途径(见，例如，WO 2008/076379)的针对D114的抗体及其片段，包含与多聚化成分融合的D114细胞外结构域的融合蛋白，或其片段(见例如，美国专利公开号2006/0134121和2008/0107648)，阻断D114和Notch受体之间的相互作用的肽和肽体(peptibody)(见,例如,美国专利号7，138,370)，等等。因此,在某些实施方案中，所述术语也包含拮抗剂，例如特异性结合Notch受体(例如，抗Notchl抗体，抗Notch4抗体，等等)和阻断D114-Notch信号途径的小分子，抗体或其抗原结合片段，
坐坐寸寸ο·术语〃抗体〃，如本文使用的，旨在指免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键相互连接的4条多肽链，2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文简称为HCVR或Vh)和重链恒定区(Ch)。重链恒定区包含3个结构域，ChI，CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文简称为LCVR或VJ和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，Q。Vh和'区可进一步细分为名为互补决定区(CDR)的高变区，在其中穿插更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个Vh和 '由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列FR1, CDRl，FR2, CDR2, FR3, CDR3,和 FR4。鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域已知的，其可用于鉴定在本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR边界的常规方法包括Kabat定义，Chothia定义，和AbM定义。一般来说，Kabat定义是基于序列可变性,Chothia定义是基于结构环区的位置，AbM定义是Kabat和Chothia方法的折衷。见,例如，Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest, "National Institutesof Health, Bethesda, Md. (1991) ; Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol. 273 :927-948(1997);和Martin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272(1989)。用于鉴定抗体内的 CDR 序列的公共数据库也是现有的。也可以取代一个或多个⑶R残基或省略一个或多个⑶R。在科学文献中已经描述了如下抗体，其中可省去I或2个CDR用于结合。Padlan等人(1995 FASEB J. 9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体及其抗原之间的接触区，并得出结论，仅约1/5至1/3的CDR残基实际接触抗原。Padlan也发现许多抗体中有I或2个CDR不含与抗原接触的氨基酸(又见，Vajdos 等人 2002J Mol Biol 320:415-428)。可基于以前的研究(例如，⑶RH2中的残基H60-H65经常是不需要的)，通过分子建模和/或实验方法从位于Chothia⑶R之外的Kabat⑶R区中鉴定不接触抗原的⑶R残基。如果省略CDR或其残基，其通常被取代为占据另一种人抗体序列或这些序列的共有序列的对应位置上的氨基酸。也可实验选择在CDR内的取代位置和用于取代的氨基酸。实验取代可为保守或非保守取代。术语“抗体”也包括具有修饰的糖基化模式的抗体。在一些应用中，去除不期望的糖基化位点的修饰可能是有用的，或例如，去除海藻糖部分以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(见Shield等人(2002) JBC 277:26733)。在其他应用中，去除N-糖基化位点可降低针对治疗抗体的不期望的免疫应答，或提高抗体的亲和力。在其他应用中，可进行半乳糖基化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。术语抗体的"抗原结合片段"(或简单地"抗体片段”)，如本文使用的，指保留特异性结合hD114、或任意其他预期靶蛋白的能力的抗体的一种或多种片段。抗体片段可包括Fab片段，F(ab’)2片段，Fd片段，Fv片段，单链Fv(scFv)分子，dAb片段，由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，包含CDR的片段，或分离的CDR)。其他工程分子，例如双抗体(diabody),三链抗体(triabody),四链抗体(tetrabody)和微抗体(minibody),也包括在如本文使用的措辞“抗原结合片段”中。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可缀合治疗部分(“免疫缀合物”)，例如细胞毒素，化疗药物，免疫抑制剂或放射性同位素。抗体的抗原结合片段将一般包含至少一个可变结构域。可变结构域可为任意大小或氨基酸组成，并通常包含至少一个⑶R，所述⑶R与一种或多种框架序列相邻，或位于同 一读框(in frame with)。在具有Vh结构域和Vlj结构域相连的抗原结合片段中,Vh和Vlj结构域可彼此处于任意合适的排列。例如，可变区可为二聚的并包含VH-VH，Vh-'或二聚体。可选地，抗体的抗原结合片段可包含单体Vh或\结构域。在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含至少一个可变结构域，所述可变结构域与至少一个恒定结构域共价连接。在本发明的抗体的抗原结合片段内可见的可变和恒定结构域的非限制性代表构型包括WVh-ChI; (ii)VH-CH2; (iii)VH-CH3; (iv)Vh-ChI-Ch2; (v)Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3 ; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-ChI ; (ix)VL-CH2; (x)Vl-Ch3 ; (xi)VL-CHl-CH2; (xii)VL-CHl-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3;和(xiv) Vl-Clo 在包括上面列出的任意代表构型的可变和恒定结构域的任意构型中，可变和恒定结构域可彼此直接连接，或通过完全或部分的铰链或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如，5，10，15，20，40，60个或更多)氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间的灵活(flexible)或半灵活的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含上面列出的任意可变和恒定结构域构型与另一种上述构型和/或与一个或多个单体Vh或\结构域非共价连接(例如，通过二硫键)的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。如同全抗体分子，抗原结合片段可为单特异性或多特异性的(例如，双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少2个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域现有的常规技术，任意的多特异性抗体形式可经改变以适用于本发明的抗体的抗原结合片段的情况。术语〃人抗体"，如本文使用的，旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人HiAb可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)，例如在CDR、特别是CDR3中的。然而，术语〃人抗体"，如本文使用的，不旨在包括下述mAb，其中在人FR序列上嫁接来源于另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)种系的CDR序列。本文公开的全人抗D114抗体可包含相比对应种系序列，在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中的一种或多种氨基酸取代、插入和/或缺失。通过比较本文公开的氨基酸序列和从例如公共抗体序列数据库中得到的种系序列，可容易地确定这样的突变。本发明包括来源于本文公开的任意氨基酸序列的抗体，及其抗原结合片段，其中在一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被突变为抗体来源种系序列的对应残基，或另一种人种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸取代(这样的序列改变在本文中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可容易地产生许多包含一个或多个独立的种系回复突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，在Vh和/或' 结构域内的所有框架和/或CDR残基被回复突变为在抗体所来源的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅某些残基被回复突变为原始的种系序列，例如，仅在FRl的最初8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内的突变残基，或仅在CDR1，CDR2或CDR3内的突变残基。在其他实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基被突变为不同种系序列(即，与抗体最初来源的种系序列不同的种系序列)的对应残基。此外，本发明的抗体可包含在框架和/或CDR区内的2个或多个种系突变的任意组合，例如，其中某个单独的残基被突变为特定种系序列的对应残基，而某个与原始种系序列不同的另外的残基被保留或被突变为不同种系序列的对应残基。一旦得到，可容易地检测包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种期望性能，例如改进的结合特异性、提高的结合亲和力、改进或增强的拮抗或激动生物性能(视情况而定)、降低的免疫原性，等等。以此一般方式得到的抗体和抗原结合片段包括在本发明中。本发明也包括下述抗Dl 14抗体，其包含本文公开的任意HCVR，LCVR,和/或⑶R氨基酸序列的具有一种或多种保守取代的变体。例如，本发明包括下述抗D114抗体，其具有相对本文公开的任意HCVR，LCVR,和/或CDR氨基酸序列，具有例如，10个或更少，8个或更少，6个或更少，4个或更少，2个或I个保守氨基酸取代的HCVR，LCVR,和/或⑶R氨基酸序列。在一个实施方案中，HCVR包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，其中具有8个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQ ID N0:116的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQID NO: 116的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，其中具有2个或I个保守氨基酸取代。在一个实施方案中，LCVR包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列，其中具有8个或更少的 保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQ ID N0:118的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQ IDNO: 118的氨基酸序列，其中具有2个或I个保守氨基酸取代。“中和”或“阻断”抗体，旨在指下述抗体，其与D114的结合导致D114生物活性的抑制。可通过测量D114生物活性的一种或多种指示，评估此D114生物活性的抑制。可通过本领域已知的若干标准体外或体内测定评估D114生物活性的这些指示。例如，通过D114结合Notch受体的抑制评估抗体中和D114活性的能力。同样地，术语也适用于针对其他靶，例如Notchl和Notch4的抗体；这样的抗体抑制靶的生物活性，从而抑制D114_Notch相互作用或信号途径。
术语"特异性结合"等等，指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过至少约Ix KT6M或更低的平衡解离常数表征(例如，较小的Kd表示较紧密的结合)。测定2个分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的，包括，例如，平衡透析，表面等离子共振，等等。然而，特异性结合hD114的分离的抗体可展示对其他抗原，例如其他物种的D114分子的交叉反应性。此外，虽然如此，认为结合hD114和一种或多种其他抗原的多特异性抗体(例如，双特异性)是如本文使用的"特异性结合〃hD114的抗体。术语〃KD〃，如本文使用的，旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。术语“高亲和力”抗体指以表面等离子共振，例如，BIAC0RE 或溶液-亲和ELISA测量的约InM或更低，约500pM或更低，约400pM或更低，约300pM或更低，约200pM或更
低，或约IOOpM或更低，或约50pM或更低的Kd结合Dl 14的抗体。术语〃表面等离子共振〃，如本文使用的，指通过检测生物传感器矩阵内的蛋白质浓度的改变，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAC0RE 系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 和 Piscataway, N. J.)。术语〃表位〃是与抗体结合的抗原区。表位可被定义为结构或功能的。功能表位一般是一组结构表位，并具有对相互作用的亲和力有直接贡献的残基。表位也可为构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括决定簇，决定簇是分子的化学活性表面基团，例如氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基，在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位在独特的空间构象中一般包括至少3个，和更通常地，至少5个或8-10个氨基酸。术语“治疗”，如本文使用的，除非另外说明，旨在指预防(或预防性)和治疗程序。需要治疗的受试者不仅包括已患上特定病症、紊乱或疾病的受试者，而且包括具有患上这样的病症、紊乱或疾病的倾向或容易患上这样的病症、紊乱或疾病的受试者，所述受试者受益于预防程序，从而相比未作治疗的受试者，降低了这样的病症、紊乱或疾病的发生或复发，或发展(如果发生的话)。短语“治疗有效量”，“预防有效量”，或“有效量”指产生施用的期望效果的量。精确的量将取决于治疗目的、接受治疗的受试者的年龄和体型(size)、施用途径，等等，可由本领域技术人员使用已知技术确定(见，例如，Lloyd(1999)The Art, Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)。
一般描述本发明是部分基于以下发现，即通过D114-特异性抗体阻断D114导致Treg细胞数增加，其进而预防、减轻或延缓小鼠中的EAE或糖尿病的发展。有关全人D114Ab，包括重组人D114Ab的描述，见国际专利公开号WO 2008/076379。
治疗施用和制剂本发明提供了预防、治疗或减轻疾病或紊乱的方法，其中增加Treg细胞数是有利的，所述方法包括施用治疗有效量的包含D114拮抗剂，例如D114Ab的药物组合物。包含D114拮抗剂的药物组合物还可包含一种或多种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂，抗炎齐U，镇痛剂，降血糖剂，等等(见以下章节)。依照本发明的治疗组合物可与合适的载体、赋形剂和掺入制剂以提供改进的转移、递送、耐受性等的其他试剂一起施用。许多合适的制剂可见所有药物化学家已知的药典Remington’s Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Company, Easton, PA。这些制剂包括,例如，粉末,糊剂，药膏，凝胶剂,腊类，油类，脂类，含脂(阳离子或阴离子)小泡(例如LIPOFECTIN )，DNA缀合物，无水吸收糊齐U，水包油和油包水乳剂，乳剂聚乙二醇(多种分子量的聚乙二醇)，半固体凝胶，和含聚乙二醇的半固体混合物。又见 Powell 等人〃Compendium of excipients for parenteralformulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。用于全身施用，最初可通过体外测定估计治疗有效剂量。例如，可在动物模型中制定剂量以得到循环浓度范围，范围中包括在细胞培养物中测定的IC5(I。这样的信息可用于更准确地确定人中的有效剂量。也可使用本领域熟知的技术，从体内数据，例如动物模型估计初始剂量。
本领域普通技术人员基于动物数据可容易地优化对人的施用。 剂量可根据待施用的受试者的年龄和体型(例如，体重或体表面积)、靶疾病、病症、施用途径，等等而变化。用于D114拮抗剂，特别是用于D114抗体的全身施用，用于静脉内施用的一般剂量范围是约O. 01至约100mg/kg体重,约O. I至约50mg/kg,或约O. 2至约10mg/kg的每日剂量。用于皮下施用，可以约Img至约800mg,约IOmg至约500mg,约20mg至约400mg,约30mg至约300mg,或约50mg至约200mg,以至少约25mg/ml,约50mg/ml,约75mg/ml,约 100mg/ml,约 125mg/ml,约 150mg/ml,约 175mg/ml,约 200mg/ml,或约 250mg/ml的抗体浓度，至少，每天I至5次，每周I至5次，或每个月I至5次施用抗体。可选地，最初可通过静脉内注射施用抗体，随后通过相继的皮下施用。多种递送系统是已知的，并可用于施用本发明的药物组合物，例如，在脂质体中封装、微粒、微囊、能够表达突变病毒的重组细胞，受体介导的胞吞(见，例如，Wu等人(1987)J.Biol. Chem. 262:4429-4432)。引入方法包括，但不限于，真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可通过任意方便的途径施用组合物，例如通过输注或团注注射，通过经上皮或粘膜皮肤层(lining)(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等等)吸收，也可与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身或局部的。也可在小泡，特别是脂质体中递送药物组合物(见Langer (1990) Science249:1527-1533;Treat 等人(1989)在 Liposomes in the Therapy of InfectiousDisease and Cancer 中，Lopez Berestein 和 Fidler(编)，Liss, New York,pp. 353-365; Lopez-Berestein,同上，pp. 317-327; 一般同上)。在某些情况下，可在受控的释放系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(见 Langer,见上；Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料；见，Medical Applications of Controlled Release, Langer和Wise(编)，CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974)。在另一个实施方案中，受控的释放系统可位于组合物的祀附近，因此仅需要部分全身剂量(见,例如，Goodson, in MedicalApplications of controlled Release,见上，vol. 2, pp. 115-138,1984)。可注射的制品可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射，点滴输注等的剂型。可通过公知方法制备这些可注射的制品。例如，可通过例如，在传统用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体及其盐制备可注射的制品。作为用于注射的水性介质，可使用例如，生理盐水，含葡萄糖和其他助剂的等渗溶液，等等，其可与合适的增溶剂例如醇(例如，乙醇)，多元醇(例如，丙二醇，聚乙二醇)，非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80，HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]，等等组合使用。作为油性介质，可使用例如芝麻油，大豆油，等等，其可与增溶剂例如苯甲酸苄酯，苯甲醇，等等组合使用。优选地在合适的安瓿中装满这样制备的注射剂。可使用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。另外，有关皮下递送，笔式递送装置(pen deliverydevice)可容易地用于递送本发明的药物组合物。这样的笔式递送装置可为可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用可替换的包含药物组合物的盒。一旦盒内的所有药物组合物被施用，盒变空，可容易地丢弃空盒并替换为包含药物组合物的新盒。然后可重复使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中没有可替换的盒。相反地，一次性笔式递送装置预先装满在装置内的容器中储存的药物组合物。一旦容器中的药物组合物耗尽，就丢弃整个装置。许多可重复使用的笔式和自我注射器递送装置可用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括，但当然不限于AUT0PEN (0wen Mumford, Inc. , Woodstock, UK), DISETRONIC pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX75/25 pen, HUMALOG pen, HUMALIN 70/30 pen(EliLilly 和 Co·， Indianapolis, IN)，NOVOPENtmI, II 和 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), N0V0PEN JUNIOR (NovoNordisk, Copenhagen, Denmark), BD pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ),0ΡΤΙΡΕΝ ,0ΡΤΙΡΕΝ PRO ,OPTIPEN STARLET ,和 0PTICLIK (sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)，仅举出这几个例子。可用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括，但当然不限于 S0L0STAR pen (sanof i-aventis), FLEXPEN (Novo Nordisk),和 KWIKPEN (EliLilly)。有利地，将用于上述口服或胃肠外使用的药物组合物制成适应活性成分剂量的单位剂量剂型。这样的单位剂量剂型包括，例如，片剂，丸剂，胶囊，注射剂(安瓿)，栓剂，等等。包含的D114拮抗剂，例如D114抗体的量一般为每单位剂量剂型约O. I至约800mg;特别地在注射剂剂型中，优选包含的抗体为约5至约lOOmg，用于其他剂型约10至约250mg。在某些实施方案中，可能期望对需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合物；这可通过例如(但不用于限制)手术期间的局部输注，局部应用，例如，通过注射，通过导管或通过植入物实现，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜，纤维或商业皮肤替代品。
组合治疗在本发明的治疗方法中，D114拮抗剂可单独提供，或与一种或多种另外的治疗剂组合提供，例如免疫抑制剂或免疫抑制剂，抗炎剂，镇痛剂，直接或间接降血糖剂，等等。合适的免疫抑制剂包括，但不限于，糖皮质激素，环孢菌素，甲氨蝶呤，干扰素β (IFN-β)，他克莫司，西罗莫司，硫唑嘌呤，巯嘌呤，阿片样物质，霉酚酸酯，TNF结合蛋白，例如英夫利昔单抗，依那西普，阿达木单抗，等等，细胞毒性抗生素，例如放线菌素D，蒽环类，丝裂霉素C，博来霉素，光辉霉素，等等，靶向免疫细胞的抗体，例如抗CD20抗体，抗CD3抗体，等等。用于与抗D114拮抗剂组合治疗的合适的抗炎剂和/或镇痛药包括，皮质类固醇，非留体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林，布洛芬，萘普生等等，TNF-α拮抗剂(例如，Centocor Inc.的英夫利昔单抗或IBMICADE㊣;Centocor Inc.的戈利木单抗；Amgen/Wyeth的依那西普或BNBREL⑩;Abbott Laboratories的阿达木单抗或HUMIRA ,等等)，IL-1拮抗剂(例如，IL-I 结合融合蛋白，例如，Regeneron Pharmaceuticals, Inc.的ARCALYST ,见美国专利号6，927，044; Amgen的KINERET ,等等)，IL-6拮抗剂(例如，在美国专利号7，582，298中公开的抗IL-6受体抗体，和Roche的ACTEMRA ),对乙酰氨基酚，吗啡类似物，等等。合适的降血糖剂包括，但不限于，胰岛素及其类似物，双胍类，磺胺类药物及其尿素衍生物，α -葡糖苷酶抑制剂,噻唑烧二酮(thiazolidinedione)及其衍生物,二肽基肽酶-4抑制剂，瓜尔豆胶，瑞格列奈，那格列奈，艾塞那肽(exenatide),普兰林肽,苯氟雷司，利拉鲁肽，米格列奈，醛糖还原酶抑制剂，等等。 D114拮抗剂，例如hD114Ab或其片段，和上述另外的治疗剂可一起或分别地共同施用。当使用单独的剂量制剂时，本发明的抗体或其片段和其他试剂可同时施用，或在交错的时间分别施用，即以合适的顺序相继施用。
试剂盒本发明还提供了制成品或试剂盒，其包含包装材料、容器和包含在容器中的药物试剂，其中所述药物试剂包含至少一种D114拮抗剂，例如D114抗体，和至少一种另外的治疗剂，且其中所述包装材料包含显示适应症和使用说明的标签或说明书。在一个实施方案中，D114拮抗剂和另外的治疗剂可包含在单独的容器中。
实施例提供以下实施例以为本领域普通技术人员提供如何产生和使用本发明的方法和组合物的完全公开和描述，且无意限制发明人视作其发明的范围。已经努力确保有关使用的数字(例如，量、温度等等)的准确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，部分是以重量计的部分，温度是以摄氏度计的，压力是在大气压下或接近大气压下，图的误差条=平均值土 SEM。在以下实施例中，用于流式细胞术的目的，使用在补充3%FCS的Dulbecco’ sPBS ( GI B(X)(K) INVITROGEN ) IX中的以下抗体染色细胞用于DC，分别用针对信号调节蛋白 a (Sirp- α ;货号 Ρ84; BDBiosciences)，Β220 (货号 RA3-6B2)，PDCA-I (货号eBio927)，CD8(货号 53-6. 7)，CDllb (货号 Ml/70)，MHCII (货号 M5/114. 15. 2) ,CDllc (货号N418),和CD135(货号A2F10)的抗体；用于T，B和NK细胞，分别用针对CD4 (货号GKl. 5或 L3T4)，CD3(货号 145-2C11)，CD25(货号 PC61 或 7D4)，CD44(货号 IM7)，FoxP3(货号FJK16s);和 F4/80(货号 ΒΜ8)，ΝΚ1· I (货号 ΡΚ136)，IgM(货号 11/41)，IgD (货号 26-llc)，CD43(货号 S7)，CD21(货号 eBio4E3)，HSA (货号 M1/69)，和 CD23 (货号 B3B4)的抗体(均来自 eBioscience) ο
实施例1:D114阻断对B细胞，树突细胞和T细胞发育的影响据显示，D114_Notchl抑制导致T细胞发育的完全阻断，并伴随B细胞的异位出现和树突细胞(DC)的扩增，DC是由胸腺内的原T细胞到DC的命运转化产生(Hozumi等人，2008，J Exp Med 205 (11) : 2507-2513; Koch 等人，2008，J Exp Med 205 (11) : 2515-2523;和Feyerabend等人,2009, Immunity 30:1-13)。然而,仍然不知道受D114阻断直接影响的是DC发育的哪个特定阶段。为了回答此问题，用5或2511^/1^抗0114 Ab (REGN577) (n=5)或人Fe片段(对照)(n=5)皮下注射6周龄C57B1/6小鼠(Jackson Labs), I周2次持续2周。基于公布的序列(W0 2007/143689)自制REGN577。REGN 577结合人和小鼠D114，但检测不到其结合人Dlll和JAG1。注射后14天收获胸腺和脾，并在补充10%胎牛血清(FCS)和包含胶原酶D (SigmaAldrich)的完全RPMI 1640培养基(Invitrogen)中在37° C下消化30分钟。为终止反应，加入2mM EDTA，使器官悬浮物通过70-mm细胞过滤器。通过在补充10% FCS的完全RPMI1640培养基冲洗股骨和胫骨从每只小鼠收集骨髓(BM)，并在RPMI培养基中重悬细胞。在用上述针对特定标记物的抗体染色细胞后，通过流式细胞术评估T细胞、B细胞和DC亚群。在BD LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上操作染色的细胞，和使用FlowJo软件(版本 8. 8. 6; Tree Star Inc.)分析数据。
图IA和IB显示了胸腺中的T和B细胞群。如在图IA中显示，D114阻断诱发胸腺内双阴性(“DN” ；CD4TD8_)T细胞数的显著增加和双阳性(“DP” ；OT4+CD8+)T细胞数的减少。另外，相同的处理诱发胸腺内B细胞的异位出现，所述B细胞来源于原T细胞(即，处于DNl阶段的CD44+CD25XD4XD8-细胞)(见图1B)。相反地，D114阻断对骨髓中(图2A)或外周脾B细胞亚群中(图2B)的B细胞发育没有影响。此外，D114阻断诱发胸腺中常规DC( “cDC” ;B220_CDllc+)和浆细胞样 DC( “pDC” ;PDCA1+B220+CD11C+)的扩增(图 3A)，在初次注射D114Ab后第7天(p < O. 001)开始显著扩增直至第14天(p < O. 001)，并继续扩增直至第21天(P < O. 01)(图3B)。在图3A的点图中的数字代表在第14天时DC在总细胞中的平均百分比。此外，DC在用D114Ab(REGN577)处理的小鼠外周中扩增。在表I中显示了相比对照小鼠(hFc处理)，用D114Ab处理后脾中DC的百分比和绝对数的增长倍数。
表 I___
執次注射后的
百分_长倍数錄对数增长倍数 天数___
3__LO__LJ_
71,1I· I
14L 62.0
21__L3__L7_已经知道，淋巴样组织cDC，pDC和单核细胞共有被称为“巨噬细胞和DC前体”或“MDP”的共同祖细胞，其可通过其表面表型“Lin_cKithiCD115+FLT3+”鉴定，而具有“ LirTcKi t1()⑶115+FLT3+ ”表型的被称为“共同DC前体”或“⑶P ”的另一种祖细胞仅能产生cDC和pDC。尽管单核细胞在炎症条件下可产生许多DC的表型特征，cDC，pDC和单核细胞系在它们到达组织时分开，单核细胞和PDC在稳定状态条件下都不发育为cDC。与单核细胞和PDC不同，认为在淋巴样组织中的cDC以不成熟的细胞形式来源于骨髓，必须在淋巴样器官中进一步分化和分裂。DC前体细胞(MHcnlTDllcintOTlSS+Sirp-Ciint)和晚期DC前体细胞(MHCnkCDllcint),是来源于骨髓的cDC的主要前体(Liu等人，2009，Science324:392-397)。为了鉴定D114 Ab对DC祖细胞体内平衡有何影响，通过流式细胞术评估了胸腺、骨髓和脾中的MDP和CDP水平。仅在骨髓中检测到MDP和CDP，而在胸腺和脾中都没有检测到(数据未显示)。此外，相比对照处理的小鼠，D114阻断不诱发骨髓中早期祖细胞的扩增。因此，结果表明D114 Ab可在MDP和⑶P之后的DC发育阶段起作用，S卩，DC前体细胞阶段。因此，使用流式细胞术研究了胸腺和骨髓中的DC前体细胞和晚期DC前体细胞。如在图3C中所示，通常存在于骨髓中的MHCn1t5CDllcintDC仅在Dl 14Ab处理(P
<O. 001) 14天后在胸腺中扩增，而在同一小鼠的BM中没有检测到MHCn1t5CDllcint DC的扩增(数据未显示)。因此，源自DC前体细胞阶段的DC扩增仅限于胸腺。为了评估胸腺中MHCnlTDllcintDC的来源，进行流式细胞术以鉴定DNl (⑶4TD8XD44+⑶250原T细胞群中的MHCII10CDlIcintDC0如在图3D中所示，在D114阻断后第3天检测到DNl原T细胞群内的MHCn10CDllcintDC。未用D114 Ab处理，以及在用D114 Ab处理后的DN2，DN3和DN4 T细胞群中没有检测到1此111°^11(^1((数据未显示)。在用D114Ab处理后，没有观察到外周DC体内平衡的变化(数据未显示)。因此，D114阻断在第3天诱发胸腺中的DNl原T细胞群内的MHCII10CDlIcintDC的显著扩增(p < O. 01)(图3D)，在第14天扩增达到顶峰(p
<0. 001)(数据未显示)。同时，如上所述，胸腺中的成熟DC亚群从第7天(P < O. 001)扩增至第21天(P < O. 01)(见图3B)。为了研究DC扩增是否源自未定向的T细胞前体，将DNl⑶45. I+LirT分选细胞转移至用抗D114 Ab处理的⑶45. 2+宿主小鼠的胸腺内。发现，⑶45. 1+细胞在DNl阶段积累(数据未显示)，并在胸腺中检测到未成熟DC(imDC)及其扩增(图4) (ρ〈0· 01)。在对照Ab处理的小鼠中没有检测到细胞，可能是因为大多数DNl转移细胞被T细胞阴性选择排除。结论是，D114阻断促进胸腺内源自T/DC DNl共同祖细胞的胸腺内可变DC系的发育。fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3_L)对骨髓祖细胞发育为DC和外周DC的发育是充分和必要的。Flt3-L的血清水平在用抗D114Ab处理的WT动物中没有变化(数据未显示)。此外，如在下表2和3中所示，相比用对照Ab处理的小鼠，胸腺中的DC百分比在均用D114 Ab处理过的野生型小鼠(WT)(表2和3)，FLt3_L敲除小鼠(FU3-L+) (ρ〈0· 05)(表2)，和Flt3-R敲除小鼠(FU3-R+) (p〈0.001)(表3)中扩增。因此，D114阻断诱发了胸腺中不依赖于Flt3的DC扩增。
表权利要求
1.一种S样配体4(D114)拮抗剂，用于预防、治疗或减轻疾病或紊乱，其中增加调节T (Treg)细胞数是有益的，其中所述拮抗剂阻断Dl 14和Notch受体之间的相互作用，从而增加Treg细胞数和预防、治疗或减轻疾病或紊乱。
2.一种预防、治疗或减轻疾病或紊乱的方法，其中增加调节T(Treg)细胞数是有益的，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的δ样配体4(D114)拮抗剂，其中所述拮抗剂阻断Dl 14和Notch受体之间的相互作用，从而增加Treg细胞数和预防、治疗或减轻疾病或紊乱。
3.权利要求I的D114拮抗剂或权利要求2的方法，其中所述疾病或紊乱是自身免疫疾病。
4.权利要求I至3中任一项的Dl14拮抗剂或方法，其中所述疾病或紊乱选自多发性硬化症，类风湿性关节炎，克罗恩氏病，肺出血肾炎综合征，格雷夫斯氏病，格林-巴利综合征(GBS)，桥本病，特发性血小板减少性紫癜，肠易激综合征，红斑狼疮，混合性结缔组织病，重症肌无力，发作性睡病，寻常天疱疮，恶性贫血，多肌炎，原发性胆汁性肝硬化，干燥综合征，溃疡性结肠炎，血管炎，和韦格纳肉芽肿。
5.权利要求I至4中任一项的D114拮抗剂或方法，其中所述疾病或紊乱是多发性硬化症。
6.前述权利要求中任一项的D114拮抗剂或方法，其中所述D114拮抗剂是特异性结合人D114(hD114)并阻断Dl 14-Notch信号途径的抗体或其片段，或包含与人IgG的Fe结构域融合的Dl 14的细胞外结构域或其片段的融合蛋白。
7.前述权利要求中任一项的D114拮抗剂或方法，其中所述D114拮抗剂是特异性结合人D114(hD114)并阻断Dl 14-Notch信号途径的抗体或其片段，并包含重链可变区(HCVR)，其分别包含SEQ ID NO: 22，24和26的重链CDR1，CDR2和CDR3序列，和轻链可变区(LCVR)，其分别包含SEQ ID NO: 30, 32和34的轻链CDRl, CDR2和CDR3序列。
8.权利要求7的D114拮抗剂或方法，其中所述抗体或其片段包含SEQIDNO: 20或SEQID NO: 116 的 HCVR 序列。
9.权利要求7的D114拮抗剂或方法，其中所述抗体或其片段包含SEQIDNO: 28或SEQID NO: 118 的 LCVR 序列。
10.权利要求7至9中任一项的D114拮抗剂或方法，其中所述抗体或其片段包含SEQID NO: 20/28 或 116/118 的 HCVR/LCVR 组合。
11.权利要求I和3至10中任一项的D114拮抗剂，其与至少一种选自降血糖剂，免疫抑制剂，抗炎剂，和镇痛剂的另外的治疗剂组合。
12.权利要求11的D114拮抗剂，其中所述另外的治疗剂是选自胰岛素及其类似物，糖皮质激素，环孢菌素，甲氨蝶呤，非甾体抗炎药(NSAID)，TNF-α拮抗剂，IL-I拮抗剂，IL-6拮抗剂，和阿片样物质的至少一种。
13.权利要求2至10中任一项的方法，还包括共同施用治疗有效量的至少一种选自降血糖剂，免疫抑制剂，抗炎剂，和镇痛剂的另外的治疗剂。
14.权利要求13的方法，其中所述另外的治疗剂是选自胰岛素或其类似物，糖皮质激素，环孢菌素，甲氨蝶呤，非甾体抗炎药(NSAID)，TNF-α拮抗剂，IL-I拮抗剂，IL_6拮抗剂，和阿片样物质的至少一种。
15.权利要求11至14中任一项的D114拮抗剂或方法，其中所述D114拮抗剂和至少一种另外的治疗剂用于同时或相继施用。
16.如在权利要求1，6-12和15中任一项定义的δ样配体4(D114)拮抗剂在预防、治疗或减轻如在权利要求I和3-5中任一项定义的疾病或紊乱中的用途。
17.δ样配体4(D114)拮抗剂在制备用于预防、治疗或减轻疾病或紊乱的药物中的用途，其中增加调节T(Treg)细胞数是有益的，其中所述拮抗剂阻断D114和Notch受体之间的相互作用，从而增加Treg细胞数和预防、治疗或减轻疾病或紊乱。
18.权利要求17的用途，其中所述疾病或紊乱是自身免疫疾病。
19.权利要求17或18的用途，其中所述疾病或紊乱选自多发性硬化症，类风湿性关节炎，克罗恩氏病，肺出血肾炎综合征，格雷夫斯氏病，格林-巴利综合征(GBS)，桥本病，特发性血小板减少性紫癜，肠易激综合征，红斑狼疮，混合性结缔组织病，重症肌无力，发作性睡病，寻常天疱疮，恶性贫血，多肌炎，原发性胆汁性肝硬化，干燥综合征，溃疡性结肠炎，血管炎，和韦格纳肉芽肿。
20.权利要求17至19中任一项的用途，其中所述疾病或紊乱是多发性硬化症。
21.权利要求17至20中任一项的用途，其中所述D114拮抗剂是特异性结合人D114(hD114)并阻断Dl 14-Notch信号途径的抗体或其片段，或包含与人IgG的Fe结构域融合的Dl 14的细胞外结构域或其片段的融合蛋白。
22.权利要求17至21中任一项的用途，其中所述D114拮抗剂是特异性结合人D114(hD114)并阻断D114-Notch信号途径的抗体或其片段，并包含重链可变区(HCVR)，其分别包含SEQ ID NO: 22, 24和26的重链CDRl, CDR2和CDR3序列，和轻链可变区(LCVR)，其分别包含SEQ ID NO: 30, 32和34的轻链CDRl, CDR2和CDR3序列。
23.权利要求22的用途，其中所述抗体或其片段包含SEQID NO: 20或SEQ ID NO: 116的HCVR序列。
24.权利要求22的用途，其中所述抗体或其片段包含SEQID NO: 28或SEQ ID NO: 118的LCVR序列。
25.权利要求22至24中任一项的用途，其中所述抗体或其片段包含SEQIDNO:20/28或 116/118 的 HCVR/LCVR 组合。
全文摘要
本发明提供了治疗疾病或紊乱的方法，其中增加调节T细胞(Treg)数是有益的，通过对患有这样的疾病或紊乱的受试者施用治疗有效量的阻断DLL4-Notch信号途径的DLL4拮抗剂，从而增加Treg细胞数。本发明的方法可治疗的疾病或紊乱包括自身免疫疾病或紊乱，例如多发性硬化症(MS)，糖尿病,等等。合适的用于本发明的Dll4拮抗剂包括特异性结合DLL4和阻断DLL4-Notch相互作用的抗体或抗体片段，DLL4的细胞外结构域,等等。本发明还提供了在具有患上这样的疾病或紊乱的倾向、或容易患上这样的疾病或紊乱的受试者中预防这样的疾病或紊乱发生或复发的方法。此外，本发明的方法可用于预防或治疗器官移植排斥或移植物抗宿主病。
文档编号C07K16/22GK102884081SQ201180016551
公开日2013年1月16日 申请日期2011年1月28日 优先权日2010年1月29日
发明者D·斯科克斯 申请人:瑞泽恩制药公司